專(zhuān)利名稱(chēng)：極細(xì)枝孢霉生物合成茶黃素粗提物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 一 種微生物胞外酶生產(chǎn)茶黃素的方法，尤指 一 種 極細(xì)枝孢霉(C7sO^Sporj'〃7Z7 te/7"J'5^J'歷〃/Z7)生物合成茶黃素粗提
物的方法。
背景技術(shù)：
茶黃素為紅茶的主要活性物質(zhì)，具有多種藥理與保健功效， 某些方面甚至優(yōu)于兒茶素，在天然藥物、功能食品、日用化工、 功能飲料開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。目前所利用的茶黃素
主要是從紅茶中分離提取，紅茶中茶黃素(TFs)總量含量低， 約為0.2%-2.0%，但存在分離純化技術(shù)難度大，成本高的缺點(diǎn)， 這些技術(shù)障礙嚴(yán)重阻礙了其開(kāi)發(fā)利用。獲取高含量、低成本的茶
黃素己成為茶學(xué)界、食品界和醫(yī)藥界研究的重要課題。體外模擬 氧化(包括酶促氧化和化學(xué)氧化) 一直作為研究?jī)翰杷匮趸瘷C(jī)理 及紅茶發(fā)酵理論簡(jiǎn)單、有效的方法，已有學(xué)者用此方法研究制備 了茶黃素，并獲得了較好的效果。體外氧化制備茶黃素與從紅茶 中萃取制備比較，成本要明顯降低。目前體外氧化制備茶黃素主
要是通過(guò)化學(xué)方法或通過(guò)酶法制備，但化學(xué)方法具有終點(diǎn)難以掌 握、反應(yīng)副產(chǎn)物多等缺點(diǎn)；酶法因存在酶源缺乏、酶活性低等問(wèn) 題而未能廣泛應(yīng)用。因此，尋找理想的酶源已是體外模擬氧化制 備茶黃素的首要任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足， 提供一種極細(xì)枝孢霉((^ac/0Sp0J^〃7Z7 te/7〃yssi/Z7〃/ 7)生物合成茶
黃素粗提物的方法，從茶黃素合成所需的多酚氧化酶酶源入手， 利用微生物繁殖快、易培養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)成本低等特點(diǎn)，篩選出高產(chǎn)多 酚氧化酶的菌種應(yīng)用于茶黃素的制備。 使用的微生物本發(fā)明從合成茶黃素所需的多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PP0)入手，得到高產(chǎn)多酚氧化酶的菌株極細(xì)枝孢霉 ("油spori諸fe/ 〃j'^i/ff脂)，該菌株于2009年1月21曰在 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào) 為CGMCC NO.2891 。
極細(xì)枝孢霉菌株具有下述性質(zhì)
1、 形態(tài)學(xué)特征
用顯微鏡觀(guān)察菌絲的形態(tài)和孢子形態(tài)。結(jié)果表明菌絲較細(xì) 長(zhǎng)，較少分枝，孢子從分生梗頂端成堆生長(zhǎng)，分生孢子為橢圓形。
2、 培養(yǎng)基上的特征
MA瓊脂培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)為菌落呈深橄欖色，短絨面，
稍隆起。0. 2。/。兒茶素-PDA平板上，生長(zhǎng)3d后，出現(xiàn)橙紅色變色
圈；培養(yǎng)7 d后菌落表面出現(xiàn)同心環(huán)紋。
將分離純化的極細(xì)枝孢霉菌種采用BI0L0G-FF鑒定板(重復(fù) 兩次)及18 S rDNA分子方法鑒定。此菌種為極細(xì)枝孢霉 (67ac/o57 (92^'^Z7 te/ w/s5^'歷w歷)，屬于半矢口菌類(lèi)(Fungi Imperfecti) 叢梗？包目(Moniliales)日音梗孢科(Demat i aceae)雙胞亞科 (Didymosporoideae)芽枝霉屬(Cladosporium)。
菌種的制備方法(篩選而得)
菌種的初篩從茶園10-20cm深處取土，每克土樣加入19 ml 的無(wú)菌水，并加入玻璃珠，振搖4-6min，稀釋1000倍，取0. 2 ml 接種于上層為PDA固體，下層為每10. 0 ml的PDA力n 0. 02 g兒茶 素的固體初篩培養(yǎng)基平板上，將平板置于28'C恒溫培養(yǎng)箱中，靜 置培養(yǎng)3天；
菌種的復(fù)篩將初篩培養(yǎng)基上有氧化圈的菌株劃線(xiàn)接種到每 10.0 ml的PDA加0.02 g兒茶素的固體純化培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培 養(yǎng)，直至得到純化的極細(xì)枝孢霉菌株。
再進(jìn) 一 步利用純化的極細(xì)枝孢霉菌株制備多酚氧化酶粗酶 液和酶促氧化制備茶黃素
多酚氧化酶粗酶液的制備菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)
將a2步驟中純化菌種轉(zhuǎn)接種至每10. 0 ml的PDA含有0. 02 g 大葉種茶兒茶素的液體培養(yǎng)基中，于22-25 "C下，以轉(zhuǎn)速為 110-130 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)4天；
發(fā)酵培養(yǎng)基的配制-
配制馬鈴薯200 g/L、葡萄糖5 g/L、 NH4N03 3 g/L、純度大于 70%的大葉禾中茶兒茶素3 g/L、CuS04 0. 1 mmol/L、 FeS04 0. 1 mmol/L 的發(fā)酵液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)液體積為容器總體積的50-65%， pH為 4.5-5.6， 于121°C條件下滅菌20min;
菌種的接種與發(fā)酵
取b步驟中帶有菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)基接種到c步驟中的發(fā)酵培 養(yǎng)基中，接種量為擴(kuò)大培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基(體積比)為4-7 : 93-96，于22-25°C、轉(zhuǎn)速為110-1 30 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)4天；
制備粗酶液
取上述發(fā)酵培養(yǎng)液，用4層干凈紗布過(guò)濾菌絲體，然后于3-5 。C下，以離心轉(zhuǎn)速為7,_8200 r/min離心25_35 min后，取上 清液作為粗酶液。
粗酶液的測(cè)定取1. 0 mL粗酶液加3. 0 mL反應(yīng)混合液(反 應(yīng)混合液按PH5.6檸檬酸-磷酸緩沖液0. 1%脯氨酸1%鄰苯 二酚(10 : 2 : 3)于離心管中，37。C恒溫水浴中反應(yīng)10 min，取出 立即加3.0mL 1N偏磷酸搖均終止反應(yīng)。離心4000rpm， lOmin， 取上清液，用lcm比色皿，在波長(zhǎng)460nm處測(cè)消光值?？瞻讓?duì)照 的反應(yīng)混合液中的鄰苯二酚用緩沖溶液代替，其它條件相同。酶 活性以每亳升每分鐘E，增加0. 1為一活性單位。測(cè)得酶活力為 315活性單位。由于酶的專(zhuān)一性很強(qiáng)，每種酶有特定底物(被催 化反應(yīng)的物質(zhì))，因此，每種酶的活力的測(cè)定均有固定的方法。 而在此使用的便是多酚氧化酶的測(cè)定方法，其測(cè)定方法可參見(jiàn)黃 意歡主編《茶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997年出版)。因 此，可以推斷出該粗酶液即為多酚氧化酶粗酶液。
酶促氧化制備茶黃素取上述多酚氧化酶粗酶液，按每100ml粗酶液加入純度大于
72%的兒茶素2. 0g，于溫度為22-2 5°C 、 pH為4. 5-5. 6的條件下 通入氧氣以不產(chǎn)生大量氣泡為宜，反應(yīng)40-50分鐘，將反應(yīng)液用 膜過(guò)濾濃縮冷凍干燥即得茶黃素粗制品。該茶黃素粗提物中主要 含四禾中茶黃素單體TF、 TF3G、 TF3， G及TFDG。
如此，本發(fā)明通過(guò)對(duì)大量微生物進(jìn)行篩選，獲得多酚氧化酶 的高產(chǎn)菌株極細(xì)枝孢霉，利用微生物天然酶源、安全、高效、低 成本地制備茶黃素，茶黃素粗品中茶黃素總量高于20.00%;且工 藝步驟簡(jiǎn)單，設(shè)備投入少，工效高，生產(chǎn)成本低；反應(yīng)過(guò)程中不 使用任何有機(jī)溶液，是一種綠色環(huán)保的茶黃素生產(chǎn)方法。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例中
初篩培養(yǎng)基上層為PDA固體；下層為每10. 0 ml的PDA加 0. 02 g兒茶素的固體培養(yǎng)基。
純化培養(yǎng)基為每10. 0 ml的PDA加0. 02 g兒茶素的固體培 養(yǎng)基。
擴(kuò)大培養(yǎng)基為每10. 0 ml的PDA含有0. 02 g大葉種茶兒茶 素的液體培養(yǎng)基。
實(shí)施例1，從茶園10cm深處取土，稱(chēng)取土樣5g放入盛有玻 璃珠的95ml無(wú)菌水中，振搖5 min，稀釋1000倍，取0. 2ml接 種于初篩培養(yǎng)基平板上，將平板置于28"C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 天；將初篩培養(yǎng)基上有氧化圈的菌株劃線(xiàn)接種到純化培養(yǎng)基上， 直至得到極細(xì)枝孢霉菌株；再將純化菌種轉(zhuǎn)接入PDA液體擴(kuò)大培 養(yǎng)基中，以110 r/min的轉(zhuǎn)速振搖，于23 °C下恒溫培養(yǎng)4天；將 該菌株接種到含有馬鈴薯200 g/L、葡萄糖5g/L、 NH4N03 3 g/L、 純度為70. 08%的大葉禾中茶兒茶素3 g/U CuS04 0. 1 mmol/L、 FeS04 0. 1 mmol/L的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，容器中培養(yǎng)液的裝液量為50%， 菌株的接種量為擴(kuò)大培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基(體積比)為4 : 96， 于pH為4.5，轉(zhuǎn)速為110 r/min，溫度為23。C下恒溫培養(yǎng)4天；取上述發(fā)酵培養(yǎng)液，用4層干凈紗布過(guò)濾菌絲體，然后4 °C下經(jīng)
7800 r/min離心30 min后取上清液作為粗酶液。測(cè)得發(fā)酵液中多 酚氧化酶的酶活力為310活性單位(測(cè)定方法參見(jiàn)黃意歡主編 《茶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997年出版。定義以1.0 ml 粗酶液1 min 0D值增加0.1為1個(gè)酶活性單位)。取此粗酶液 1000ml加純度為70. 08%的大葉種茶兒茶素20.0g，于溫度為22 °C ， pH為4. 8條件下通入氧氣但不產(chǎn)生大量氣泡，酶促氧化50分
鐘制得茶黃素粗提物，將茶黃素粗提物用膜過(guò)濾濃縮冷凍干燥后 稱(chēng)重20. 55g 。用高效液相色譜測(cè)得茶黃素粗提物中茶黃素總量為 20. 17%,其中，TF、 TF3G、 TF3， G及TFDG單體含量分另ij為0. 96%、 2. 65%、 1. 880/0及14. 68%。
實(shí)施例2，從茶園15cm深處取土，稱(chēng)取土樣10g放入盛有玻 璃珠的190 ml無(wú)菌水中，振搖5 min，稀釋1000倍，取0. 2 ml 接種于初篩培養(yǎng)基平板上，將平板置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 3天；將初篩培養(yǎng)基上有氧化圈的菌株劃線(xiàn)接種到純化培養(yǎng)基上， 直至得到極細(xì)枝孢霉菌株；再將純化菌種轉(zhuǎn)接入PDA液體擴(kuò)大培 養(yǎng)基中，以120 r/min的轉(zhuǎn)速振搖，于2 5 °C下恒溫培養(yǎng)4天；將 該菌株接種到含有馬鈴薯200 g/L、葡萄糖5 g/L、 NH4N03 3 g/L、 純度為76. 00%的大葉禾中茶兒茶素3 g/L、 CuS04 0. 1 mmol/L、 FeS04 0. 1 mmol/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，容器中培養(yǎng)液的裝液量為60%，菌 株的接種量為擴(kuò)大培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基(體積比)為7 : 93，于 pH為5.0，轉(zhuǎn)速為120 r/min，溫度為2 5 。C下恒溫培養(yǎng)4天；取 上述發(fā)酵培養(yǎng)液，用4層干凈紗布過(guò)濾菌絲體，然后4。C下經(jīng)8 000 r/min離心30 min后取上清液作為粗酶液。測(cè)得發(fā)酵液中多 酚氧化酶的酶活力為326活性單位。取此粗酶液1000ml加純度 為76. 97%的大葉種茶兒茶素20.0g，于溫度為25°C、 pH為5.2 條件下通入氧氣但不產(chǎn)生大量氣泡，酶促氧化40分鐘制得茶黃 素粗提物，將茶黃素粗提物用膜過(guò)濾濃縮冷凍干燥后稱(chēng)重 20. 67g 。用高效液相色譜測(cè)得茶黃素粗提物中茶黃素總量為20. 37%，其中，TF、 TF3G、 TF3， G及TFDG單體含量分另U為0. 96%、 2. 79%、 1. 86%及14. 76%。
實(shí)施例3，從茶園20cm深處取土，稱(chēng)取土樣10g放入盛有玻 璃珠的190 ml無(wú)菌水中，振搖5 min，稀釋1000倍，取0. 2 ml 接種于初篩培養(yǎng)基平板上，將平板置于28'C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 3天；將初篩培養(yǎng)基上有氧化圈的菌株劃線(xiàn)接種到純化培養(yǎng)基上， 直至得到極細(xì)枝孢霉菌株；再將純化菌種轉(zhuǎn)接入PDA液體擴(kuò)大培 養(yǎng)基中，以130 iVmin的轉(zhuǎn)速振搖，于25°C下恒溫培養(yǎng)4天；將 該菌株接種到含有馬鈴薯200 g/L、葡萄糖5 g/L、 NH4N03 3 g/L、 純度為73. 87%的大葉禾中茶兒茶素3 g/L、 CuS04 0. 1 mmol/U FeS04 0. 1 mmol/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，容器中培養(yǎng)液的裝液量為65% ，菌 株的接種量為擴(kuò)大培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基(體積比)為5 : 95，于 pH為5.3，轉(zhuǎn)速為130 r/min，溫度為28。C下恒溫培養(yǎng)4天；取 上述發(fā)酵培養(yǎng)液，用4層干凈紗布過(guò)濾菌絲體，然后4 °C下經(jīng)8 200 r/min離心30 mi n后取上清液作為粗酶液。測(cè)得發(fā)酵液中多 酚氧化酶的酶活力為305活性單位。取此粗酶液1000ml加純度 為73. 87%的兒茶素20. 0g，于溫度為24°C 、 pH為5. 0條件下通 入氧氣但不產(chǎn)生大量氣泡，酶促氧化45分鐘制得茶黃素粗提物， 將茶黃素粗提物用膜過(guò)濾濃縮冷凍干燥后稱(chēng)重20. 34g。用高效液 相色譜測(cè)得茶黃素粗提物中茶黃素總量20.00%，其中，TF、 TF3G、 TF3' G及TFDG單體含量分另lj為0. 96%、 2. 57%、 1. 84%及14. 63%。
權(quán)利要求
1、一種極細(xì)枝孢霉生物合成茶黃素粗提物的方法，其特征在于包括如下步驟(1)、多酚氧化酶粗酶液的制備a、先篩選出極細(xì)枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)CGMCCNO.2891；b、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)將a步驟中純化菌種轉(zhuǎn)接種至每10.0ml的PDA含有0.02g大葉種茶兒茶素的液體培養(yǎng)基中，于22-25℃下，以轉(zhuǎn)速為110-130r/min恒溫振蕩培養(yǎng)4天；c、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制配制馬鈴薯200g/L、葡萄糖5g/L、NH4NO3 3g/L、純度大于70％的大葉種茶兒茶素3g/L、CuSO4 0.1mmol/L、FeSO4 0.1mmol/L的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)液體積為容器總體積的50-65％，pH為4.5-5.6，于121℃條件下滅菌20min；d、菌種的接種與發(fā)酵取b步驟中帶有菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)基接種到c步驟中的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為擴(kuò)大培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基(體積比)為4-7∶93-96，于22-25℃、轉(zhuǎn)速為110-130r/min恒溫振蕩培養(yǎng)4天；e、制備粗酶液取上述發(fā)酵培養(yǎng)液，用4層干凈紗布過(guò)濾菌絲體，然后于3-5℃下，以離心轉(zhuǎn)速為7800-8200r/min離心25-35min后，取上清液作為粗酶液；(2)、酶促氧化兒茶素制備茶黃素取上述粗酶液，按每100ml粗酶液加入純度大于70％的兒茶素2.0g，于溫度為22-25℃、pH為4.5-5.6的條件下通入氧氣以不產(chǎn)生大量氣泡為宜，反應(yīng)40-50分鐘，將反應(yīng)液用膜過(guò)濾濃縮冷凍干燥即得茶黃素粗制品。
全文摘要
一種極細(xì)枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)生物合成茶黃素(Theaflavins，TFs)粗提物的方法，通過(guò)對(duì)大量微生物進(jìn)行篩選，獲得多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)的高產(chǎn)菌株極細(xì)枝孢霉，在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中pH為4.5-5.6、搖床轉(zhuǎn)速為110-130r/min、溫度為22-25℃的條件下恒溫培養(yǎng)該菌株合成多酚氧化酶，取得多酚氧化酶粗酶液，并通入氧氣進(jìn)行體外模擬氧化兒茶素40-50分鐘制備茶黃素。應(yīng)用本發(fā)明可以獲得茶黃素粗制品中茶黃素含量高于20.00％，且工藝步驟簡(jiǎn)單，設(shè)備投入少，工效高，生產(chǎn)成本低；反應(yīng)過(guò)程中不使用任何有機(jī)溶液，是一種綠色環(huán)保的茶黃素生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101565724SQ20091012907
公開(kāi)日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月8日
發(fā)明者傅冬和, 劉仲華, 趙淑娟 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)