專利名稱：：作為zalpha受體之配體的人細胞因子及其用途的制作方法作為zalpha受體之配體的人細胞因子及其用途本申請是申請日為2000年3月9日、申請?zhí)枮?0806874.7、發(fā)明名稱為"作為zalpha受體之配體的人細胞因子及其用途"的發(fā)明專利申請的分案申請。
背景技術：
：多細胞生物體細胞的增殖與分化是受激素和多肽生長因子控制的。這些可擴散的分子使細胞彼此聯(lián)系并協(xié)同作用形成細胞、組織和器官，并修復受損的組織。激素和生長因子的例子包括類固醇激素(如雌激素、睪酮)、甲狀旁腺素、促卵泡激素、白介素、血小板衍生的生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅細胞生成素(EPO)和降釣素。激素和生長因子通過與受體結合影響細胞代謝。受體可以是與細胞內信號途徑如第二信使系統(tǒng)結合的整合膜蛋白。其它類別的受體是可溶性分子，如轉錄因子。細胞因子一般都刺激造血鐠系細胞的增殖或分化或參與機體的免疫和炎性反應機制。影響造血的細胞因子的例子包括刺激紅血細胞發(fā)育的促紅細胞生成素(EPO)、刺激巨核細胞語系細胞發(fā)育的血小板生成素(TPO),以及刺激嗜中性細胞發(fā)育的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。這些細胞因子可用于恢復貧血、血小板減少和中性白細胞減少病人，或接受腫瘤化療病人體內的正常血細胞水平。白介素是一個介導包括炎癥在內的免疫學反應的細胞因子家族。白介素介導各種炎癥病理學過程。對免疫反應極為重要的是T細胞，其產生許多細胞因子并產生針對抗原的適應性免疫。已將T細胞產生的細胞因子分為l型和2型兩大類型(Kelso，A.I腿un.CellBiol.76:300-3171998)。1型細胞因子包括IL-2、IFN-y、LT-oc,并參與炎性反應、病毒免疫、細胞內寄生蟲免疫和同種異體移植排斥。2型細胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-1Q和IL-13,并參與體液反應、蠕蟲免疫和過敏反應。1型和2型共有的細胞因子包括IL-3、GM-CSF和TNF-a。有某些證據提示產生1型和2型的T細胞群體優(yōu)先遷移到3不同類型的發(fā)炎組織中?？梢杂每乖蚱渌碳の锛せ畛墒斓腡細胞，以產生進一步影響T細胞群體命運的細胞因子、生化信號分子或受體?？赏ㄟ^其細胞表面上的受體，包括B細胞受體及其它輔助分子活化B細胞，以完成如生產細胞因子等輔助細胞功能。天然殺傷(NK)細胞與T細胞和B細胞有共同的始祖細胞，并且在免疫監(jiān)視中發(fā)揮作用。占血淋巴細胞約15%的NK細胞并不表達抗原受體，因此不利用MHC識別作為與乾細胞結合的條件。NK細胞參與識別和殺傷某些肺瘤細胞及病毒感染的細胞。在體內，據信NK細胞需要活化，但在體外，已證明NK細胞不經活化即可殺死某些類型的腫瘤細胞。已證明的細胞因子家族的體內活性說明了其它細胞因子、細胞因子激動劑及細胞因子拮抗劑的許多臨床潛能及對這些分子的需要。本發(fā)明提供一種刺激造血細胞譜系細胞的新細胞因子及相關的組合物和方法，以滿足這些需要。用途的多肽。附圖簡要說明圖1舉例顯示人IL-2、人IL-15、zalphall配體(SEQIDNO:2)、人IL-4、小鼠IL-2、人GM-CSF和小鼠GM-CSF的多重序列對比。發(fā)明的詳細描述在詳細陳述本發(fā)明之前，明確下列術語的定義可能是有幫助的術語"親和標記物"在本文中是指可連接到第二個多肽上以便為純化或檢測第二個多肽，或者為將第二個多肽連接到底物上而提供位點的多肽片段。原則上，抗體或其它特異性結合劑可利用的任何肽或蛋白質均可用作親和標記物。親和標記物包括多組氨酸序列、蛋白A(Nilssonetal.，EMBOJ.4:1075，1985;Nilssonetal.，MethodsEnzymol.198:3，1991)、谷胱甘肽S轉移酶(SmithandJohnson,Gene67:31，1988)、Glu-Glu親和標記物(Grussen呵eretal.，P潔.Natl.Acad.Sci.USA82:7952-4，1985)、物質p、FlagTl(Hoppetal.，Biotechnology6:1204-10，1988)、鏈霉抗生物素結合肽，或其它抗原表位或結合區(qū)(總地參見FordetaL,ProteinExpressionandPurification2:95-107，1991)。編碼親和標記物的DNA可從供應商(如PharmaciaBiotech,Piscataway，NJ)處購得。本文所使用的術語"等位變異體"是指占據同一染色體基因座的有任何兩個或多個可替換形式的基因。等位變異是通過突變天然產生的，并可導致群體內的表型多態(tài)性。基因突變可能是沉默的(未改變所編碼的多肽)，或者可編碼已改變了氨基酸序列的多肽。術語等位變異體還用于代表由基因等位變異體編碼的蛋白質。本文所使用的術語"氨基末端"和"羧基末端"代表多肽內的氨基酸位置。當文中的這些術語參照多肽的特定序列或其部分使用時可表示鄰近的或相對的位置。例如，多肽內某個位于參照序列羧基末端的序列是定位于參照序列羧基末端的附近，但不一定是在完整多肽的嚴基末端。術語"補體/抗補體對"表示在適當條件下形成非共價結合的，穩(wěn)定配對的不完全相同部分。例如，生物素和抗生物素(或鏈霉抗生物素)就是補體/抗補體對的原型成員。其它可舉例的補體/抗補體對包括受體/配體對、抗體/抗原(或半抗原或表位)對、有義/反義多核苷酸對等。當希望繼后解離補體/抗補體對時，該補體/抗補體對最好有<109]^的結合親和力。術語"多核苷酸分子的互補體"是指與參照序列相比較，具有互補堿基序列和相反方向的多核苷酸分子。例如，序列5'ATGCACGGG3'互補于5'CCCGTGCAT3'。術語"簡并核苷酸序列"表示包括一個或多個簡并密碼子(與編碼多肽的參照多核苷酸分子相比較)的核苷酸序列。筒并密碼子含有不同的核苷酸三聯(lián)體，但編碼相同的氨基酸殘基(即，GAU和GAC三聯(lián)體均編碼Asp)。術語"表達載體"是用于表示線性或環(huán)狀的DNA分子，其包括編碼有用多肽的片段，其中所說的片段可與其轉錄所需的附加片段可搡作地連接。這樣的附加片段包括啟動子和終止子序列，并且還可包括一個或多個復制原點、一個或多個選擇標記、增強子、多聚腺苷酸化信號等。表達載體一般是衍生于質?；虿《綝NA,或者可含有兩種元件。當術語"分離的"用于多核苷酸時，是表示該多核苷酸已從其天然遺傳環(huán)境中除去并因而沒有其它額外的或不需要的編碼序列，而且是以適用于遺傳工程化蛋白質生產系統(tǒng)的形式存在。這種分離的分子是從其天然環(huán)境中分離的，并包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離的DNA分子沒有與之常規(guī)聯(lián)系的其它基因，但可包括天然存在的5'和3'非翻譯區(qū)如啟動子和終止子。鑒定相關區(qū)域的方法是本領域技術人員已知的(如參見DynanandTijan，Nature316:774-78，1985)。"分離的"多肽或蛋白質是見于其天然環(huán)境以外的情況下的，如從血液和組織中分離出的多肽或蛋白質。在一優(yōu)選形式中，分離的多肽基本上沒有其它多肽，特別是動物來源的其它多肽。優(yōu)選的是提供高度純化形式的，即純度大于95%,更優(yōu)選的是純度大于99%的多肽。當用于本文時，術語"分離的"并不排除有另外物理形式的如二聚體或另外糖基化或衍生化形式的同種多肽存在。術語"贅生"用于表示細胞時，是指經歷新的和異常增生的細胞，特別是在增生為無控制的或進行性的，進而導致贅生物的組織中。贅生性細胞可以是惡性的，即侵入性的和轉移的，或良性的。術語"可操作地連接的"是指DNA片段的排布使其功能與預期的目的相一致，例如轉錄在啟動子中起始并通過編碼片段進行到終止子。術語"直向同源物"表示從一個種中得到的多肽或蛋白質是從不同種生物體中得到的多肽或蛋白質的功能對應物。直向同源物間的序列差異是物種形成的結果。6"共生同源物"是由生物體制得的不同但結構相關的蛋白質。據信共生同源物是通過基因復制產生的。例如，a-球蛋白、球蛋白，和肌紅蛋白是彼此的共生同源物。"多核苷酸"是從5'到3'末端讀出的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。多核香酸包括RNA和DNA，并可以是從天然來源分離的，體外合成的，或從天然和合成分子的結合體制備的。多核普酸的大小以堿基對("bp")表示，可以是核苷酸數(shù)("nt")或千堿基數(shù)("kb")。在上下文允許的情況下，后兩個術語可描述單鏈或雙鏈的多核苷酸。當該術語用于雙鏈分子時，其可代表總長度并將被理解為等同于術語"堿基對"。本領域技術人員應意識到，雙鏈多核苷酸的兩條鏈長度可以稍有不同，并且因受到酶切割而可使其末端是錯開的；因此雙鏈多核苷酸分子內的所有核苷酸可以是不配對的。"多肽"是由肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物，并且可以是天然產生的或合成產生的。少于約IO個氨基酸殘基的多肽通常稱為"肽"。術語"啟動子"是指含有DM序列的基因的一部分，其用于結合RNA聚合酶并啟動轉錄。啟動子序列通常但不總是見于基因的5'非編碼區(qū)。"蛋白質"是包含一個或多個多肽鏈的大分子。蛋白質還可包括非肽成分，如糖基團。其中產生蛋白質的細胞可將糖和其它非肽取代基加到蛋白質上，并將隨細胞類型而變化。本文中蛋白質是依賴它們的氨基酸主鏈結構定義的；取代基如糖基團一般不是特定的，但卻可以是存在的。術語"受體"是指與生物活性分子(即配體)結合并介導配體對細胞作用的細胞結合蛋白。膜結合受體的特征是有多個肽結構，包括細胞外配體結合區(qū)和通常參與信號轉導的細胞內效應區(qū)。配體與受體的結合導致受體的構象改變，引起效應區(qū)與細胞內其它分子間的相互作用。這種相互作用本身又導致細胞代謝的改變。與受體-配體相互作用相聯(lián)系的代謝過程包括基因轉錄、磷酸化、去磷酸化、cAMP產生增加、細胞鈣轉移、膜脂質轉移、細胞粘著、肌醇脂水解和磷脂水解。一般說來，受體可以是膜結合的、胞質的或核的；單體的(如甲狀腺刺激激素受體、P-腎上腺素能受體)或多聚的(如PDGF受體、生長激素受體、IL-3受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、紅細胞生成素受體和IL-6受體)。術語"分泌信號序列"是指編碼多肽("分泌肽")的DNA序列，所說的多肽為較大多肽的一個組分，其指引較大多肽通過合成該多肽的細胞的分泌途徑。在瞬時通過分泌途徑期間，較大多肽常常被裂解以去除分泌肽。本文使用的術語"剪接變異體"是指從基因轉錄的另外形式的RNA。剪接變異是通過使用在轉錄的RNA分子內的或不太常見的是在單獨轉錄的RNA分子之間的可變剪接位點天然產生的，并且可產生幾個從同一基因轉錄的mRNA。剪接變異體可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。術語剪接變異體在本文中也用于表示由從基因轉錄的fflRNA的剪接變異體編碼的蛋白質。用不精確的分析方法(如凝膠電泳)測得的聚合物分子量及長度應被理解為近似值。當這些值用"大約"X或"近似"X表示時，應理解為X的值精確到±10%。文中所引用的所有文獻均全文用作參考。本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)了一個新的DNA序列，該序列編碼具有四螺旋束細胞因子結構的蛋白質。通過本文詳細描述的克隆、增殖測定和結合研究，已鑒定出一個編碼新的配體多肽的多核苷酸序列，所說的配體對以前描述的孤獨秉體zalphall有高度特異性。這種稱為zalphall配體的多肽配體從活化的人外周血細胞(hPBC，用于篩選CD3)的產生cDNA文庫中分離的。CD3是淋巴樣來源細胞，特別是T細胞所特有的細胞表面標記。在下列實施例中，使用在沒有其它生長因子情況下依賴zalphall孤獨受體相關聯(lián)的存活和生長途徑的細胞系，篩選編碼zalphall配體的cDNA源。用于轉染和表達zalphall受體的優(yōu)選的生長因子依賴性細胞系是BaF3(PalaciosandSteimnetz，Cell41:727-734，1985;Mathey-Prevotetal.,Mol.CellBiol.，6:4133-4135，1986)。然而，F(xiàn)DC-PI(Hapeletal.，Blood64:786-790，1984)和M07e(Kissetal.，Leukemia7:235-240，1993)等其它生長因子依賴性細胞系也適用于這一目的。zalphall受體的氨基酸序列表明，所編碼的受體屬于1類細胞因子受體亞族，其中包括但不只限于IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、EPO、TP0、GM-CSF和G-CSF等的受體(參見Cosman，"TheHematopoietinReceptorSuperfamily"，Cytokine5(2):95-106,1993)。共同擁有的PCT專利申請US99/22149中充分描述了zalphall受體。分析zalphall受體mRNA的組織分布顯示，其在淋巴結、外周血白細胞(PBL)、脾、骨髓和胸腺中均有表達。另外，mRNA在衍生于伯基特淋巴瘤的Raji細胞系(ATCCNo.CCL-86)中很豐富。受體的組織分布提示預期的zalphall配體的靶是造血譜系細胞，特別是淋巴樣始祖細胞和淋巴樣細胞。作用于淋巴樣細胞的其它已知四螺旋束細胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7和IL-15(有關綜述可參見Nicolaetal.，AdvancesinProteinChemistry52:1—65，1999;Kelso,A.，Immunol.CellBiol.76:300-317，1998)。CD3+選擇的、PMA/離子霉素刺激的人外周血細胞的條件培養(yǎng)基(CM)支持BaF3細胞的生長(后者表達zalphall受體并依賴于IL-3)。1)未經PMA/離子霉素刺激的細胞或2)未經CD3選擇(有或沒有PMA/離子霉素刺激)的細胞的條件培養(yǎng)基不支持BaF3/zalpha11受體細胞的生長。對照實驗證明，這種增殖活性并不是由于其它已知的生長因子所致，而且這些條件培養(yǎng)基刺激zalphall受體表達細胞增殖的能力可被可溶形式的受體中和。用肉眼觀察培養(yǎng)物和/或用增殖測定法鑒定與CD3+選擇的、PMA/離子霉素刺激的人外周血細胞的CM接觸的表達zalphall受體的BaF3細胞的增殖。許多適用的增殖測定法都是本領域已知的，并且包括還原染料如alamarBlue(AccuMedInternational,Inc.Westlake，Ohio)、3-(4,5-二甲基塞唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑镥(Mosman，J.Immunol.Meth.65:55-63，1983)、3-(4，5-二甲基塞哇-2-基)-5，3-羧甲氧基苯基-2H-四唑錯、2，3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(笨基氨基)羰基]-2H-氫氧化四唑錯，以及氰二甲苯基-氯化四哇錯(其可購自Polysciences，Inc.，Warrington,PA)的測定法；細胞分裂測定法(如檢測3H-胸苷的摻入)；染料排除測定法(例如使用萘黑和錐蟲藍)；染料攝入法(使用二乙酰熒光素)；以及鉻釋放法(一般來說，參見CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,3rd.ed.，Wiley—Liss，1994,該文獻引入本文作為參考)。從CD3+選擇的、PMA-和離子霉素刺激的初級人外周血細胞制備cDNA文庫。將CD3+選擇的，PMA-和離子霉素刺激的人外周血細胞cDNA文庫分成含有多個cDNA分子的集合體，并轉染到宿主細胞系如BHK570細胞(ATCC登記號10314)中。在不含外源生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)被轉染的宿主細胞并收集條件培養(yǎng)基。測定條件培養(yǎng)基刺激被zalphall受體轉染的BaF3細胞的增殖。產生條件培養(yǎng)基的cDNA集合體可刺激BaF3/zalpha11受體細胞，因而可據此鑒定所i兌的cDNA集合體。將此匯集的質粒DNA電穿孔送到大腸桿菌中。從單個菌落分離cDNA并分別轉染到BHK570細胞中。根據BaF3/zalpha11受體增殖測定中的陽性結果筌定陽性克隆，并使用可溶性zalphall受體中和增殖以測試特異性。分離陽性克隆后，序列分析結果表明質粒DNA內所含有的多核苷酸序列是新的。分泌信號序列由氨基酸殘基l(Met)至31(Gly)組成，并且成熟的多肽由氨基酸殘基32(Gln)至162(Ser)組成(如SEQIDNO:2所示)。一般說來，推測細胞因子具有四a螺旋結構，其中螺旋A、C和D在配體-受體相互作用中是最重要的，而且在家族成員間是更高度保守的。參照SEQIDNO:2中所示的人zalphall配體氨基酸序列，對人zalphall配體、人IL-15、人IL-4和人GM-CSF氨基酸序列進行對比后推測zalphall配體螺旋A是由氨基酸殘基41-56限定的，螺旋B是由氨基酸殘基69-84限定的，螺旋C是由氨基酸殘基92-105限定的，并且螺旋D是由氨基酸殘基135-148限定的(參見SEQIDNO:2)。結構分析提示A/B環(huán)是長的，B/C環(huán)是短的，并且C/D環(huán)同樣是長的。該環(huán)結構導致一個上-上-下-下螺旋組織結構。如圖1中所示，半胱氨酸殘基在zalphall配體和IL-15間是絕對保守的。在IL-15和zalphall配體之間保守的半胱氨酸殘基相當于SEQIDNO:2的氨基酸殘基71、78、122和125。某些半胱氨酸殘基的保守情況也見于IL-2、IL-4、GM-CSF和zalphall配體中(相當于圖1所示SEQIDNO:2的氨基酸殘基78和125)。始終一致的半胱氨酸方位進一步證實了四螺旋束結構。如圖1中所示，如SEQIDNO:2中所示的Glu-Phe-Leu序列(殘基136-138)在包括IL-15、IL-2、IL-4、GM-CSF和zalphall配體的家族中也是高度保守的?；诙嘀匦蛄袑Ρ?如圖1所示)對zalphal1配體所作的進一步分析預示，氨基酸殘基44、47和135(如SEQIDNO:2中所示)在zalphall配體與其相關受體的結合中發(fā)揮重要作用。此外，預計的鼠zalphall配體的氨基酸序列與預計的人蛋白質有57%相同?；谌撕褪髗alphall配體序列之間的比較，發(fā)現(xiàn)預計編碼a螺旋A和D的區(qū)域中有充分保守的殘基。SEQIDNO:1中顯示了本文所描述的編碼zalphall配體多肽區(qū)域、結構域基元、殘基的相應多核苷酸。對IL-4和IL-2(兩者都是與zalphal1配體高度相關的)進行了詳細的突變分析。分析小鼠IL-2(Zurawskietal.,EMBOJ.12:5113-5119，1993)顯示，螺旋A和C中的殘基對于與IL-2RP結合是重要的；關鍵的殘基是Asp34、Asn99和Asn,鼠IL-2環(huán)A/B和螺旋B內的多個殘基對于IL-2Rot結合是重要的，而螺旋D中只有單個殘基Glm"是與IL-2Roc結合所必需的。同樣，螺旋A和C是IL-4和IL-4Rct(結構上相似于IL-2Ra)間相互作用的位點，并且螺旋D內的殘基對IL-2Ra和IL-2相互作用是非常重要的(Wangetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:1657-1662，1997;Kruseetal.,EMBOJ.11:3237-3244，1992)。具體地說，人IL-4中的突變Tyr124至Asp產生一種拮抗劑，其與IL-4Ra但不與IL-2Rot結合，因而不能產生信號(Kruseetal.，文獻同上，1992)。雖然人和鼠zalphall配體間螺旋A是相對充分保守的，但螺旋C卻有較大差異。兩個種的該區(qū)域盡管具有占優(yōu)勢的酸性氨基酸，但也有體現(xiàn)zalphall配體與其"P"型受體間相互作用方面的種特異性的序列差異。zalphall配體環(huán)A/B和螺旋B在種間是充分保守的；盡管尚未鑒定出相當于IL-2Ra的受體亞單位，但貫穿該區(qū)域的保守性提示其在功能上是重要的。人和鼠zalphall配體的D螺旋也是高度保守的。可以通過zalphall配體螺旋D內的突變來設計zalphall受體拮抗劑。這些突變可以包括從殘基Gln145(SEQIDNO:2)截短蛋白質，或者將Gln"s或Ile""SEQIDNO:2的；相當于人IL-4中的Tyr124)突變成諸如Ala或Asp的殘基。破壞zalphall配體螺旋結構的任何突變均可消除與其受體的結合，并因而抑制信號轉導。也根據其組成螺旋的長度對四螺旋束細胞因子進行分組。"長螺旋"形式的細胞因子一般由24-30殘基的螺旋組成，其中包括IL-6、睫狀神經營養(yǎng)因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)和人生長激素(hGH)。"短螺旋"形式的細胞西子一般由18-21殘基的螺旋組成，其中包括IL-2、IL-4和GM-CSF。據信zalphall配體是短螺旋形式細胞因子組的新成員。使用CNTF和IL-6進行的研究證明，可以將CNTF螺旋換成IL-6中的等同螺旋，使嵌合體具有CNTF結合性質。為此，可基于結構同源性確定四螺旋細胞因子的功能區(qū)，而不必考慮序列同一性，并且可保持嵌合體內的功能完整性(Kallenetal.,J.Biol.Che邁.274:11859-11867，1999)。因此，可將zalphall配體的螺旋區(qū)用于制備嵌合融合分子(特別是與其它短螺旋形式的細胞因子融合)，以確定并調節(jié)受體結合特異性。其中特別感興趣的是用螺旋A和/或螺旋D改造的融合蛋白，以及結合其它短形式細胞因子如IL-2、IL-4、IL-15和GM-CSF的螺旋和環(huán)區(qū)域的融合蛋白質。表l中顯示包括zalphall配體、IL-2、IL-4、IL-15和GM-CSF的螺旋A、B、C和D,以及環(huán)A/B、B/C和C/D的氨基酸殘基。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本發(fā)明提供編碼本文所公開的zalphall配體多肽的，包括RNA和DNA分子在內的多核苷酸分子。本領域技術人員很容易意識到，由于遺傳密碼的簡并性，這些多核苷酸分子中可能有相當大的序列變異。SEQIDNO:3是包括編碼SEQIDNO:2的zalphall配體多肽的所有DNA的筒并DNA序列。本領域技術人員將會認識到，用U取代T后SEQIDNO:3的簡并序列也提供編碼SEQIDNO:2的所有RNA序列。因此，本發(fā)明包括其中含有SEQIDNO:3的核苷酸1或97至核苷酸486的編碼zalphall配體多肽的多核苷酸及其RNA等同物。表2列出用于表示SEQIDNO:3內簡并核苷酸位置的一字母代碼。"分辨"是給出由代碼字母表示的核苷酸。"補碼"表示互補核苷酸的代碼。例如，代碼Y代表C或T,其補碼R代表A互或G，其中A互補于T，而G互補于C。表2r酸分辨補碼分辨AATTCCGGGGCCTTAARA|GYC|TYC|TRA|GMA|CKG|TKG|TMA|CSC|GS_C|GWA|TWA|THA|C|TDA|G|TBC!GITVA1C|GVA|C|GBC|G|TDA|G1THAIC!TNA|C|G|TNA|C1G|T用于SEQIDNO:3中的筒并密碼子包括所給出的氨基酸的所有可能的密碼子(如表3所示)。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本領域技術人員將會認識到，在確定代表編碼每個氨基酸的所有可能密碼子的簡并密碼子時引入某種雙關性。例如，絲氨酸的簡并密碼子(WSN)在某些情況下可編碼精氨酸(AGR)，并且精氨酸的簡并密碼子(MGN)在某些情況下可編碼絲氨酸(AGY)。編碼苯丙氨酸和亮氨酸的密碼子之間也存在相似的關系。因此，由筒并序列所包括的某些多核苷酸可編碼變異的氨基酸序列，但本領域技術人員可以參照SEQIDNO:2的氨基酸序列很容易地鑒別這樣的變異序列。如本文所述可以很容易地試驗變異序列的功能性。本領域普通技術人員也會認識到，不同的種可展示"優(yōu)先密碼子選擇"(總地參見Grantham,etal.,Nuc.AcidsRes.8:1893-912，1980;Haas,etal.，Curr.Biol.6:315-24,1996;Wain-Hobson，etal.，Gene13:355—64，1981:GrosjeanandFiers，Gene18:199-209，1982;Hol扭，Nuc.AcidsKes.14:3075-87,1986;Ikemura，J.Mol.Biol.158:573-97，1982)。本文使用的術語"優(yōu)先密碼子選擇"或"優(yōu)先密碼子"是一個有關蛋白質翻譯密碼子的術語，所說的密碼子最常用于某些種的細胞中，因此偏愛編碼各氨基酸的可能的密碼子之一或幾個代表(參見表3)。例如，蘇氨酸(Thr)可以由ACA、ACC、ACG或ACT編碼，但在哺乳動物細胞中最常使用的密碼子是ACC;在其它物種中，如在昆蟲細胞、酵母、病毒或細菌中可優(yōu)選不同的Thr密碼子。可以用各種已知的方法將特定種的優(yōu)先密碼子引入到本發(fā)明的多核苷酸中。例如，在重組DNA中引入優(yōu)先密碼子序列可使特定細胞類型或物種內的蛋白質翻譯更為有效，從而提高蛋白質的生產。因此，SEQIDNO:3中公開的筒并密碼子序列可用作在本領域中常用的和本文中所公開的各種細胞類型和物種中最佳化表達多核苷酸的模板?？梢园凑毡疚乃龇椒ㄔ囼灪袃?yōu)先密碼子的序列并優(yōu)化在各種生物體中的表達，然后試驗其功能性。如上文提到的，本發(fā)明的分離的多核苷酸包括DNA和RNA。制備DNA和RNA的方法是本領域已知的。一般說來，從大量產生zalphall配體RNA的組織或細胞中分離RNA。用Northern印跡法(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:5201,1980)或根據對乾細胞或組織的活性篩選各種類型細胞的條件培養(yǎng)基，以筌定這樣的組織和細胞。一旦鑒定了RNA生產細胞或組織的活性，即可使用異硫氰酸胍提取和其后的CsCl梯度離心分離方法(Chirgwinetal.，Biochemistry18:52-94，1979)制備總RNA。使用Aviv和Leder(Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:1408-12，1972)的方法從總RNA中制備poly(A)+RNA。使用已知方法從poly(A)+RNA制備互補DNA(cDNA)?；蛘撸部梢苑蛛x基因組DNA。然后鑒定編碼zalphall配體多肽的多核苷酸并用雜交或PCR等方法分離之。可以用常規(guī)克隆方法得到編碼zalphall配體的全長度克隆。制備互補DNA(cDNA)，但對某些應用(如在轉基因動物中表達)來說使用基因組克隆，或者修飾cDNA克隆使之包括至少一個基因組內含子可能是優(yōu)選的。制備cDNA和基因組克隆的方法是已知的并且是在本領域普通技術水平之內，并包括使用本文公開的用于探查或引導文庫的序列或其部分?？梢杂每箊alphall受體片段的抗體或其它特異性結合配偶體探查表達文庫。也可以使用本文乂>開的zalphall配體多核香酸序列作為克隆zalphall配體基因的5'非編碼區(qū)的探針或引物。鑒于就zalphall配體所觀察到的組織特異性表達，希望該基因區(qū)提供造血和淋巴樣細胞特異性表達。為此可使用zalphall配體基因的啟動子元件指導外源基因例如在轉基因動物或待進行基因治療的病人中的組織特異性表達。5'側翼序列的克隆也通過如美國專利5,641,670中公開的"基因活化"而有利于產生zalphall配體蛋白質。簡單地說，可將至少含有導向序列、調節(jié)序列、外顯子和未配對剪接供體位點的DNA構建物導入zalphall配體基因座，以改變內源zalphall配體基因在細胞中的表達。導向序列是允許構建物與內源zalphall配體基因座同源重組的zalphall配體5'非編碼序列，因而構建物內的序列即可與內源zalphall配體編碼序列可操作地連接。的或受到其它方面調節(jié)的表達。本發(fā)明進一步提供來自其它種的對應物多肽和多核苷酸(直向同源物)。這些物種包括但不只限于哺乳動物、鳥、兩棲動物、爬行動物、魚、昆蟲及其它脊推動物和無脊推動物。特別令人感興趣的是來自其它種哺乳動物如鼠、豬、綿羊、牛、狗、貓、馬及其它靈長類的zalphall配體多肽?？梢允褂帽景l(fā)明提供的信息和組合物連同常規(guī)克隆技術克隆人zalphall配體的直向同源物(orthologs)。例如，可使用本文所述的得自表達zalphall配體的組織或細胞類型的mRNA克隆cDNA?？梢杂酶鶕疚乃鲂蛄性O計的探針探查Northern印跡，以鑒定mRNA的適當來源。然后從陽性組織或細胞系的mRNA制備文庫。用各種方法例如用完整的或部分的人cDNA或用一組或多組基于已公開序列的簡并探針探查，以分離編碼zalphall配體的cDNA。也可以使用根據本文公開的代表性人zalphall配體序列設計的引物，利用聚合酶鏈反應(PCR)(Mullis,美國專利4，683，202)克隆cDNA。在附加的方法中，可以使用cDNA文庫轉化或轉染宿主細胞，并用抗zalphall配體多肽的抗體、結合研究或活性測定法檢測令人感興趣的cDNA的表達。也可用相似的技術分離基因組克隆。已鑒定了zalphall配體的小鼠直向同源物的多核苷酸序列并示于SEQIDNO:55中，相應的氨基酸序列則示于SEQIDNO:56中。在相當于zalphall配體的SEQIDNO:2中的殘基30-153和SEQIDNO:56中的殘基23-146的124個氨基酸區(qū)域內，小鼠和人序列之間有62%同一性。小鼠zalphall配體的成熟序列推測開始于His^(如SEQIDNO:56中所示)，其相當于人序列中的His25(如SEQIDN0:2中所示)。因為截短形式的人多肽是有活性的，所以小鼠zalphall配體的等價多肽(即沒有SEQIDNO:56的殘基His18-Pro2》很可能也是有活性的。組織分析表明，小鼠zalphall配體的表達見于睪丸、脾和胸腺中。本領域技術人員將會認識到，SEQIDNO:1中公開的序列代表人zalphall配體的單個等位基因，并可望發(fā)生等位基因突變和可變剪接?？砂凑諛藴史椒ㄌ讲閬碜圆煌瑐€體的cDNA或基因組文庫，以克隆序列的等位基因變異體。SEQIDNO:1所示DNA序列的等位基因變異體，包括含有沉默突變的變異體和其中突變導致氨基酸序列改變的變異體均在本發(fā)明范圍內，SEQIDNO:2的作為等位基因變異體的蛋白質也在本發(fā)明范圍內。由可變剪接的mRNA產生的cDNA(其保留zalphall配體多肽的性質)及由這些cDNA和mRNA編碼的多肽包括在本發(fā)明范圍內?？梢杂帽绢I域已知的標準方法探查不同個體的cDNA或基因組文庫，以克隆這些序列的等位基因變異體和剪接變異體。已針對IL-2構架標志SHGC-12342繪制了zalphall配體基因圖，其中zalphall配體距IL-2標志約180Kb。4吏用周邊標志將zalphall配體基因定位于整合的LDB染色體4圖譜上的4q27區(qū)中(TheGeneticLocationDatabase,UniversityofSouthhampton)。本發(fā)明還提供可用于診斷目的的試劑。例如，可使用zalphall配體基因、包含zalphall配體DNA或RNA的探針或其亞序列確定zalphall配體基因是否存在于人染色體(如染色體4)上，或確定是否發(fā)生了基因突變?；诤胁糠謟alphall配體基因組DNA的人基因組DNA片段(Genbank登記號AC007458)的注釋，zalphall配體定位于染色體4的4q27區(qū)。zalphall配體基因基因座的可檢測染色體畸變包括但不只限于非整倍性、基因拷貝數(shù)改變、異質性丟失(LOH)、易位、插入、缺失、限制性位點改變以及重排。可以使用本發(fā)明的多核苷酸，以限制性片段長度多態(tài)性(PFLR)分析、利用PCR技術的短串聯(lián)重復(STR)分析和本領域已知的其它遺傳連鎖分析技術(Sambrooketal.，文獻同上；Ausubeletal.，文獻同上；Marian,Chest108:255-65，1995)等分子遺傳學技術檢測這些畸變。有關基因位置的確切知識可用于許多目的，其中包括l)檢測某序列是否為已有重疊群的一部分，并獲得各種形式的附加周邊遺傳序列，如YAC、BAC或cDNA克隆；2)提供與同一染色體區(qū)相聯(lián)系的遺傳病可能的候選基因；3)交叉參考可能有助于確定特定基因會有什么功能的模型生物，如小鼠。如前所述，人zalphall配體基因位于IL-2基因附近，其存在于已證明與在某些家族中炎性腸道疾病(IBD)(包括Crohn氏病(CD)和潰瘍性結腸炎)易感性有聯(lián)系的染色體4q區(qū)域中(Hampeetal.，Am.J.Hum.Genet.64:808—816，1999;Choetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.95:7502-7507，1999)。另外，zalphall受體基因定位于與CD易感性有關的另一個基因組區(qū)域-16p11(Hugotetal.，Nature379:821-823，1996;Ohmenetal.，Hum.Mol.Genet.5:1679-1683，1996)。CD是一種常常有全身癥狀發(fā)生的慢性腸道炎癥；雖然有關的確切病因學尚不明了，但已知包括對普通腸道抗原沒有耐受性在內的免疫調節(jié)功能異常是一個主要方面(如參見Braeggeretal.，AnnalsAllergy72:135-141，1994;Sartor,Am.J\Gastroenterol.92:5S-11S，1997)。一些研究發(fā)現(xiàn)，CD病人的NK活性異常(如參見Egawaetal.,J\Clin.Lab.ImnumoL20:187-192，1986;Aparicio-Pag6setal.，丄Clin.Ub.Immunol.29:119-124,1989;vanToletal.,Scand.J.Gastroenterol.27:999-1005，1992)，并且缺損記憶B細胞形成已有文獻記載(Broganetal.,J.Clin.Lab.Immunol24:69-74，1987)。因為zalphall配體在免疫調節(jié)中發(fā)揮作用，并且受體和配體的基因都位于CD易感性區(qū)域內，所以受體和配體都是確定Crohn氏病遺傳誘因的候選基因?？梢杂脦追N方法來確定zalphall受體和/或zalphall配體在IBD病理學中的巻入情況。如可以對cDNA測序一樣，測定基因組DNA中外顯子的序列可以揭示編碼序列的突變(包括錯義、無義和移碼突變)。測定基因組DNA序列的再一個優(yōu)點是測序的片段內也含有剪接點，并且可揭示剪接異常(例如，如果誤剪接的RNA被迅速降解，則剪接點不可能出現(xiàn)于cDNA樣品中)。已確定了zalphall配體的基因組結構。分析IBD病人體內zalphall配體和受體的其它方法包括(l)估測由病人的活化T細胞的配體產生并與正常對照組比較(即通過生物測定)；(2)zalphall受體或zalphall配體RNA與IBD病人的發(fā)炎腸組織切片進行原位雜交，并與正常對照組的相似切片相比較；(3)對IBD病人的切片進行免疫組織化學分析，并與正常對照組比較；(4)用細胞分裂測定法估測病人的外周血B細胞對zalphall配體的反應性。診斷可有助于醫(yī)師確定疾病類型和適當?shù)南嚓P治療方案，或者可有助于提供遺傳咨詢。本發(fā)明的抗zalphall配體抗體、多核苷酸和多肽可用于檢測zalphall配體多肽、mRNA或抗zalphall配體抗體，從而作為標記物并使用本領域已知的和本文所述的方法，將其直接用于檢測遺傳病或癌癥。此外，可以使用zalphall配體多核苷酸探針檢測涉及本文所述染色體4q27的異常。這些異?？赡芘c人類疾病，或肺瘤發(fā)生、自發(fā)流產或其它遺傳病有關。因此，可使用zalphall配體多核苷酸探針檢測與異?；蜻@些缺陷有關的基因型。如上所述，zalphall配體基因本身的缺陷可能導致人的可遺傳疾病。本發(fā)明的分子，如本發(fā)明的多肽、拮抗劑、激動劑、多核苷酸和抗體將會有助于檢測、診斷、預防和治療與zalphall配體遺傳缺陷有關的疾病。另夕卜，可使用zalphall配體多核香酸探針檢測zalphall配體染色體基因座上患病或未患病個體間的等位基因差異。這樣，即可使用zalphall配體序列作為法醫(yī)學DNA分布型分析的診斷試劑。一般說來，用于遺傳連鎖分析，以檢測病人遺傳異常和畸變的診斷方法是本領域已知的。大多數(shù)診斷方法包括以下步驟(i)從潛在患病病人、患病病人或隱性疾病等位基因的潛在未患病攜帶者得到遺傳樣品；(ii)將遺傳樣品與zalphall配體多核苷酸探針一起溫育以產生第一反應產物，其中例如在RFLP分析中多核苷酸將與互補多核苷酸序列雜交，或者于適當?shù)腜CR反應條件下使遺傳樣品在PCR反應中與有義和反義引物一起溫育；(iii)以凝膠電泳法和/或其它已知的方法顯現(xiàn)第一反應產物，例如用zalphall配體多核苷酸探針顯現(xiàn)第一反應產物，其中多核苷酸將與第一反應的互補多核苷酸序列雜交；以及(iv)將顯現(xiàn)的第一反應產物與來自正常或對照個體的遺傳樣品的第二對照反應產物相比較。第一反應產物和對照反應產物間的差異即指示患病或潛在患病病人有遺傳異常，或存在未患病病人的雜合隱性攜帶者表型，或存在患病病人的胂瘤遺傳缺陷，或存在胎兒或植入前胚胎的遺傳異常。例如，限制性片段圖形、PCR產物長度、zalphall配體遺傳基因座上重復序列的長度等的差異都是遺傳異常、遺傳畸變的指征，或者顯示有不同于正常對照的等位基因差異。依據試驗和樣品可利用性的不同，對照樣品可得自未受影響的家族成員或無關的個體。本發(fā)明中使用的遺傳樣品包括從病人的組織或其它生物學樣品例如血液、唾液、精液、胚胎細胞、羊水等分離的基因組DNA、mRNA和cDNA。多核苷酸探針或引物可以是RNA或DNA，并將包括SEQIDNO:l的一部分(SEQIDNO:l的互補體)，或其RNA等同物。這些顯示對人疾病表型進行遺傳連鎖分析的方法是本領域已知的。有關基于PCR的診斷方法一般可參見Mathew(ed.)，尸rotoco/s7'/7〃w邁a/zifo7ecw_/arCe"etics(HumanaPress,Inc.1991)，White(ed.),戶6V尸rotoco/s:^/rjre"tifet力oo(s1aW4w7/c3tj'o/51(HumanaPress,Inc.1993),Cotter(ed.)，#o_ZecWjar/7/a卵osisCa/cer(HumanaPress,Inc.1996),HanausekandWalaszek(eds.)，r咖ar船i"Aer尸rotoco7s(HumanaPress,Inc.1998)，Lo(ed.)，67!'/7ica74p/7hca"o/zsTO(HumanaPress,Inc.1998),和Meltzer(ed-)，PCRinBioanalysis(HumanaPress,Inc.1998))?？砂凑罩苯油蛔兎治龅臉藴史椒?，例如限制性片段長度多態(tài)性分析法、利用PCR技術的短串聯(lián)重復分析法、擴增不應突變系統(tǒng)分析法、單鏈構象多態(tài)性檢測法、RNA酶切割法、變性梯度凝膠電泳法、熒光輔助的錯配分析法以及本領域已知的其它遺傳分析技術(如參見Mathew(ed.)，尸2""oco/si>7〃咖朋ifo7ecw7arGe/zetics(humanaPress,Inc.1991);Marian,C力e"層:255(1995)，ColemanandTsongalis，M7ec〃7arZi"a卵o"jfc5"(HumanPress,Inc*1996);Elles(ed.)#o7ec^ar"ia卵osiso/Ge/2e"c/leases(HumanaPress,Inc.1996);Landegren(ecL)，Z^6aratar尸rotoco7s/br齒ts"o/7(OxfordUniversityPress1996);Birren"a義(eds.),6"e/o巡e力/a7ysis,Ko丄2.'Zetecti/7gCe/7es(ColdSpringHarborLaboratoryPress1998);Dracopolia丄(eds.)，6Vrre"t/^r"(9co7s//7〃咖朋(7e/e"cs(Johnffiley&Sons1998)，以及RichardsandWard,"MolecularDiagnosticTesting,"in/^r!'/2ci^7esUec〃7arUjfci7ze，pages83-88(HumanaPress,Inc.1998))，使用本發(fā)明的核酸分子檢測與zalphall配體基因座有關的突變?？墒褂檬茉囌叩幕蚪MDNA直接分析zalphall配體基因的突變。擴增例如從外周血淋巴細胞得到的基因組DNA的方法是本領域技術人員已知的(如參見Dracopolietal.(eds)，CurrentProtocolsinHumanGenetics,page7.1.6—7.1.7(JohnWiley&Sons,1998))。鑒定基因組克隆，然后測定內含子/外顯子接點的序列，以確定zalphall配體基因中內含子的位置。第一個內含子位于SEQIDNO:2中氨基酸殘基56(Leu)和殘基57(Val)之間，長度為115個堿基對。第二個內含子最長，位于SEQIDNO:2中氨基酸殘基68(Glu)和殘基69(Thr)之間，長度為4.4千堿基。第三個內含子位于SEQIDNO:2中氨基酸殘基120(Leu)和殘基121(Thr)之間，長度為2.6千堿基。最后一個內含子位于SEQIDNO:2中氨基酸殘基146(Lys)和殘基147(Met)之間，長度為89個堿基對。完整基因跨越約8Kb。zalphall配體基因的結構相似于IL-2基因的結構(Fujitaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.80:7437-7441，1983),但zalphall配體基因含有一個附加內含子(內含子4)。雖然IL-2基因的總長度稍小(約6Kb)，但短的第一內含子和長的第二與第三內含子的模式在兩基因之間是保守的。另一方面，IL-15基因由8個外顯子組成并跨越至少34Kb(Andersonetal.，Genomics25:70卜706，1995)。因此，zalphall配體基因在結構上更相似于IL-2基因，然后才是相似于IL-15基因。在本發(fā)明的實施方案中，編碼分離的zalphall配體的核酸分子在嚴格條件下可與具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的核酸分子雜交，與具有SEQIDNO:1所示核苷酸47-532的核苷酸序列的核酸分子雜交，或與具有互補于SEQIDNO:1的核苷酸序列的核酸分子雜交。一般說來，所選擇的嚴格條件是在限定的離子強度和pH下，比特定序列的熱熔點(Tn)大約低5*C。T是50%的靶序列與完全匹配的探針相雜交的溫度(在限定的離子強度和pH下)。如果核苷酸序列有某種程度的互補性，則一對核酸分子如DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA即可雜交。雜合體可以耐受雙螺旋中的錯配堿基對，但雜合體的穩(wěn)定性受到錯配程度的影響。每l一l.5%堿基對錯配，錯配雜合體的TL降低ix:。改變雜交條件的嚴格性可以控制存在于雜合體中的錯配的程度。嚴格性程度隨著雜交溫度升高和雜交緩沖液的離子強度降低而增加。適用于特定多核苷酸雜合體的雜交條件是本領域技術人員能夠掌握的。特定靶序列的L是50%耙序列與完全匹配的探針序列雜交的溫度(在限定的條件下)。影響L的條件包括多核苷酸探針的大小和堿基對含量、雜交溶液的離子強度，以及雜交溶液中去穩(wěn)定劑的存在。計算L的許多公式是本領域已知的，并且對于不同長度的DNA,RNA和DNA-RNA雜合體及多核苷酸探針序列是特異的(如參見Sambrooketa丄,ifo7ecw7ar67oz7jf"f力Z^Aarafar7i/朋w3力SecondEdition(ColdSpringHarborPress1989);Ausubels丄，(eds.),Ckrre/t尸rotocoJsj'/ifojecf/7ar^.o7o^y(JohnWileyandSons,Inc.1987);BergerandKimmel(eds.)，"wVeto#oJecw_/ar67o/j77《fecAm.gT/es,(AcademicPress,Inc.1987);和Wetmur，Cr"./Per.^2'0cAe肌#。丄腸丄激227(1990))。0LIG06.0(LSR:LongLake,MN)和PrimerPremier4.0(PremierBiosoftInternational;PaloAlto,CA)等序列分析軟件，以及互聯(lián)網上的站點是分析給定的序列和基于使用者限定的標準計算L的可利用的工具。這些程序也可以在限定的條件下分析給定的序列并鑒定適當?shù)奶结樞蛄小Ｒ话阏f來，在低于計算的L大約20-25X:的溫度下進行較長多核苷酸序列(〉50個堿基對)的雜交。對于較小的探針(<50個堿基對)，一般在L或低于計算的L約5-10X:的溫度下進行雜交。這樣可使DNA-DNA和DNA-RNA雜合體有最大雜交率。雜交后，可在嚴格或高度嚴格條件下洗滌核酸分子，以除去未雜交的核酸分子。典型的嚴格洗滌條件包括于55-65X:在含有0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)的0.5x-2xSSC溶液中洗滌。也就是說，在嚴格洗滌條件下編碼變異體zalphall配體多肽的核酸分子與具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列(或其補碼)的核酸分子雜交，其中洗滌嚴格性相當于55-65"C下含有0.1%SDS的0.5x-2xSSC,包括55"C下含有0.1%SDS的0.5xSSC,或65"C下含有0.1%SDS的2xSSC。本領域技術人員可以很容易地設計等同的條件，例如用SSPE取代洗滌溶液中的SSC。典型的高度嚴格洗滌條件包括于50-65C在含有0.1%SDS的0.1x-O.2xSSC溶液中洗滌。換句話說，編碼變異體zalphall配體多肽的核酸分子在高度嚴格洗滌條件下與具有SEQIDNO:1的核苷酸序列(或其補碼)的核酸分子雜交，其中洗滌嚴格性相當于50-65C下含有0.1%SDS的0.1x-O.2xSSC,包括50°C下含0,1%SDS的0.1xSSC,或65"C下含0.1%SDS的0.2xSSC。本發(fā)明還提供具有與SEQIDNO:2的多核苷酸基本上相似序列同一性的分離的zalphall配體多肽，或它們的直向同源物。本文使用的術語"基本上相似序列同一性"是指包括與SEQIDNO:2中所示序列至少70%,至少80%,至少90%,至少95%或大于95%序列同一性的多肽，或它們的直向同源物。本發(fā)明還包括含有與SEQIDNO:2中氨基酸殘基1-162或33-162序列有至少70%,至少80%，至少90%,至少95%或大于95%序列同一性的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明進一步包括編碼所說多肽的核酸分子。確定百分同一性的方法如下文所述。本發(fā)明還包括可^t用下列兩個標準筌定的變異體zalphall配體核酸分子確定被編碼的多肽與SEQIDNO:2的氨基酸序列之間的相似性，和/或如上所述的雜交測定。所說的zalphall配體變異體包括這樣一些核酸分子(1)在嚴格洗滌條件與具有SEQIDNO:1核苷酸序列(或其補碼)的核酸分子雜交，其中洗滌嚴格性相當于55-65匸下含有0.1%SDS的0.5x-2xSSC,或(2)編碼與SEQIDNO:2的氨基酸序列有至少70%，至少80%,至少90%,至少95%或大于95%序列同一性的多肽?；蛘?，zalphall配體變異體也可表征為這樣的核酸分子(l)在高度嚴格洗滌條件下與具有SEQIDNO:1的核苷酸序列(或其補碼)的核酸分子雜交，其中洗滌嚴格性相當于50-65"C下含有0.1%SDS的0.1x-0.2xSSC，以及(2)編碼與SEQIDNO:2的氨基酸序列有至少70%，至少80%,至少90%,至少95%或大于95%序列同一性的多肽。用常規(guī)方法確定百分序列同一性(例如參見Altschuletal.，Bull.Math.Bio.48:603，1986;和HenikoffandHenikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915，1992)。簡單地說，如表4中所示，使用缺口開放罰10，缺口延伸罰1，和Henikoff和Henikoff(文獻出處同上)的"BL0SUM62"評分矩陣對比兩個氨基酸序列，以最佳化序列對比評分(氨基酸以標準的一字母代碼表示)。相同匹配的總數(shù)-x100<image>imageseeoriginaldocumentpage27</image>本領域技術人員認識到有許多已建立的算法可用于對比兩個氨基酸序列。Pearson和Lipman的"FASTA"相似性檢索算法是用于檢查本文所公開的氨基酸序列和推斷的變異體zalphall配體氨基酸序列共享的同一性水平的適宜的蛋白質序列對比方法。有關FASTA算法可參見PearsonandLimpman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)和Pearson,Meth.Enzymol.183:63(1990)。簡單地說，F(xiàn)ASTA首先在不考慮保守性氨基酸取代、插入或缺失的情況下，鑒定由詢問序列(如SEQIDNO:2)和具有最高密度同一性(如果Ktup變量是1)或部分同一性(如果Kt叩二2)的試驗序列所共享的區(qū)域。然后使用氨基酸取代矩陣比較所有成對氨基酸的相似性，并"修整"區(qū)域的末端以只包括對最高評分有貢獻的那些殘基，對有最高密度同一性的十個區(qū)域重新評分。如果有幾個分數(shù)大于"截止"值(基于序列長度和Kt叩值，用預定的公式計算的)的區(qū)域，則檢查經修整的起始區(qū)域以確定這些區(qū)域是否可以連接形成帶有缺口的近似的順序。最后，使用改良的Needleman-Wunsch-Sellers算法(NeedlemanandWunsch，J.Mol.Biol.48:444(1970);Sellers,SIAMJ.Appl.Math.26:787(1974))對比兩個氨基酸序列的最高評分區(qū)域(其允許氨基酸插入和缺失)。FASTA分析的優(yōu)選參數(shù)是Kt叩二l,缺口開放罰二10，缺口延伸罰=1，取代矩陣二BL0S廳2。如Pearson,Meth*EnzymoL183:63(1990)附錄2中所述，經改良評分矩陣存儲器("SMATRIX")可將這些參數(shù)引入FASTA程序中。也可按上述比例，使用FASTA確定核酸分子的序列同一性。為了進行核苷酸序列比較，可使Kt叩值定在l-6，優(yōu)選3-6，最優(yōu)選3，其它參數(shù)定為不存在。變異體zalphall配體多肽或有基本上相似序列同一性的多肽的特征為帶有一個或多個氨基酸取代、缺失和加入。這些改變最好是不重要性質的，即不顯著影響多肽折疊或活性的保守氨基酸取代(見表5)及其它取代；小的缺失，一般為1-30個氨基酸的缺失；以及氨基或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸殘基、多達約20-25個殘基的小的接頭肽，或親和標記。因此本發(fā)明包括有大約108-216個氨基酸殘基的多肽，其包含一個與SEQIDN0:2的相應區(qū)域有至少70%,優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選95%或更高同一性的序列。含有親和標記的多肽可在zalphall配體多肽和親和標記之間進一步包括蛋白酶剪切位點。優(yōu)選的這類位點包括凝血酶剪切位點和因子Xa剪切位點。表5保守氨基酸取代堿性精氨酸賴氨酸組氨酸酸性谷氨酸天冬氨酸極性谷氨酰胺天冬酰胺疏水亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸蛋氨酸可以確定含有對于維持結構完整性十分重要的區(qū)域或結構域的氨基酸殘基。在這些區(qū)域內，可確定對于改變和維持分子的整體四級結構有較大或較小耐受性的特定殘基。分析序列結構的方法包括但不只限于有高氨基酸或核苷酸同一性、二級結構傾向、二進制模式、互補巻曲和隱蔽極性相互作用的多重序列的對比(Barton,CurrentOpin.Struct.Biol.5:372-376，1995和Cordesetal.，CurrentOpinStruct.Biol.，6:3-10，1996)。一般說來，當設計對分子的修飾或鑒定特定片段時，可以通過估計被修飾分子的活性來確定結構。在zalphall配體多肽中造成氨基酸序列改變，從而盡量減小對維持生物學活性必不可少的高級結構的破壞。例如，當zalphall配體多肽包括一個或多個螺旋時，將造成氨基酸殘基的改變，以便不破壞螺旋幾何結構及分子的其它組成成分(構象改變可消除某些重要功能，例如，分子與其結合對象如A和D螺旋、SEQIDNO:2的殘基44、47和135的結合)。例如可用如上所公開的計算機模型設計來推測或通過分析晶體結構(如參見L鄧thornetal.,Nat.Struct.Biol，2:266-268，1995)來確定氨基酸序列改變所造成的影響。本領域已知的其它技術是將變異體蛋白質的折疊與標準分子(如天然蛋白質)相比較。例如，可以將變異體中的半胱氨酸模式與標準分子相比較。質譜和使用還原及烷基化的化學修飾方法可用于確定與二硫鍵有關聯(lián)或沒有這種關聯(lián)的半胱氨酸殘基(Beanetal.，Anal.Biochem.201:216-226，1992;Gray,ProteinSci.2:1732-1748，1993;和Pattersonetal.，Anal.Chem.66:3727-3732，1994)。一般認為，如果被修飾的分子沒有與標準分子相同的半胱氨酸模式，則折疊就會受到影響。檢測折疊的另一個已知的和公認的方法是園二色性(CD)。檢測和比較由修飾的分子和標準分子產生的CD譜屬于常規(guī)技術(Johnson,Proteins7:205-214，1990)。晶體學是分析折疊和結構的另一種已知方法。核磁共振(NMR)、消化肽作圖和表位作圖也是分析蛋白質和多肽之間的折疊和結構相似'逸的已知方法(Schaananetal.，Science257:961-964，1992)?？梢援a生如SEQIDNO:2中所示zalphall配體蛋白質序列的Hopp/Woods親水性分布圖(Hoppetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.78:3824-3828，1981;Hopp，J.I咖un，Meth.88:1-18，1986和Triquieretal.，ProteinEngineering11:153-169，1998)。該分布型是基于滑動6殘基窗口。不考慮隱蔽的G、S和T殘基以及暴露的H、Y和W殘基。例如，在zalphall配體中，親水區(qū)域包括SEQIDNO:2的氨基酸殘基114-119、101-105、126-131、113-118和158-162。本領域技術人員將會意識到，當按照設計對zalphall配體多肽的氨基酸序列進行修飾時應考慮到親水性和疏水性問題，以便不破壞總體結構和生物學分布型。特別感興趣的取代是選自Val、Leu和lie,或選自Met、Gly、Ser、Ala、Tyr和Trp的疏水殘基。例如，對取代有耐受能力的殘基可包括SEQIDNO:2中所示的殘基100和103。SEQIDNO:2中位置71、78、122和125上的半胱氨酸殘基相對地不耐受取代?？梢苑治鯥L_15、IL-2、IL-4和GM-CSF與zalphall配體之間的序列相似性，以推導出必需氨基酸的同一性。使用如前所述的"FASTA"分析等方法，鑒定蛋白質家族內的高度相似性區(qū)域并用于分析保守區(qū)的氨基酸序列?；诮Y構來鑒定變異體zalphall配體多核苷酸的另一種可代用方法是如上所討論的，確定編碼潛在變異體zalphall配體基因的核苷酸分子是否可與具有SEQIDNO:1的核苷酸序列的核酸分子雜交。鑒定本發(fā)明的多肽中必需氨基酸的其它方法是本領域已知的，例如位點特異性誘變或丙氨酸掃描誘變(CunninghamandWells,Science244:1081(1989);Bassetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4498(1991);CoombsandCorey,"Site-DirectedMutagenesisandProteinEngineering"，inProteins:AnalysisandDesign,Angeletti(ed.)，pp.259—311(AcademicPress,Inc.，1998))。在后一種技術中，在分子的每個殘基處引入單個丙氨酸突變，并按下述方法試驗所得到的突變分子的生物學或生物化學活性，以鑒定對于分子的活性必不可少的氨基酸殘基(也參見Hiltonetal.，J.Biol.Chem.271:4699(1996))。本發(fā)明還包括zalphall配體多肽的功能性片段和編碼這些功能性片段的核酸分子。本文所限定的"功能性"zalphall配體或其片段的特征在于其增殖或分化活性、其誘導或抑制特化的細胞功能的能力，或其與抗zalphall配體抗體或zalphall受體(可溶性的或固定化的)特異性結合的能力。如上文所述，zalphall配體的特征在于包括與SEQIDNO:2中所示的螺旋A(氨基酸殘基41-56)、螺旋B(氨基酸殘基69-84)、螺旋C(氨基酸殘基92-105)和螺旋D(氨基酸殘基135-148)的四螺旋束結構。因此，本發(fā)明進一步提供包括(a)含有一個或多個上述螺旋的多肽分子；和(b)含有一個或多個上述螺旋的功能性片段的融合蛋白質。該融合蛋白質的其它多肽部分可來源于另一種四螺旋束細胞因子如IL-15、IL-2、IL-4和GM-CSF，或者來源于有利于融合蛋白質分泌的非天然的和/或無關的分泌信號肽。因此本發(fā)明提供至少包括四個多肽的融合蛋白質，其中從N端至C端多肽的順序是包括選自下列一組中的氨基酸的第一個多肽(a)SEQIDNO:111的IL-2螺旋A氨基酸殘基36-46，(b)SEQIDNO:112的IL-15螺旋A氨基酸殘基29—43，(c)SEQIDNO:113的IL—4螺旋A氨基酸殘基45-68，(d)SEQIDNO:114的GM-CSF螺旋A氨基酸殘基30-44,和(e)SEQIDNO:2的氨基酸殘基41-56;6-27個氨基酸的第一個間隔區(qū)；包括選自下列一組的氨基酸殘基的第二個多肽(a)SEQIDNO:111的IL-2螺旋B氨基酸殘基53-75，(b)SEQIDNO:112的IL-4螺旋B氨基酸殘基65-83,(c)SEQIDNO:113的IL-15螺旋B氨基酸殘基84-101,(d)SEQIDNO:114的GM-CSF螺旋B氨基酸殘基72-81,和(e)SEQIDNO:2的氨基酸殘基69-84;5-11個氨基酸殘基的第二個間隔區(qū)；包括選自下列一組中的氨基酸殘基的第三個多肽(a)SEQIDNO:111的IL-2螺旋C殘基87-99,(b)SEQIDNO:112的IL-4螺旋C殘基95-118,(c)SEQIDNO:113的IL-15螺旋C殘基107-119,(d)SEQIDNO:114的GM-CSF螺旋C殘基91-102，和(e)SEQIDNO:2的氨基酸殘基92-105;3-29個氨基酸殘基的第三個間隔區(qū)；以及包括選自下列一組氨基酸殘基的第四個多肽(a)SEQIDNO:111的IL-2螺旋D氨基酸殘基103-121，(b)SEQIDNO:112的IL-15螺旋D氨基酸殘基134-157,(c)SEQIDNO:113的IL-4螺旋D氨基酸殘基134-160，(d)SEQIDNO:114的GM-CSF螺旋D氨基酸殘基120-131，和(e)SEQIDNO:2的氨基酸殘基135-148，其中四個多肽中的至少一個來自zalphall配體。在其它實施方案中，間隔肽將選自如表1中所示的zalphall配體、IL-2、IL-4、IL-15或GM-CSF的A/B、B/C和C/D環(huán)?？梢赃M行核酸分子的常規(guī)缺失分析以得到編碼zalphall配體多肽的核酸分子的功能性片段。例如，可以用Bal31核酸酶消化具有SEQIDNO:1的核苷酸序列或其片段的DNA分子，以得到一系列嵌套缺失。然后將這些DNA片段插入到表達載體的適當讀框中，分離所表達的多肽并試驗zalphall配體活性，或與抗zalphall配體抗體或zalphall受體結合的能力。核酸外切酶消化的一種可代用方法是使用寡核苷酸特異性誘變導入缺失或終止密碼子，以指導產生所需的zalphall配體片段?；蛘?，也可使用聚合酶鏈反應合成zalphall配體基因的特定片段。鑒定功能區(qū)域的標準方法是本領域技術人員已知的。例如，Horisberger和DiMarco(Pharmac.Ther.66:507，1995)總結了在干擾素的任一個或兩個末端進行平截研究的結果。此外，有關蛋白質功能分析的標準技術例如可參見Treuteretal.，Molec.Gen.Genet.240:113(1993);Contentetal,，"Expressionandpreliminarydeletionanalysisofthe42kDa2-5Asynthetaseinducedbyhumaninterferon,"inBiologicalInterferonSystems,ProceedingsofISIR-TNOMeetingonInterferonSystems,Cantell(ed.),pp.65-72(Nijhoff1987);Herschman，"TheEGFReceptor,，，inControlofAnimalCellProliferation1,Boyntonetal.，(eds.)pages169-199(AcademicPress1985);Co醒illeauetal.，J.Biol.Chem.270:29270(1995);Fukunagaetal.，.T.Biol.Chem.270:25291(1995);Yamaguchietal.,Biochem.Pharmacol.^:1295(1995);和Meiseletal.，PlantMolec.Biol.^:1(1996)?？稍斐啥嘀匕被崛〈⑹褂谜T變和篩選方法進行試驗(如參見Reidhaar-01sonandSauer，Science241:53(1988)或BowieandSauer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152(1989))。簡單地說，這些作者公開了同時隨機化設定多肽中的兩個或多個位置，選擇功能性多肽，然后測定被誘變多肽的序列以確定各位置上可容許的取代的范圍。可4吏用的其它方法包括噬菌體顯示(如Lowmanetal.，Biochem.30:10832(1991);Ladneretal.，美國專利No.5,223,409;Huse,國際專利申請發(fā)明者A·J·奈爾森,A·K·哈蒙德,C·A·斯普里切爾,D·C·福斯特,J·A·格羅斯,J·E·諾瓦克,J·V·約翰斯頓,R·D·霍利,S·R·普里斯奈爾,S·R·迪隆申請人:津莫吉尼蒂克斯公司