專利名稱：：對(duì)鱗翅目昆蟲有殺蟲活性的BtcrylAc22基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬微生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，亦屬于生物防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種來自蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因克隆，重組工程菌的構(gòu)建，在宿主細(xì)胞(工程菌)中的誘導(dǎo)表達(dá)，目標(biāo)蛋白的分離純化及其在生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：眾所周知，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis,以下簡(jiǎn)稱Bt)是一種昆蟲病原微生物，其主要的殺蟲活性物質(zhì)稱為殺蟲晶體蛋白(insecticidalcrystalprotein,ICP)，其中可分為晶體蛋白(crystalprotein,Cry蛋白)和細(xì)胞外溶解性蛋白(cytolyticprotein,Cyt蛋白)兩大類，分別由cry基因家族和cyt基因家族編碼。自1981年Schn印f等人首次成功地克隆了一個(gè)編碼Bt殺蟲晶體蛋白基因以來(Schn印fetal.1981)，迄今為止，已分離出400多個(gè)殺蟲晶體蛋白基因序列(Crickmoreetal.2008，http:〃www.lifesci.Sussex,ac.uk/home/Neil—Crickmore/Bt/)。這些基因按其核苷酸序列的同源性已被分為Cryl-Cry55、Cytl、Cyt2共57類，其中Cryl類含有CrylA至CrylL共12類。而CrylAc是CrylAa至CrylAi的一個(gè)基因家族，CrylAc含有共24個(gè)基因型，依次命名為CrylAcl-CrylAc24。在24個(gè)CrylAc中有8個(gè)是中國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的，它們分別是CrylAcl0、CrylAcl3、CrylAcl4、CrylAcl5、CrylAcl6、CrylAc19、CrylAc20、CrylAc22。海南海德熱帶農(nóng)業(yè)資源研究所方宣鈞博士領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)在病死幼蟲中分離出一株高產(chǎn)菱形殺蟲晶體蛋白的Bt菌株W015,通過PCR-RFLP方法鑒定該菌株含有CrylAc基因，采用ReversePCR策略克隆到CrylAc基因的完整的0RF。目前，該基因由國(guó)際Bt殺蟲晶體蛋白命名會(huì)員會(huì)命名為CrylAc22基因，登錄序號(hào)為EU282379(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)。不同種類的cry蛋白不僅殺蟲范圍不同，而且大小也不一樣，大致有三個(gè)區(qū)域范圍129-138KD、65-67KD和25-28KD。典型的cry蛋白為130KD左右，由兩個(gè)部分構(gòu)成,N端的活性片段和C端的結(jié)構(gòu)片段，帶有結(jié)構(gòu)片段的cry被稱為原毒素。它經(jīng)特定蛋白酶的水解作用后，釋放有活性的毒性肽核心片斷(toxincorefragment),然后與敏感昆蟲消化道刷狀緣膜囊(brushbordermemberancevesicles,BBMV)上的受體不可逆特異的高親和結(jié)合，快速插入細(xì)胞質(zhì)膜形成穿孔(pore)或病灶(lesion)。引起細(xì)胞膜非極化，離子梯度的破壞，擾亂了細(xì)胞內(nèi)外正常的跨膜電勢(shì)，及破壞細(xì)胞的酸堿平衡。另外Bt在敏感昆蟲的血腔迅速增值會(huì)導(dǎo)致昆蟲的敗血癥。一般認(rèn)為內(nèi)毒素的作用過程要經(jīng)溶解、酶解活化、與受體結(jié)合、插入和孔洞或離子通道形成等五個(gè)環(huán)節(jié)。CrylAc殺蟲晶體蛋白，一般由11001200個(gè)氨基酸組成，分子量在130140kD之間。C端具有高度的保守性，同源性大于90%,是親水的部分，具有e-折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要用于維持伴胞晶體的形成；N端的差異性較大，同源性在40%90%之間，是疏水的部分，具有a-螺旋結(jié)構(gòu)，是發(fā)揮特異毒力的功能區(qū)域(Chomaetal,1990)。CrylAc蛋白具有3個(gè)結(jié)構(gòu)域:結(jié)構(gòu)域I由1290個(gè)氨基酸構(gòu)成，含有3個(gè)反向平行的a-螺旋；結(jié)構(gòu)域II由291500個(gè)氨基酸組成，含有3個(gè)反向平行的P-折疊,這3個(gè)折疊連接排列形成e-棱柱折疊結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)域ni由5oi644個(gè)氨基酸構(gòu)成，含有2個(gè)反向平行的e-折疊，C端包裹其中(Schn印fetal，1998)。CrylAc晶體蛋白與CrylAa高度同源。Grochuski等用X光衍射分析殺鱗翅目幼蟲的CrylAa的65kD毒性肽(原毒素為133kD),發(fā)現(xiàn)它的結(jié)構(gòu)域組成與Cry3A相似。略有不同的是，其結(jié)構(gòu)域I是由8個(gè)a螺旋組成的，即由7個(gè)兩親的螺旋圍繞一個(gè)位于中央的相對(duì)疏水的螺旋而成；結(jié)構(gòu)域II的片層的突環(huán)2較Cry3A大(Grochuskietal1995)?？赡苷墙Y(jié)構(gòu)上這些細(xì)微的差別決定了它們殺蟲專一性的不同。根據(jù)氨基酸序列的計(jì)算機(jī)模擬表明CrylAc也是由三個(gè)相似的結(jié)構(gòu)域組成的(Powelletal1995)。結(jié)構(gòu)域I位于毒性多肽的N端，由7個(gè)兩親性a-螺旋組成，主要參與在昆蟲中腸上皮細(xì)胞形成孔道。結(jié)構(gòu)域II主要由P-折疊片構(gòu)成，主要功能是調(diào)節(jié)毒性的活性，在不同的毒素中具有不同的功能。結(jié)構(gòu)域III由若干反向平行的具有P構(gòu)象的肽鏈組成。CrylAc殺蟲晶體蛋白的殺蟲作用是毒素與昆蟲中腸細(xì)胞上的專一性受體蛋白相互作用，并在細(xì)胞膜上形成孔道而實(shí)現(xiàn)的。在這一過程中，毒性多肽的不同結(jié)構(gòu)域起著不同的作用。由于毒性多肽與受體蛋白的結(jié)合不是簡(jiǎn)單的一一識(shí)別作用，還表現(xiàn)多樣性和復(fù)雜性。因此很難對(duì)CrylAc毒性多肽結(jié)構(gòu)域的功能做單一的描述。目前進(jìn)行的有關(guān)結(jié)構(gòu)域功能的探索，對(duì)徹底地闡明Bt毒蛋白的作用機(jī)制以及構(gòu)建毒性更高和殺蟲譜更廣的工程菌，都具有十分重要的意義。研究與實(shí)踐證明，對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等500多種昆蟲及線蟲等原生動(dòng)物有毒殺活性(Schn印fetal,1998)。近20年來，編碼這種殺蟲晶體蛋白的基因已經(jīng)成功應(yīng)用于植物基因工程，培育出轉(zhuǎn)基因抗蟲植物，如轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉，并在生產(chǎn)上大規(guī)模的應(yīng)用。在科學(xué)雜忐上的最新報(bào)道表明，轉(zhuǎn)基因Bt抗蟲棉的種植與應(yīng)用是一種新的植物蟲害控制的有效途徑(Wuetal.，2008)。其中多種Cry基因已經(jīng)被ffl于高效廣譜殺蟲工程菌的構(gòu)建和殺蟲轉(zhuǎn)基因植物的培育，尤其CrylAc基因，對(duì)鱗翅目害蟲表現(xiàn)毒力最強(qiáng)，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。美國(guó)孟山都公司成功地將CrylAc基因?qū)朊藁ㄖ晗但@得抗蟲棉新品種，由于其較強(qiáng)的抗蟲性而使目前抗蟲棉的種植面積占整個(gè)棉花種植面積的50%以上；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所郭三堆等人將人工全合成的CrylAc基因成功地導(dǎo)入多個(gè)棉花栽培品種。商品化的工程菌和轉(zhuǎn)基因植物大面積的推廣應(yīng)用，大大減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，減少環(huán)境污染及帶來可觀的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，但同時(shí)也帶來來了新的挑戰(zhàn)，害蟲對(duì)相應(yīng)的殺蟲基因的抗性頻率已呈明顯上升趨勢(shì)，正面臨巨大的抗性風(fēng)險(xiǎn)。解決害蟲對(duì)Bt毒蛋白抗性其中一個(gè)途徑，需要廣泛收集篩選特異的Bt菌株，挖掘分離新型的殺蟲基因作為候選，豐富能夠應(yīng)用的殺蟲基因種類。作者從中國(guó)浙江省杭州市嘉興湖區(qū)蠶農(nóng)收集了大量的病死的蠶樣及死蠶食用過的桑葉，從中分離到一株高產(chǎn)菱形晶體蛋白的Bt菌株，命名為BtW015-1。本發(fā)明利用PCR-RFLP方法鑒定該菌株含有crylAc基因，用ReversePCR方法獲得獲取了crylAc基因全基因序列，該基因蘇云金芽孢桿菌國(guó)際命名委員會(huì)確認(rèn)為一個(gè)新的crylAc基因，命名為crylAc22。crylAc22基因并在大腸桿菌中表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)多種鱗翅目昆蟲有殺蟲活性如家蠶、小菜夜蛾、玉米螟、棉鈴蟲、菜青蟲具有很高的毒殺活性。Bt抑15-i菌株的crylAc22基因克隆為構(gòu)建殺蟲工程菌和培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物提供高毒力的候選基因。本發(fā)明的意義在于從野生的Bt菌株W015-1中分離克隆了殺蟲晶體蛋白基因crylAc22,構(gòu)建了工程菌株，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)小菜蛾等鱗翅目昆蟲有高效殺蟲活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要內(nèi)容是分離和克隆了來自蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因crylAc22，重組工程菌的構(gòu)建，在宿主細(xì)胞(工程菌)中的誘導(dǎo)表達(dá)，目標(biāo)蛋白的分離純化及其在生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白基因crylAc22，具有如下所示序列a)如SQENO:l所示的核苷酸序列；b)與SQENO:1所示的核苷酸序列具有兼并性的核苷酸序列；c)與SQENO:1所示的核苷酸序列有90%以上同源性的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種含有所述基因crylAc22的載體。本發(fā)明還提供一種含有所述基因crylAc22的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種含有所述宿主細(xì)胞的工程菌株HIC22。進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種由SEQNO:l所示的核苷酸序列編碼的蛋白。本發(fā)明還提供一種如上所述的蛋白，其氨基酸序列如SQENO:2所示。本發(fā)明還提供一種制備如上所述的基因crylAc22的方法。本發(fā)明還提供一種制備如上所述的宿主細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供一種制備如上所述的工程菌株的方法。進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種如上所述的基因crylAc22的用途，對(duì)鱗翅目昆蟲有高效殺蟲活性用。本發(fā)明所述的CrylAc22為我國(guó)轉(zhuǎn)基因的發(fā)展提供了重要的基因來源，為生物殺蟲農(nóng)藥及其抗蟲轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物提供了新的基因來源。本次發(fā)明所述CrylAc22所編碼的殺蟲活性蛋白對(duì)鱗翅目害蟲有很強(qiáng)的毒殺活性，可以制成各種生物殺蟲劑，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用和保護(hù)環(huán)境，對(duì)人畜無害，提高作物產(chǎn)量等方面有著很大應(yīng)用前景。圖lBtW015-l中CrylAc22PCR-RFLP圖譜，是通用引物k5un2-k3un2擴(kuò)增產(chǎn)物/Pstl和Xbal酶切結(jié)果，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:Pstl酶切；2:Xbal酶切圖2CrylAc22的擴(kuò)增電泳鑒定，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖3BamHI和SalI酶切鑒定含CrylAc22的重組子；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)圖4pQE30載體BamHl和Sall雙酶切圖；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)圖5pQE30重組質(zhì)粒BamHl酶切鑒定；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)圖6菌落PCR鑒定陽性克??；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖7融合蛋白6xHis-CrylAc22小量誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-聚丙烯酰胺電泳圖；泳道M:蛋白質(zhì)分子標(biāo)記(200,130,97.4,66.2，43kDa);泳道1至6:IPTG誘導(dǎo)O，30，60，卯，120，180分鐘后的裂解液。箭頭所指為表達(dá)的融合蛋白。圖8融合蛋白可溶性鑒定；泳道M:蛋白質(zhì)分子標(biāo)記(200,120，80,66,40kDa);泳道l:未誘導(dǎo)的對(duì)照；泳道2:加入了lmg/ml溶菌酶的粗蛋白裂解液；泳道3:上清液。箭頭所指為表達(dá)的融合蛋白。圖9誘導(dǎo)溫度以及IPTG濃度對(duì)融合蛋白表達(dá)的影響；從左至右，圖l:20°C誘導(dǎo)一個(gè)小時(shí)，IPTG濃度分別為O.1,0.5，lmM。圖2:28°C誘導(dǎo)一個(gè)小時(shí)IPTG濃度分別為O.1，0.5，lmM。圖3:37°C誘導(dǎo)一個(gè)小時(shí)IPTG濃度分別為O.1,0.5，lmM。箭頭所指為表達(dá)的融合蛋白。圖IO重組融合蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)。1，3，6，12小時(shí)后誘導(dǎo)表達(dá)；采用lmMIPTG誘導(dǎo)，獲得誘導(dǎo)后的裂解液，在7.5%的聚丙烯酰胺膠上點(diǎn)樣進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析。泳道M:蛋白質(zhì)分子標(biāo)記(200，120,80,60,40kDa);泳道1至4:IPTG誘導(dǎo)1，3，6，12小時(shí)后的裂解液。箭頭所指為表達(dá)的融合蛋白。圖ll不同轉(zhuǎn)化子12小時(shí)后的誘導(dǎo)表達(dá)；l為空白對(duì)照，2-6為不同轉(zhuǎn)化子12小時(shí)后的誘導(dǎo)表達(dá)，箭頭所指為表達(dá)的6xHis-CrylAc22融合蛋白。圖12融合蛋白的變性大量純化泳道M:蛋白質(zhì)分子標(biāo)記(200,120,80,60，40kDa);泳道l:粗菌液裂解液；泳道2:粗菌液裂解液過柱后的流出液；泳道3:8M尿素洗滌后流出的洗滌液；泳道4至7;采用PH值為5.9的8M尿素洗脫液D洗脫柱子時(shí)分別流出的第一滴、第二滴、第三滴液體，箭頭所指為純化的融合蛋白。圖13噴灑工程菌菜葉飼養(yǎng)的小菜蛾(l號(hào))和未噴灑的對(duì)照(2號(hào))；圖13-l為噴灑了工程菌液和蛋白的小菜夜蛾；圖13-2為未噴灑工程菌液和蛋白的小菜夜蛾。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的技術(shù)方案是，首先通過PCR-RFLP鑒定菌株W015含有crylAc基因，通過反向PCR方法獲得全基因序列。將crylAc22基因采用基因重組技術(shù)克隆到pQE30原核表達(dá)載體上，以構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30-CrylAc22，轉(zhuǎn)化M15宿主菌，獲得一種工程菌(命名為)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出His-tag-CrylAc22融合蛋白，采用Ni2+-NTA樹脂進(jìn)行親和層析可純化出表達(dá)蛋白，SDS-PAGE分析表達(dá)的蛋白分子量為133kDa。利用工程菌或純化的表達(dá)蛋白，對(duì)鱗翅目昆蟲小菜蛾(Plutellaxylostella)具有高活力毒殺作用。具體技術(shù)方法如下1，菌株1中cry基因PCR-RFLP分析總DNA提取參照(BourgouinC.TransferofthetoxinproteingenesofBacillussphaericusintoBacillusthuringiensissubsp.IsraelensisandtheirexpressionEJ].ApplEnvironMicrobiol.1990，56:3403)，以總DNA為模板，用cryl基因鑒定的通用引物K5un2/K3un2和K5un3/K3un3(KuoWS，ChakKF.Identificationofnovelcry—TypegenesformBacillusthuringiensisstrainsonthebasisofrestrictionfragmentlengthpolymorphismofthePCR~amplifiedDNAEJ].A卯lEnvironMicrobiol.1996,62(4):13691377.)擴(kuò)增分別獲得1.6kb和1.4kb左右片段(如圖3所示)，純化PCR片段用現(xiàn)在內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，酶切帶型判斷菌株W015含有crylAc類基囚(如圖4所示)。K5un2引物序列AGGACCAGGATTTACAGGAGGK3un2引物序列GCTGTGACACGAAGGATATAGCCACK5un3引物序列CAATGCGTACCTTACAATTGTTTAAGTAATK3un3引物序列CCTCCTGTAAATCCTGGTCCT2，菌株W015-1中crylAc22基因克隆引物K5un2/K3un2和K5un3/K3un3擴(kuò)增分別獲得1.6kb和1.4kb片段瓊脂糖膠回收純化后(膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根公司)，與克隆載體pMD18TVector(購(gòu)自于大連Takara公司)連接，亞克隆測(cè)序。然后應(yīng)ffl反向PCR技術(shù)(ReversePCR)獲取基因克隆全序列，根據(jù)測(cè)序的兩段PCR序列設(shè)計(jì)反向PCR擴(kuò)增引物crylrs5/crylrs3，提取菌株W015-1質(zhì)粒DNA(該菌株為海南海德熱帶農(nóng)業(yè)資源研究所有限公司室保存，質(zhì)粒DNA可以向公眾提供)，選擇合適現(xiàn)在內(nèi)切酶完全消化〔如圖5所示)，然后用T4DM連接酶連接，連接產(chǎn)物作為反向PCR的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1.6kb的PCK產(chǎn)物(如圖5所示)，同樣亞克隆進(jìn)行測(cè)序然后進(jìn)行序列分析拼接，SEQN01所示，根據(jù)此序列在編碼序列兩段設(shè)計(jì)表達(dá)引物E1A5/E1A3,質(zhì)粒DNA為模板擴(kuò)增出3.5kb片段(如圖7所示)。測(cè)序進(jìn)一步確定基因crylAc22序列，編碼1178個(gè)氨基酸的毒蛋白質(zhì)，如SEQN02所示。crylrs5引物序列TTGCGTTAGCGACAAGGMATcrylrs3引物序列AATGTGCCAGGTACGGGTTCE1A5引物序列CGGGATCCAGAGATGGAGGTAACTTATGE1A3引物序列ACGCGTCGACTGAGACTATTCCTCCATAAG3，重組表達(dá)載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化及鑒定口取載體PQE30進(jìn)行BaraHI、SalI酶切。將經(jīng)酶切后的載體和CrylAc22目的基因按3:1摩爾數(shù)之比加入連接反應(yīng)混合液中，加去離子水至總體積2t)yL，16'C過夜連接反應(yīng)，置于冰上留作轉(zhuǎn)化用。解凍JM109感受態(tài)細(xì)胞，取4ul連接反應(yīng)產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁，使其均勻分布，置冰上30min,42°C熱休克90s,加入LB培養(yǎng)基400ul,37'C水浴振搖，取lOOul轉(zhuǎn)化液鋪于含氨芐青霉素的LB篩選平板上，置37'C過夜培養(yǎng)，煮沸法提取質(zhì)粒后鑒定。PCR擴(kuò)增鑒定:采用擴(kuò)增CrylAc22序列的上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。B柳HI酶切鑒定采用BaraHI酶切重組子，酶切后，應(yīng)出現(xiàn)6900bp的片段。測(cè)序鑒定:將鑒定正確的陽性菌株分裝至1.5mL離心管，送往北京華大中生科技發(fā)展有限公司測(cè)序，測(cè)序采用PQE30通用引物。4，pQE30-CrylAc22轉(zhuǎn)化宿主菌M15和His-tag-CrylAc22融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將表達(dá)質(zhì)粒pQE30-CrylAc22轉(zhuǎn)化M15感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的菌液鋪于含按片青霉素和卡那霉素的的LB篩選平板上，37'C恒溫培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，利用特異引物進(jìn)行菌落PCR，鑒定陽性克隆。挑取陽性單菌落接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，37'C振搖培養(yǎng)過夜,采用新鮮培養(yǎng)基按1:50比例稀釋，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600&0.8吋加入終濃度為1.0mmol/L的IPTG，37。C培養(yǎng)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，間隔半個(gè)小時(shí)收集lml菌液。變性處理菌液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。5，融合蛋白可溶性鑒定及誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化將大量誘導(dǎo)后的菌液4000rZmin20nun離心收集，棄上清液并將樣品于-80'C冷凍2h。加入5ml裂解液(Lysisbuffer)懸浮，再加入至懸浮液為15ml，加入溶菌酶至lmg/ml，冰上振蕩放置30min，取lml裂解液制樣冷凍保存?zhèn)溆?。將裂解液?0000r/min4'C離心40min，取lml上清液制樣，SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白存在形式。在20'C、28'C、37'C三個(gè)不同的溫度條件和0.lmM、0.5mM、l.OmM三個(gè)不同的IPTG濃度條件下誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，獲得工程菌最適誘導(dǎo)溫度和最佳IPTG濃度。6，His-tag-CrylAc22融合蛋白的純化及濃度測(cè)定pQE30作為載體所表達(dá)的基因工程重組蛋白在其N端帶有一個(gè)由6個(gè)組氨酸組成的"標(biāo)簽"(His-tag)，采用Ni2+-NTA樹脂柱進(jìn)行親和層析純化。收集超離后的上清,將其轉(zhuǎn)入裝有M2+-NTA樹脂的層析柱中，上樣完畢后靜置2h,以便6個(gè)組氨酸標(biāo)簽與填料中Ni2+充分結(jié)合。將收集的菌置于冰上15min，加入BufferB重懸菌體；室溫下攪拌菌液15-60min,完全裂解菌體，室溫下10OOOg離心20-30min，收集上清液，同時(shí)取5ul上清液制樣保存進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；加入lml50%的M2+-NTA凝膠至裂解的上清液中，室溫下溫和的振蕩15-60min;將裂解液和凝膠混合物加入到下端封口的凝膠柱中，打開下端蓋子同時(shí)收集流出液，保留進(jìn)行SDS-PAGE電泳；bufferC洗滌柱子，收集洗液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；bufferD洗脫柱子四次，再采用bufferE洗脫柱子四次，收集每次洗脫的液體，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。蛋白濃度測(cè)定采用Bradford法(BradfordMM,1976)進(jìn)行蛋白濃度定量(以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照)。7，殺蟲毒性生物測(cè)定小菜蛾(Plutellaxylostella)幼蟲(二齡幼蟲)由本所飼養(yǎng)。小菜蛾殺蟲活性的測(cè)定采用噴灑法。將甘藍(lán)葉片用水洗凈晾干，選取鮮嫩一致的葉片，噴灑菌液和蛋白液，放入生測(cè)瓶中，放置25'C光照培養(yǎng)箱中，24h，48h，72，96h后分別觀察幼蟲生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)施例實(shí)施例1菌株W015-1的CrylAc基因型分析1)總DNA提取Bt單菌落接種于7mL的LB液體培養(yǎng)基中，30'C，220rpm培養(yǎng)過夜，1%轉(zhuǎn)接于盛有50mL的LB培養(yǎng)基的250mL體積的三角瓶中，30°C,220rpm繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)至0D600=1.02.0;離心收集lOmL菌體，2mLJBuffer(0.1MTrisHC1(pH8.0)、0.1MEDTA(pH8.0)、0.15MNacl)洗滌沉淀；將沉淀輕懸于2mLJBuffer中加入80uL新鮮配制的溶菌酶(50rag/mL)，混勻，37'C溫育45min;再加入15uLRNase(10mg/mL)，50'C作用15min;接著加入200uLSDS(20°/。)，70'C處理20min;緩慢冷卻至37'C，用等體積酚氯仿異戊醇(25:24:1)及氯仿異戊醇(24:1)各抽提一次，再加入等體積異戊醇混勻置一2(TC沉淀上清20rain,12，OOOr即離心10min。70%乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干后溶100uLTEBuffer(lOmMTrisHC1(pH8.0)、lmMEDTA(pH8.0))中，取5uLDNA樣品在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外分析儀檢測(cè)。2)PCR-RFLP鑒定菌株Cry基因50uLPCR反應(yīng)體系，包括提取的總DNAluL為模板，各上下游引物分別為0.2uM，加入dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP混合物)至濃度250uM，5uL的10XPCRbuffer(200mMTris-HCl(pH8.3)，500mMKCl,15or20mMMgC12,0.01%(w/v)gelatin)0.5UTaq酶，補(bǔ)雙蒸水至50uL。反應(yīng)按如下程序進(jìn)入循環(huán)前94°C預(yù)變性5min。然后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)為94'C變性1min;53'C退火lmin;72'C延伸2min。最后在72'C延伸10min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5u1，在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)引物K5un2/K3un2和K5un2/K3un2擴(kuò)增片段分別為1.4kb和1.6kb。然后利用GelExtractionMiniKit純化PCR產(chǎn)物，分別用限制內(nèi)切酶Pstl/Xbal和EcoRI/PstI雙酶切消化引物K5un2/K3un2和K5un2/K3un2擴(kuò)增產(chǎn)物，在2X的瓊脂糖膠分析PCR產(chǎn)物酶切的帶型(如圖l所示)?；驍U(kuò)展片段大小~用Pstl和Xbal酶~擴(kuò)展片段大小用EcoRI和Pstl酶切(K5un2-K3un2)切片段大小(bp)(K5un3-K3un3)片段人小(bp)c/y"<716351,117,5181463726,493,244c廣y"i)15571,039,5181465726;496),244—々1641322,801,5181463726,434,244,59實(shí)施例2crylAc22基因克隆1)W015質(zhì)粒質(zhì)粒DNA提取:離心收集10mL菌體。每10mL菌液加150uLSI(10%蔗糖，50mMTrisCl(pH8.0)，20mMEDTA(pH8.0)Lysozyme20mg/ml,用時(shí)現(xiàn)配)，混勻，37'C水浴3h;加1350uLSII(10mMTrisCl，lmMEDTA，0.085MNaOH,1.ly。SDS用時(shí)現(xiàn)配〉，輕輕混勻，放置l(kin，然后加750uLSIII(5MKAc,用冰乙酸調(diào)至pH4.8)，上下倒置離心管輕輕混勻，冰浴4h以上；12,OOOrpm離心10min，取上清，加入30RNase(10mg/mL)，45°C作用30min,加入1/10體積3MNaAC和2倍體積無水乙醇，-20'C沉30min。12，OOOrpm離心10min，棄上清，沉淀用70%乙醇漂洗。將沉淀在真空千燥器中干燥后用100uL超純水溶解。取5uL質(zhì)粒DNA樣品在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳,EB染色后紫外分析儀檢測(cè)。2)反向PCR:采用3種酶切方案，取1.0-2.Oug質(zhì)粒DNA，分別用NedI，SalI，BglII和NedI/SalI/BglII37'C水浴3h完全消化質(zhì)粒DNA，然后65'C水浴15min使限制性內(nèi)切酶失活。然后分別加入0.5UT4連接酶及ReactionBuffer于4'C反應(yīng)過夜。連接產(chǎn)物直接作為PCR擴(kuò)增模板，10XPCRBuffer5uL，dNTP為0.2鵬o1/LluL,引物Crylrs5/Crylrs3各0.2mmol/L，1單位/ulpfu酶。反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，94'C變性lmin，53'C退火lmin，72'C延伸2ndn，30個(gè)循環(huán)后延伸10min，PCR產(chǎn)物取5uL用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳,EB染色后紫外分析儀檢測(cè)。PCR產(chǎn)物用NedI完全消化驗(yàn)證PCR產(chǎn)物是否正確(如圖2所示)。3)PCK擴(kuò)增片段亞克隆與測(cè)序PCR產(chǎn)物用鼎國(guó)DNAFragmentQuickPurification/RecoverKit回收純化，然后和載體pMD18TEasyVector連接，重組質(zhì)粒導(dǎo)入到用0.lmol/LCaC12誘導(dǎo)的大腸桿菌JM110感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化子在含有A即(100ug/ml)，5-bromo-4-chloro-3-indolyl-P-D-galactopyranoside('X-Gal)(64ug/ml)禾口isopropyl-P-D-thiogalactopyranoside(IPTG)(0.2mM)的LB培養(yǎng)基平板，37'C培養(yǎng)過夜，任意挑取白色菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取重組菌株的質(zhì)粒，選擇相應(yīng)的引物PCR擴(kuò)增和選擇多克隆位點(diǎn)的合適的限制性內(nèi)切酶消化，確定含有目的片段的重組質(zhì)粒，送往北京奧科生物科技有限公司測(cè)序(如圖3所示)。實(shí)施例三工程菌的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)表達(dá)、分離、純化1)pQE30-CrylAc22原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定根據(jù)蘇云金芽孢桿菌CrylAc22的序列設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增CrylAc22的引物，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化后提取重組質(zhì)粒，用BamHI和SalI酶切鑒定，酶切片段為3500bp(如圖3所示)，與預(yù)期大小一致，命名為HIC22(pMD18-T-CrylAc22)。將陽性克隆測(cè)序，測(cè)序后在GenBank進(jìn)行比對(duì)，序列與CrylAc基因型完全相同。將上述獲得的pMD18-T-CrylAc22質(zhì)粒經(jīng)BamHl和Sail雙酶切，用膠回收試劑盒回收目的基因；然后與經(jīng)相同酶切后的原核表達(dá)質(zhì)粒PQE30連接(如圖4所示)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA,用BamHI酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物與預(yù)期大小一致,命名pQE30-CrylAc22。(如圖5所示)。重組質(zhì)粒pQE30-CrylAc22的目的片斷CrylAc22長(zhǎng)約3.5kb，而其載體pQE30的長(zhǎng)度是3.4kb，重組子采用BamHl和Sail進(jìn)行雙酶切的片段非常的接近，電泳難以區(qū)分開來，采用B柳HI進(jìn)行單酶切，獲得一條6,9kb的單帶。2)重組融合蛋白在E.coliM15中表達(dá)提取鑒定正確地原核表達(dá)質(zhì)粒，將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30-CrylAc22轉(zhuǎn)化的E.coliM15感受態(tài)細(xì)胞中，挑取平板上單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定(如圖6所示)，結(jié)果表明重組質(zhì)粒順利的轉(zhuǎn)入到大腸桿菌宿主菌中。挑取一個(gè)鑒定正確的陽性克隆用lmMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，不同時(shí)間收集菌體，采用SDS-PAGE檢測(cè)。由電泳圖譜(如圖5)可見，在轉(zhuǎn)化入pQE30-CrylAc22的菌液的粗蛋白中，發(fā)現(xiàn)一條新的蛋白條帶，分子量約133kDa左右，而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液粗蛋白中未見此條帶。結(jié)果初步表明，重組質(zhì)粒pQE30-CrylAc22在IPTG的誘導(dǎo)下，產(chǎn)生了融合蛋白6xHis-CrylAc22，并得以高效表達(dá)；從表達(dá)趨勢(shì)上看，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，融合蛋白的表達(dá)量逐漸增加(如圖7所示)。113)融合蛋白可溶性鑒定和誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化采用誘導(dǎo)蛋白的活性純化方法對(duì)融合蛋白的可溶性進(jìn)行了鑒定(如圖8所示)。從理論上來推測(cè)，在2rC低溫，低IPTG濃度下誘導(dǎo)時(shí)蛋白的表達(dá)量較少，蛋白主要以可溶性形式存在，換用高溫高濃度誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)蛋白表達(dá)量多，多以包涵體的形式存在，可溶性的蛋白較少，但是由于CrylAc22基因的表達(dá)的蛋白比較的大，序列中半胱氨酸含量也比較的少，這樣給蛋白的折疊帶來了一些困難，表達(dá)的蛋白以包涵體的形式存在。為了獲得表達(dá)量均勻穩(wěn)定的融合蛋白，我們對(duì)融合蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化與篩選(如圖9所示)。誘導(dǎo)表達(dá)溫度實(shí)驗(yàn)了21°C、28。C和37。C三個(gè)具有代表性的溫度，IPTG濃度實(shí)驗(yàn)了0.1、0.5和1.OmM三個(gè)梯度。最終我們根據(jù)SDS-PAGE電泳分析，獲得了28。C的誘導(dǎo)溫度和1.0mMIPTG濃度為的最適誘導(dǎo)條件。4)融合蛋白在M15中的大量表達(dá)取工程菌株在28。C120rpm和1.0mM條件下進(jìn)行大量的誘導(dǎo)純化，分別誘導(dǎo)3，6，9，12h(如圖IO所示)。同時(shí)取誘導(dǎo)不同的陽性轉(zhuǎn)化子相同條件誘導(dǎo)12小時(shí)(如圖11所示)，觀察其不同的轉(zhuǎn)化子的蛋白表達(dá)量。由圖我們可知，在表達(dá)的過程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，目的蛋白的表達(dá)量在不斷的增加，占到了菌體總蛋白的20%，同時(shí)不同的轉(zhuǎn)化子在誘導(dǎo)相同的時(shí)間上的表達(dá)量也不一樣，在蛋白純化中選擇表達(dá)狀態(tài)最佳的菌株。2.5融合蛋白的純化對(duì)于表達(dá)的包涵體蛋白，采用尿素變性純化的方法對(duì)28°C120rpm和1.0mM條件下大量誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌液進(jìn)行了大量純化。分別取含有目的蛋白的細(xì)菌裂解上清(純化前)及收集的峰值洗脫液(純化后)行SDS-PAGE,133KDa條帶附近可見目的蛋白的表達(dá)條帶，且融合蛋白表達(dá)水平成為E.coli中總蛋白的主要成分，應(yīng)用^2+-NTA樹脂純化的蛋白純度達(dá)80。/。左右(圖12所示)。由圖我們可知，通過實(shí)驗(yàn)我們純化了大量的目的蛋白，蛋白的純度高，蛋白的含量相對(duì)比較少點(diǎn)。通過的蛋白含量的測(cè)定計(jì)算有利于準(zhǔn)確獲得融合蛋白的表達(dá)量。5)His-CrylAc22融合蛋A濃度測(cè)定采用BSA溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線(如表l)，將變性純化的融合蛋白稀釋。以BufferE為對(duì)照，加入等體積的染色液GR50，在分光光度計(jì)下測(cè)0D600,每一稀釋度重復(fù)3次。表1BSA溶液標(biāo)準(zhǔn)濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注樣品OD600為0.130,樣品濃度為1177ug/ml，5ml純化的融合蛋白總量為5887.68ug實(shí)施例四CrylAc22蛋白對(duì)鱗翅目昆蟲毒性的生物測(cè)定取HIC22工程菌株進(jìn)行殺蟲生物活性測(cè)定，取培養(yǎng)20小時(shí)菌液稀釋至適當(dāng)濃度，涂布于甘藍(lán)葉上，伺喂二齡小菜蛾幼蟲,置于25'C培養(yǎng)箱內(nèi)，觀察幼蟲生長(zhǎng)狀態(tài)(如圖13所示)。噴灑了HIC22工程菌的1號(hào)，小菜蛾取食的葉片后,食欲減退,行動(dòng)遲緩，30個(gè)小時(shí)后基本死亡。而未噴灑HIC22工程菌的2號(hào)對(duì)照，小菜蛾食欲正常，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，個(gè)體肥大。通過測(cè)定HIC22工程對(duì)小菜蛾害蟲初孵幼蟲的毒力，結(jié)果表明,HIC22工程菌株在低濃度下就對(duì)小菜夜蛾就有很強(qiáng)的殺蟲活性。純化蛋白的小菜蛾殺蟲活性的測(cè)定采用浸葉法。將甘藍(lán)葉片ffl水洗凈晾干，選取鮮嫩一致的葉片，浸入稀釋好的純化蛋白樣品10s，取出晾干，放入生測(cè)瓶中，小菜蛾(Plutellaxylostella)幼蟲(二齡幼蟲)由本所飼養(yǎng)。每瓶接二齡幼蟲30頭，每處理重復(fù)3次，放置25'C光照培養(yǎng)箱中，96h后觀察幼蟲生長(zhǎng)狀。序列表SEQUENCELISTING<110>海南海德熱帶農(nóng)業(yè)資源研究所有限公司<120>對(duì)鱗翅目昆蟲有殺蟲活性的BtcrylAc22基因及其應(yīng)用<130><160〉1<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>3534<212>腿<213>蘇云金芽孢桿菌(Aac^Just力iu-i'/《ie/757's)<220><221>gene<222>(l)..(3537)<223><400〉11ATGGATAACAATCCGAACATCAATGMTGCATTCCTTATAATTGTTTAAGTAACCCTGAA61GTAGAAGTATTAGGTGGAGAAAGAATAGAAACTGGTTACACCCCAATCGATATTTCCTTG121TCGCTAACGCAATTTCTTTTGAGTGAATTTGTTCCCGGTGCTGGATTTGTGTTAGGACTA181GTTGATATAATATGGGGAATTTTTGGTCCCTCTCAATGGGACGCATTTCTTGTACAAATT241GAACAGTTAATTAACCAAAGAATAGAAGAATTCGCTAGGAACCAAGCCATTTCTAGATTA301GAAGGACTAAGCAATCTTTATCAAATTTACGCAGAATCTTTTAGAGAGTGGGAAGCAGAT361CCTACTAATCCAGCATTAAGAGAAGAGATGCGTATTCAATTCAATGACATGAACAGTGCC421CTTACAACCGCTATTCCTCTTTTTGCAGTTCAAAATTATCAAGTTCCTCTTTTATCAGTA481TATGTTCAAGCTGCAAATTTACATTTATCAGTTTTGAGAGATGTTTCAGTGTTTGGACAA541AGGTGGGGATTTGATGCCGCGACTATCAATAGTCGTTATAATGATTTAACTAGGCTTATT601GGCAACTATACAGATTATGCTGTACGCTGGTACAATACGGGATTAGAACGTGTATGGGGA661CCGGATTCTAGAGATTGGGTAAGGTATAATCAATTTACAAGAGAATTAACACTAACTGTA721TTAGATATCGTTGCTCTGTTCCCGAATTATGATAGTAGAAGATATCCAATTCGAACAGTT781TCCCAATTAACAAGAGAAATTTATACAAACCCAGTATTAGAAAATTTTGATGGTAGTTTT841CGAGGCTCGGCTCAGGGCATAGAAAGAAGT901AACAGTATAACCATCTATACGGATGCTCAT961ATAATGGCTTCTCCTGTAGGGTTTTCGGGG1021ATGGGAAATGCAGCTCCACAACAACGTATT1081ACATTATCGTCCACTTTATATAGAAGACCT1141TCTGTTCTTGACGGGACAGAATTTGCTTAT1201TACAGAAAAAGCGGAACGGTAGATTCGCTG1261CCACCTAGGCAAGGATTTAGTCATCGATTA1321AGTAATAGTAGTGTAAGTATAATGAGAGCT1381GAATTTAATAATATAATTGCATCGGATAGT1441TTTCTTTTTAATGGTTCTGTAATTTCAGGA1501TTAAATAGTAGTGGAMTAACATTCAGAAT1561CCATCGACATCTACCAGATATCGAGTTCGT1621CTCAACGTTAATTGGGGTAATTCATCCATT1681TCATTAGATAATCTACAATCAAGTGATTTT1741TCTTCATTAGGTAATATAGTAGGTGTTAGA1801GACAGATTTGAATTTATTCCAGTTACTGCA1861GCGCAGAAGGCGGTGAATGCGCTGTTTACG1921GTAACGGATTATCATATTGATCAAGTGTCC1981TGTCTGGATGAAAAGCGAGAATTGTCCGAG2041GAACGCAATTTACTCCAAGATTCAAATTTC2101TGGGGCGGAAGTACAGGGATTACCATCCAA2161GTCACACTATCAGGTACCTTTGATGAGTGC2221GAATCAAAATTAAAAGCCTTTACCCGTTAT2281GACTTAGAAATCTATTTAATTCGCTACAAT2341ACGGGTTCCTTATGGCCGCTTTCAGCCCAA2401CGATGCGCGCCACACCTTGAATGGAATCCT2461AAGTGTGCCCATCATTCGCATCATTTCTCC2521AATGAGGACCTAGGTGTATGGGTGATCTTT2581CTAGGGAATCTAGAGTTTCTCGAAGAGAAA2641AAAAGAGCGGAGAAAAAATGGAGAGACAAAATTAGGAGTCCACATTTGATGGATATACTTAGGGGTTATTATTATTGGTCAGGGCATCAACCAGAATTCACTTTTCCGCTATATGGAACTGTTGCTCAACTAGGTCAGGGCGTGTATAGATTTAATATAGGGATAAATAATCAACAACTAGGAACCTCCTCAMTTTGCCATCCGCTGTAGATGAAATACCGCCACAGAATAACAACGTGAGCCATGTTTCAATGTTTCGTTCAGGCTTTCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTAGTGCTATTACTCAAATCCCTGCAGTGAAGGGAAACCCAGGATTTACTGGTGGGGACTTAGTTAGAAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCGTACGGTATGCTTCTGTAACCCCGATTCACTTTTCCAATACAGTACCAGCTACAGCTACGGGTTATTTTGAAAGTGCCAATGCTTTTACAAATTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATAATAACACTCGAGGCTGAATATAATCTGGAAAGATCTACAAACCAACTAGGGCTAAAAACAAATAATTTAGTTACGTATTTATCGGATGAATTTAAAGTCAAACATGCGAAGCGACTCAGTGATAAAGACATTAATAGGCAACCAGAACGTGGGGGAGGGGATGACGTATTTAAAGAAAATTACTATCCAACATATTTGTATCAAAAAATCGATCAATTAAGAGGGTATATCGAAGATAGTCAAGCAAAACATGAAACAGTAAATGTGCCAGGTAGTCCAATCGGAAAGTGTGGAGAGCCGAATGACTTAGATTGTTCGTGTAGGGATGGAGAATTAGACATTGATGTAGGATGTACAGACTTAAAGATTAAGACGCAAGATGGGCACGCAAGACCATTAGTAGGAGAAGCGCTAGCTCGTGTGCGTGAAAAATTGGAATGGGAAACAAATATC15<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>121PTNPALREEMRIQFNDMNSALTTAIPLFAVQNYQVPLLSVYVQAANLHLSVLRDVSVFGQ181跳FDAATINSRYNDLTRLIGNYTDYAVRWYNTGLE訓(xùn)GPDSR麗RYNQFTRELTLTV241LDIVALFPNYDSRRYPIRTVSQLTREIYTNPVLENFDGSFRGSAQGIERSIRSPHLMDIL301NSITIYTDAHRGYYYWSGHQIMASPVGFSGPEFTFF"LYGTMGNAAPQQRIVAQLGQGVYR361TLSSTLYRRPFNIG圃QLSVLDGTEFAYGTSSNLPSAVYRKSGTVDSLDEIPPQN麗421PPRQGFS服LSHVSMFRSGFSNSSVSIMRAPMFSWI服SAE剛IIASDSITQIPAVKGN側(cè)FL跳SVISGPGFTGGDLVRLNSSGNNIQNRGYIEVPIHFPSTSTRYRVRVRYASVTPIH541LNVNWGNSSIFSNTVPATATSLDNLQSSDFGYFESANAFTSSLGNIVGVRNFSGTAGVII601DRFEFIPVTATLEAEYNLERAQKAVNALFTSTNQLGLKTNVTDYHIDQVSNLVTYLSDEF661CLDEKRELSEKVKHAKRLSDERNLLQDSNFKDINRQPERGWGGSTGITIQGGDDVFKENY721VTLSGTFDECYPTYLYQKIDESKLKAFTRYQLRGHEDSQDLEIYLIRYNAKHET麗PG781TGSLWPLSAQSPIGKCGEPNRCAraLEWNPDLDCSCRDGEKCAHHSHHFSLDIDVGCTDL841NEDLGVWVIFKIKTQDGHARLGNLEFLEEKPLVGEALARVKRAEKKWRDKREKLE沐ETNI901VYKEAKESVDAL剛SQYDQLQADTN畫HAADKRVHSIREAYLPELSVIPGVNAAIFE961ELEGRIFTAFSLYDARNVIKNGDFNNGLSC麗KG騰VEEQNNQRSVLVVPEWEAEVSQ1021EVRVCPGRGYILRVTAYKEGYGEGCVTI服IENNTDELKFSNCVEEEIYPNNTVTCNDYT蘭VNQEEYGGAYTSRNRGYNEAPSVPADYASVYEEKSYTDGRRENPCEF服GYRDYTPLPVG1141YVTKELEYFPETDKVWIKIGETEGTFIVDSVELLLMEE.1權(quán)利要求1.一種蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白基因cry1Ac22，具有如下所示序列a)如SQENO1所示的核苷酸序列；b)與SQENO1所示的核苷酸序列具有兼并性的核苷酸序列；c)與SQENO1所示的核苷酸序列有90％以上同源性的核苷酸序列。2.—種含有權(quán)利要求1所述的基因crylAc22的載體。3.—種含有權(quán)利要求1所述的基因crylAc22的宿主細(xì)胞。4.一種如權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，它是工程菌株HIC22。5.—種由SEQN0:l所示的核苷酸序列編碼的蛋白。6.—種如權(quán)利要求5所述的蛋白，其氨基酸序列如SQEN0:2所示。7.—種制備權(quán)利要求1所述的基因crylAc22的方法。8.—種制備權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞的方法。9.一種制備權(quán)利要求4所述的工程菌株的方法。10.—種如權(quán)利要求1所述的基因crylAc22的用途，對(duì)鱗翅目昆蟲有高效殺蟲活性用。全文摘要本發(fā)明涉及一種從蘇云金桿芽孢桿菌(Bt)野生菌株W015-1中分離克隆的殺蟲晶體蛋白基因cry1Ac22及其對(duì)鱗翅目昆蟲具有高效殺蟲活性和應(yīng)用。本發(fā)明采用反向PCR克隆法從Bt菌株w015-1中克隆了Cry1Ac全長(zhǎng)基因，該基因的開放閱讀框(ORF)為3534bp，編碼由1178個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，整個(gè)蛋白含有三個(gè)內(nèi)毒素蛋白保守結(jié)構(gòu)域，被國(guó)際Bt殺蟲晶體蛋白基因命名委員會(huì)命名為Cry1Ac22，GenBank登錄序號(hào)為EU282379。利用工程菌或純化的表達(dá)蛋白，對(duì)鱗翅目昆蟲小菜蛾(Plutellaxylostella)具有高活力毒殺作用。文檔編號(hào)C12N15/63GK101532023SQ20091011999公開日2009年9月16日申請(qǐng)日期2009年3月3日優(yōu)先權(quán)日2009年3月3日發(fā)明者劉卓明,張文飛,方宣鈞,柳謝申請(qǐng)人:海南海德熱帶農(nóng)業(yè)資源研究所有限公司