專利名稱：花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶β亞基基因及其編碼的蛋白質(zhì)與克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶P亞 基基因及其編碼的蛋白質(zhì)與克隆方法。
背景技術(shù)：
乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase, ACCase)屬于生物素包含酶，它在生物 體內(nèi)催化乙酰輔酶A羧化形成丙二酰輔酶A，為脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物的合成提供底物 (Konishi T， Shinohara K， Yamada K. Acetyl-CoA carboxylase in higher plants: most plants other than gramineae have both the prokaryotic and the eukaryotic forms of this enzyme[J]. Plant Cell Physiol, 1996, 37(1): 17-122.)。生物體中ACCase有2種 類型。 一種ACCase稱為同質(zhì)型(Homomeric)，亦稱多功能或真核型，存在于動(dòng)物、酵母、藻 類及植物的胞質(zhì)溶膠中，具有一個(gè)相對(duì)分子量為220 260的生物素包含亞基。另一種是異質(zhì) 型(Heteromeric)，也稱多亞基或原核型ACCase，存在于細(xì)菌及雙子葉植物和非禾本科單子 葉植物的細(xì)胞質(zhì)中。異質(zhì)型ACCase包含4個(gè)亞基，即生物素羧化酶(Biotin carboxylase, BC)、生物素羧基載體蛋白(Biotin carboxyl Carrier Protein, BCCP)以及羧基轉(zhuǎn)移酶的 2個(gè)亞基a -CT和0 -CT，其中前2個(gè)亞基組成BC和BCCP域，后2個(gè)亞基構(gòu)成CT催化域。 這四個(gè)亞基中CTP較為特殊，它是由葉綠體基因組中的基因編碼的(謝祿山，譚曉風(fēng).乙酰 輔酶A羧化酶基因研究綜述[J].中南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005， 25(4): 89-95.)。而在禾本科植物 中，該基因或者已被短截，僅殘存一個(gè)短的C端區(qū)域，如水稻，或者完全缺失，如小麥。目 前己從擬南芥、煙草、豌豆、油菜、大豆、馬鈴薯等多種植物中獲得P-CT基因(Ji nshanK， Tuan-nan Wen. Coordinate regulation of the nuclear and plastidicgenes coding for the subunits of the heteromeric acetyl-coenzyme a carboxylase l[J]. Plant Physiology, 2000， 122: 1057-1071; Sang Sook Lee， Won Joong Jeong. Characterization of the plastid-encoded carboxyltransferase subunit (accD) gene of potato[J]. Cell, 2004， 117: 422-429.)。但花生中尚沒有此基因的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶P亞
基基因及其編碼的蛋白質(zhì)與克隆方法。使該基因在花生中獲得高表達(dá)，以改良花生的品質(zhì)。本發(fā)明的花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶0亞基基因，其序列由SEQ ID NO. 1中從 核苷酸第92 — 1570位的核苷酸序列構(gòu)成。所述基因來自花生C4rac力^ Zy77o《sea)，命名為 爿力C7^基因。
本發(fā)明第二個(gè)目的是提供所述基因編碼的蛋白質(zhì)，其具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的 氨基酸序列。所述蛋白質(zhì)命名為^/CT^蛋白質(zhì)
同時(shí)，本發(fā)明還提供所述基因的克隆方法，包括如下步驟
(1) 提取花生葉片中的總RNA;
(2) 以獲得的總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成5，-和3， -RACE-Ready cDNA;
(3) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST信息設(shè)計(jì)5'和3'端cDNA片段引物
(4) 利用SMARTTM RACE Amplification Kit (Clontech)擴(kuò)增乙酰輔酶A羧化酶羧基 轉(zhuǎn)移酶e亞基基因5'和3'端基因片段，并將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后篩選陽性克隆；
(5) 對(duì)篩選到的陽性克隆進(jìn)行序列分析，獲得花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶P亞基 基因片段；
(6) 將測(cè)得的花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶e亞基基因片段序列及5'和3'端序 列進(jìn)行拼接后得到花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶e亞基全長(zhǎng)基因序列；
(7) 根據(jù)拼接得到的全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增引物并進(jìn)行擴(kuò)增；
(8) 將擴(kuò)增后的產(chǎn)物篩選陽性克隆，對(duì)篩選到的陽性克隆進(jìn)行序列分析，獲得花生乙酰 輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶0亞基基因的全長(zhǎng)基因。
乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶3亞基是II類ACCase多肽復(fù)合物的一個(gè)亞基。該酶活性 的提高可以增強(qiáng)II類ACCase復(fù)合物的裝配，有利于提高花生種子的含油量。本發(fā)明公開的花 生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶P亞基U力CT")基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白序列以 及基因克隆方法，可廣泛應(yīng)用于花生品質(zhì)的改良、花生的栽培和培養(yǎng)，尤其是花生作為油料 作物的開發(fā)和利用等領(lǐng)域。


圖1是本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域示意圖； 圖2是本發(fā)明的蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
實(shí)施例1克隆花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶P亞基(A^T")基因(1) 選用E12花生葉片作為實(shí)驗(yàn)材料，采用Pbiozol植物組織RNA提取試劑盒提取花生 葉片中的總RNA。 RNA含量及質(zhì)量可采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
(2) 以獲得的總RNA為模板，采用SMARTTM RACE Amplification Kit (Clontech)，反 轉(zhuǎn)錄合成5'-和3， -RACE-Ready cDNA。
(3) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST信息設(shè)計(jì)5，和3，端cDNA片段引物 GSP1: 5，- CCCGTTTAGTTGACCTGTGCCTGTTT -3'
GSP2: 5' - CATCTCCTACTACTGGGGGGGTGAC -3'
(4) 利用SMARTTM RACE Amplification Kit (Clontech)擴(kuò)增乙酰輔酶A羧化酶羧基 轉(zhuǎn)移酶e亞基基因5'和3'端基因片段，并將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后與pMD18-T simple vector
(Takara)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡ c^i Top IO感受態(tài)細(xì)胞，采用藍(lán)白斑法篩選陽性克隆。
(5) 篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證后測(cè)序，獲得花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶 P亞基基因片段。
(6) 將測(cè)得的花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶0亞基基因片段序列及5'和3'端序 列進(jìn)行拼接后得到花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶P亞基全長(zhǎng)基因序列；
(7) 根據(jù)拼接得到的全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增引物并進(jìn)行擴(kuò)增，其中，引物為 BCT-5: 5'- TGGTAATAGAGGAAAAACTC -3'
BCT-3: 5'- AATCTTTTAAGTTCTGCTAAAT -3'
擴(kuò)增反應(yīng)如下94。C預(yù)變性3min， 94'C變性30s， 50。C復(fù)性30s， 72。C延伸lmin， 30個(gè) 循環(huán)后，72 °C 10min;
(8) 將擴(kuò)增后的產(chǎn)物篩選陽性克隆，對(duì)篩選到的陽性克隆進(jìn)行序列分析，獲得花生乙酰 輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶0亞基基因的全長(zhǎng)基因。
實(shí)施例2屈CT"蛋白質(zhì)的序列信息與特性分析
本發(fā)明的力力C7^基因長(zhǎng)1636bp，其開放閱讀框?yàn)?479bp，位于92-1570bp處。BioXM 軟件分析表明J力C7"共編碼492個(gè)氨基酸。根據(jù)PR0SITE數(shù)據(jù)庫分析花生力力CT"基因編碼 的492個(gè)氨基酸，發(fā)現(xiàn)此序列含一個(gè)CTe活性位點(diǎn)，位于250-469aa，如圖l所示。用Protparam 預(yù)測(cè)編碼蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)，推測(cè)分子式為C2464H3796N6M0775S27，分子量為55846.7，等電點(diǎn)為 5.14，理論推導(dǎo)半衰期為30h，不穩(wěn)定參數(shù)是48.68，屬于不穩(wěn)定蛋白。該蛋白中含量相對(duì)較 多的氨基酸是Ser (11.8%), Gly (7.1%), Glu (7.5%)， Leu (8.5%), Asn (6.9%);該蛋白 中不含Pyl和Sec。總的帶正電荷的殘基為(Arg + Lys) : 47;總的帶負(fù)電荷的殘基為(Asp + Glu) :64。該蛋白親水性平均數(shù)為-0. 446，預(yù)測(cè)該蛋白為疏水性蛋白。采用SigrmlP 3. 0 Server進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，表明該蛋白不含信號(hào)肽序列，為非分泌性蛋白。以Tmpred網(wǎng)站為基礎(chǔ)的跨 膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明該蛋白含3個(gè)跨膜信號(hào)區(qū)。
采用在線HNN網(wǎng)站預(yù)測(cè)花生AhCTP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，表明該蛋白含有29.47%的a-螺 旋，18.90%的e-折疊以及51.63%的無規(guī)則巻曲。利用3D-JIGSAW預(yù)測(cè)花生AhCT e蛋白三級(jí) 結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該蛋白呈緊密的球狀結(jié)構(gòu)，如圖2所示。
本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下: (l)SEQ ID NO. 1的信息
(i) 序列特征
(A) 長(zhǎng)度:1636bp
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii) 分子類型核苷酸
(iii) 序列描述SEQ ID NO. 1
(2)SEQ ID NO. 2的信息
(i) 序列特征:
(A) 長(zhǎng)度:492 aa
(B) 類型氨基酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii) 分子類型蛋白質(zhì)
(iii)序列描述:SEQ ID NO. 2序列表
〈110〉山東省花生研究所
〈120>花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶P亞基基因及其編碼的蛋白質(zhì)與克隆方法
〈歸 2
<170> Patentln version 3.3
<210〉 1
〈211〉 1636
〈212〉 腿
〈213> 花生(Arachis hypogaea)
〈220>
<221> CDS
<222〉 (92).. (1570)
<400> 1
acgcggggaa tattctatat ttatgtttaa tgatttttct tcgaatgact attcatctat 60
tgtattttaa tggtaataga ggaaaaactc t atg gaa aaa ggg tgg ttc aat 112
Met Glu Lys Gly Trp Phe Asn 1 5
tct. atg Ser Met
ctg Leu 10
ttt Phe
tat Tyr
agg Arg
cag Gin
tta Leu 15
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tac Tyr
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tgt Cys
ggg Gly 20
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160
tea atg Ser Met 25
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￡tgt Ser
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3gt Ser 35
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Ala
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g幼 Glu
gac Asp
208
cc3 3tt ttg 3tt gst 3tg g朋肪a gsc ttt cct age tgg朋t gat 3gt 256 Pro lie Leu lie Asp Met Glu Lys Asp Phe Pro Ser Trp Asn Asp Ser 40 45 50 55
gac sat Asp Asn
tct Ser
灘t Ser
tac Tyr 60
agt Ser
幼t Asn
gtt Val
g￡lt
Asp
tat Tyr 65
tta Leu
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ggt Gly
gtc Val
agg Arg 70
aac Asn
304
att aga aat ttc eta tct gat aaa att ctt tta gtt agg gat aac aat 352 lie Arg Asn Phe Leu Ser Asp Lys lie Leu Leu Val Arg Asp Asn Asn 75 80 85age cga agg aac cgt tat tec ata tat ttt gat att gaa aat caa ttt 400 Ser Arg Arg Asn Arg Tyr Ser lie Tyr Phe Asp lie Glu Asn Gin Phe 90 95 100
ttg gag att tct aat gat cct tct ttt eta agt gaa cca gaa agt ctt 448 Leu Glu lie Ser Asn Asp Pro Ser Phe Leu Ser Glu Pro Glu Ser Leu 105 110 115
ttt gat agt tat aat aag aat tct age tat ctg犯t犯t gtc tct犯g 496 Phe Asp Ser Tyr Asn Lys Asn Ser Ser Tyr Leu Asn Asn Val Ser Lys 120 125 130 135
aga cac gag aat cat tac atg tat gat act aaa teg agt tgg aaa aat 544 Arg His Glu Asn His Tyr Met Tyr Asp Thr Lys Ser Ser Trp Lys Asn 140 145 150
ggc att cat犯t tgc att gaa agt tat ctt cgt tct caa ate tgt att 592 Gly lie His Asn Cys lie Glu Ser Tyr Leu Ai'g Ser Gin工le Cys lie 155 160 165
gtt agt cac att tta ggt gaa agt gat aaa tac ast gac agt tac ttt 640 Val Ser His lie Leu Gly Glu Ser Asp Lys Tyr Asn Asp Ser Tyr Phe 170 175 180
tat act tct att tgt ggt gag ggc gga aat agt agt gaa age gag ggt 688 Tyr Thr Ser lie Cys Gly Glu Gly Gly Asn Ser Ser Glu Ser Glu Gly 185 190 195
tct tec ata aaa aca act ate acg aat gag aat tta act aaa aga> gag 736 Ser Ser lie Lys Thr Thr lie Thr Asn Glu Asn Leu Thr Lys Arg Glu 200 205 210 215
gat tct aaa gat etc gat gaa act caa aaa tac aag cat tta tgg att 784 Asp Ser Lys Asp Leu Asp Glu Thr Gin Lys Tyr Lys His Leu Trp lie 220 225 230
gaa tgc gaa aat tgt tat gga tta aat tat agg ttt ttt aaa tea 832 Glu Cys Glu Asn Cys Tyr Gly Leu Asn Tyr Arg Lys Phe Phe Lys Ser 235 240 245
aaa atg aat att tgt gaa cac tgt gga tat cat ttg aaa stg age agt 880 Lys Met Asn lie Cys Glu His Cys Gly Tyr His Leu Lys Met Ser Ser 250 255 260
tea gat aga ate gaa ctt ttg att gat cca ggt act tgg aat cct atg 928Ser Asp Arg lie Glu Leu Leu lie Asp Pro Gly Thr Trp Asn Pro Met 265 270 275
gat gaa gac atg gtc tct atg gat ccc att gaa ttt cat teg gaa gag 976 Asp Glu Asp Met Val Ser Met Asp Pro lie Glu Phe His Ser Glu Glu 280 285 290 295
gaa tec gaa tec tat aag aat cgt atg gac tct tat caa aga肪g aca 1024 Glu Ser Glu Ser Tyr Lys Asn Arg Met Asp Ser Tyr Gin Arg Lys Thr 300 305 310
gga tta act gag get gtt caa aca ggc aca ggt caa eta aac ggg att 1072 Gly Leu Thr Glu Ala Val Gin Thr Gly Thr Gly Gin Leu Asn Gly lie 315 320 325
cct gta gca att ggg ate atg ggt ttt cag ttt atg ggg ggt agt atg 1120 Pro Val Ala lie Gly lie Met Gly Phe Gin Phe Met Gly Gly Ser Met 330 335 340
gga tct gta gta ggc gag aaa ata acc cgt ttg gtc gaa cat get ggc 1168 Gly Ser Val Val Gly Glu Lys lie Thr Arg Leu Val Glu His Ala Gly 345 350 355
aat caa ctt tta cct ctt att eta gta tgt gcg lxc gga gga gca cgt 1216 Asn Gin Leu Leu Pro Leu lie Leu Val Cys Ala Ser Gly Gly Ala Arg 360 365 370 375
atg caa gaa gga agt ctg age ttg atg caa atg get aaa ata tct. tct 1264 Met Gin Glu Gly Ser Leu Ser Leu Met Gin Met Ala Lys lie Ser Ser 380 385 390
get tta tat gag tat caa aaa aat aaa agg tta ttc tat gta tec ate 1312 Ala Leu Tyr Glu Tyr Gin Lys Asn Lys Arg Leu Phe Tyr Val Ser lie 395 400 405
ctt aca tct cct act act ggg ggg gtg acc gcc agt ttc ggc atg ttg 1360 Leu Thr Ser Pro Thr Thr Gly Gly Val Thr Ala Ser Phe Gly Met Leu 410 415 420
ggc gat ate att att gcc gaa ccc gat get tac att gca ttt gcg ggt 1408 Gly Asp lie lie丄丄e Ala Glu Pro Asp Ala Tyr lie Ala Phe Ala Gly 425 430 435
aaa aga gta att gaa caa acg ttg aat acg aca ats ccc gaa ggt tea 1456 Lys Arg Val lie Glu Gin Thr I>eu Asn Thr Thr lie Pro Glu Gly Ser 440 445 450 455caa gta get gaa tat tta ttc caa aag ggc tta ttt gat tea ate gta 1504 Gin Val Ala Glu Tyr Leu Phe Gin Lys Gly Leu Phe Asp Ser lie Val 柳 465 470
ccg cgt aat cct tta aaa ggg gtt tta agt gag tta ttt cag etc cat 1552 Pro Arg Asn Pro Leu Lys Gly Val Leu Ser Glu Leu Phe Gin Leu His 475 480 485
get ttc ttc cct ttg tga aaaatttagc ageiacttaaa agattttttt Ala Phe Phe Pro iLeu 490
ttctttttcc 3朋a^肪犯3 3幼aaaa333 aaaa朋
<210〉 2
〈211〉 492
<212> PRT
〈213〉 花生
〈400> 2
(Arachis hypogaea)
Met Glu Lys Gly Trp Phe Asn Ser Met Leu Phe Tyr Arg Gin Leu Lys
1
5 10
15
Tyr Arg Cys Gly Leu Ser Asn Ser Met Asp Ser Phe Gly Pro Val Glu
20 25
30
Asn Thr Ser Ala Ser Glu Asp Pro lie Leu lie Asp Met Glu Lys Asp
35
40 45
Phe Pro Ser Trp Asn Asp Ser Asp Asn Ser Ser Tyr Ser Asn Val Asp
50
55 60
Tyr Leu Val Gly Val Arg Asn lie Arg Asn Phe Leu Ser Asp Lys lie
65
70 75
80
Leu Leu Val Arg Asp Asn Asn Ser Arg Arg Asn Arg Tyr Ser lie Tyr
85 90
95
1600
1636Phe Asp lie Glu Asn Gin Phe Leu Glu lie Ser Asn Asp Pro Ser Phe 100 105 110
Leu Ser Glu Pro Glu Ser Leu Phe Asp Ser Tyr Asn Lys Asn Ser Ser 115 120 125
Tyr Leu Asn Asn Val Ser Lys Arg His Glu Asn His Tyr Met Tyr Asp 130 135 140
Thr Lys Ser Ser Trp Lys Asn Gly lie His Asn Cys lie Glu Ser Tyr 145 150 155 160
Leu Arg Ser Gin lie Cys lie Val Ser His lie Leu Gly Glu Ser Asp 165 170 175
Lys Tyr Asn Asp Ser Tyr Phe Tyr Thr Ser lie Cys Gly Glu Gly Gly 180 185 190
Asn Ser Ser Glu Ser Glu Gly Ser Ser lie Lys Thr Thr lie Thr Asn 195 200 205
Glu Asn Leu Thr Lys Arg Glu Asp Ser Lys Asp Leu Asp Glu Thr Gin 210 215 220
Lys Tyr Lys His Leu Trp lie Glu Cys Glu Asn Cys Tyr Gly Leu Asn 225 230 235 240
Tyr Arg Lys Phe Phe Lys Ser Lys Met Asn lie Cys Glu His Cys Gly 245 250 255
Tyr His Leu Lys Met Ser Ser Ser Asp Arg lie Glu Leu Leu lie Asp 260 265 270
Pro Gly Thr Trp Asn Pro Met Asp Glu Asp Met Val Ser Met Asp Pro
11275
280
285
lie Glu Phe His Ser Glu Glu Glu Ser Glu Ser Tyr Lys Asn Arg Met 290 295 300
Asp Ser Tyr Gin Arg Lys Thr Gly Leu Thr Glu Ala Val Gin Thr Gly 305 310 315 320
Thr Gly Gin Leu Asn Gly lie Pro Val Ala lie Gly lie Met Gly Phe 325 330 335
Gin Phe Met Gly Gly Ser Met Gly Ser Val Val Gly Glu Lys lie Thr 340 345 350
Arg Leu Val Glu His Ala Gly Asn Gin Leu Leu Pro Leu lie Leu Val 355 360 365
Cys Ala Ser Gly Gly Ala Arg Met Gin Glu Gly Ser Leu Ser Leu Met 370 375 380
Gin Met Ala Lys lie Ser Ser Ala Leu Tyr Glu Tyr Gin Lys Asn Lys 385 390 395 400
Arg Leu Phe Tyr Val Ser lie Leu Thr Ser Pro Thr Thr Gly Gly VaJ 405 410 415
Thr Ala Ser Phe Gly Met Leu Gly Asp lie lie lie Ala Glu Pro Asp 420 425 430
Ala Tyr lie Ala Phe Ala Gly Lys Arg Val lie Glu Gin Thr Leu Asn 435 440 445
Thr Thr lie Pro Glu Gly Ser Gin Val Ala Glu Tyr Leu Phe Gin Lys 450 455 460Gly Leu Phe Asp Ser lie Val Pro Arg Asn Pro Leu Lys Gly Val Leu 465 470 475 480
Ser Glu Leu Phe Gin Uu His Ala Phe Phe Pro Leu 485 490
權(quán)利要求
1.一種花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶β亞基基因，其特征在于所述基因序列由SEQ IDNO.1中從核苷酸第92-1570位的核苷酸序列構(gòu)成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的花生乙酰輔酶A羧化酶生物素羧化酶e亞基基因，其特征在于所 述基因編碼的蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3. —種花生乙酰輔酶A羧化酶生物素羧化酶e亞基基因的克隆方法，包括如下步驟(1) 提取花生葉片中的總RNA;(2) 以獲得的總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成5，-和3， -RACE-Ready cDNA;(3) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST信息設(shè)計(jì)5'和3，端cDNA片段引物；(4) 利用SMARTTM RACE Amplification Kit (Clontech)擴(kuò)增乙酰輔酶A羧化酶羧基 轉(zhuǎn)移酶0亞基基因5'和3'端基因片段，并將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后篩選陽性克?。?5) 對(duì)篩選到的陽性克隆進(jìn)行序列分析，獲得花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶e亞基 基因片段；(6) 將測(cè)得的花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶P亞基基因片段序列及5'和3'端序 列進(jìn)行拼接后得到花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶0亞基全長(zhǎng)基因序列；(7) 根據(jù)拼接得到的全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增引物并進(jìn)行擴(kuò)增；(8) 將擴(kuò)增后的產(chǎn)物篩選陽性克隆，對(duì)篩選到的陽性克隆進(jìn)行序列分析，獲得花生乙酰 輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶P亞基基因的全長(zhǎng)基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶β亞基基因及其編碼的蛋白質(zhì)與克隆方法。所述基因序列由SEQ ID No.1中從核苷酸第92-1570位的核苷酸序列構(gòu)成；所述基因編碼的蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明公開的花生乙酰輔酶A羧化酶羧基轉(zhuǎn)移酶β亞基(AhCT β)基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白序列以及基因克隆方法，可廣泛應(yīng)用于花生品質(zhì)的改良、花生的栽培和培養(yǎng)，尤其是花生作為油料作物的開發(fā)和利用等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101550421SQ200910119550
公開日2009年10月7日 申請(qǐng)日期2009年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者和亞男, 曹玉良, 楊慶利, 潘麗娟, 禹山林, 遲曉元 申請(qǐng)人:山東省花生研究所