專利名稱：破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc在大腸桿菌中的高效表達(dá)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一個破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基 因及其編碼蛋白以及作為亞單位疫苗在破傷風(fēng)預(yù)防方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
破傷風(fēng)是一種嚴(yán)重危害人民生命健康的疾病，它是由革蘭氏陽性、厭氧的梭狀芽 胞桿菌——破傷風(fēng)桿菌侵入人體傷口、生長繁殖、產(chǎn)生破傷風(fēng)毒素引起的一種急性特異性 感染，破傷風(fēng)毒素入侵神經(jīng)系統(tǒng)可導(dǎo)致人全身性肌肉痙攣，進(jìn)而全身性衰竭或窒息死亡。一 切開放性損傷，均有發(fā)生破傷風(fēng)的可能。破傷風(fēng)毒素的毒性非常強(qiáng)烈，僅次于肉毒毒素，約 IOOng的破傷風(fēng)毒素便可以致人死亡。破傷風(fēng)在廣大貧困落后的第三世界國家和地區(qū)非常 嚴(yán)重。據(jù)估計，世界上每年約有100萬病例發(fā)生，死亡率在50%左右。在發(fā)展中國家，新生 兒破傷風(fēng)死亡率高達(dá)90%。尋找高效、安全的破傷風(fēng)預(yù)防和治療藥物是各國致力的方向。破傷風(fēng)毒素全長1315個氨基酸，分子量為150kD，共由A、B、C三部分組成，每部分 分子量均為50kD。C片段是重鏈的C端，具有結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞的作用。B片段是重鏈的N端， 具有導(dǎo)入作用。A片段是輕鏈，有蛋白酶活性，可抑制神經(jīng)傳遞物質(zhì)的釋放，具有麻痹作用。 傳統(tǒng)的類毒素疫苗是破傷風(fēng)毒素經(jīng)甲醛脫毒、鋁佐劑吸附精制而成的，雖然其免疫效果較 好，但仍存在一些問題接種類毒素后有一定的副反應(yīng)發(fā)生；破傷風(fēng)梭菌可形成芽孢形式， 毒性高，生產(chǎn)疫苗有一定危險性；甲醛處理類毒素容易造成污染；化學(xué)處理后的類毒素可 能發(fā)生毒性逆轉(zhuǎn)；而且重要的是免疫期短，隨著年齡的增長，對破傷風(fēng)免疫力下降，兒童需 要4 6年加強(qiáng)免疫，成人需要每10年加強(qiáng)一次免疫。因此，現(xiàn)有的類毒素疫苗還需進(jìn)一 步改進(jìn)和發(fā)展，而開發(fā)新型的基因工程疫苗是方向之一。實驗已證實用完整的毒素分子進(jìn) 行免疫并不是必需的。破傷風(fēng)天然C片段(He)保留了完整毒素與神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合等許多 性質(zhì)，免疫效價與毒素相當(dāng)，無毒性，過敏原性低，是將來發(fā)展亞單位疫苗和基因工程疫苗 的候選者，已被用于研究亞單位疫苗、細(xì)菌和病毒載體疫苗、粘膜疫苗等很多方面。用大腸桿菌表達(dá)抗破傷風(fēng)毒素的亞單位疫苗具有重要的意義，其工藝簡單，重組 的Hc蛋白不用擔(dān)心被完整毒素所污染，其安全性較高，但目前表達(dá)的破傷風(fēng)Hc片段普遍存 在表達(dá)量較低，易形成包涵體，免疫效價較低等缺點，這是因為Hc序列中AT含量豐富且存 在大量的大腸桿菌稀有密碼子，這在一定程度上限制了它的表達(dá)。國內(nèi)外許多研究者對破 傷風(fēng)Hc段的表達(dá)進(jìn)行了改進(jìn)，表達(dá)量得到了一定的提高，但仍達(dá)不到大量生產(chǎn)的需求，且 制備得到的Hc免疫原性與傳統(tǒng)類毒素疫苗相比也較低。為了解決這個問題，本研究擬采用序列及載體優(yōu)化等手段，對國內(nèi)破傷風(fēng)強(qiáng)毒株 CMCC64008株(GeneBank No :AF154828)的Hc片段序列進(jìn)行優(yōu)化，通過在大腸桿菌中的可溶 性高表達(dá)制備具有天然構(gòu)象的亞單位疫苗，并對該疫苗的免疫劑量、免疫效價、保護(hù)效果等 方面進(jìn)行研究并進(jìn)一步探索Tet-Hc作為亞單位疫苗可行性，為下一步深入制備破傷風(fēng)Hc 亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個經(jīng)優(yōu)化后可以在大腸桿菌中進(jìn)行高效可溶性表達(dá)且能 夠激發(fā)機(jī)體對破傷風(fēng)毒素產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因及其編碼蛋 白在破傷風(fēng)亞單位疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因，名稱為Tet-Hc，是下述核苷酸序 列之一 1)序列表中SEQ ID No. 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No. 2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID No. 1限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有激發(fā)機(jī) 體對破傷風(fēng)毒素產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No. 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序 列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下 雜交并洗膜。序列表中的SEQ ID No. 1由1353個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1353堿 基，編碼具有序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。所述破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因編碼的蛋白Tet-Hc，是下述氨基酸殘基序列 之一1)序列表中的 SEQ ID No. 2 ；2)將序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、 缺失或添加且具有激發(fā)機(jī)體對破傷風(fēng)毒素產(chǎn)生生免疫保護(hù)作用的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID NO. 2由451個氨基酸殘基組成。所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以使非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基， 其改變不會對該蛋白的功能產(chǎn)生影響。含有本發(fā)明基因Tet-Hc的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以pET32a為載體，構(gòu)建的含有破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因Tet-Hc和硫氧還蛋 白基因Trx的重組原核表達(dá)載體為pET32a-Tet-Hc。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)上述破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因編碼蛋白Tet-Hc的 方法。本發(fā)明所提供的表達(dá)上述破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因編碼蛋白Tet-Hc的方法 是將上述含有破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因Tet-Hc的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá) 得到破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因編碼蛋白Tet-Hc。所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為 大腸桿菌。所述大腸桿菌可為E.coli DH5 α、Ε· coli BL21 (DE3)、Ε· coli BL21 (DE3)pLysS或 Ε. coliToplO 等。上述重組均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。培養(yǎng)含有破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)基因Tet-Hc的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。其中，培養(yǎng)所述重組大腸桿菌時需加入誘導(dǎo)劑， 如IPTG等，所加入IPTG的濃度為0. 1-1. OmM，優(yōu)選為0. 2mM，誘導(dǎo)溫度為16-37°C，優(yōu)選為 28°C，誘導(dǎo)時間為2-8h，優(yōu)選為6h。本發(fā)明提供了一種破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因編碼蛋白Tet-Hc的純化方法， 可通過QFF柱、苯基疏水柱和SP柱三步純化獲得較高純度的無標(biāo)簽蛋白。 本發(fā)明的破傷風(fēng)受體結(jié)合區(qū)Hc基因所編碼的蛋白可用于制備破傷風(fēng)毒素亞單位 疫苗。需要的時候，以破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因編碼蛋白制備的破傷風(fēng)亞單位疫 苗還可以融入顆粒白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激劑因子(GM-CSF)、干擾素-γ (IFN-γ)、白介 素2 (IL-2)、TGF-β 4等一種或多種細(xì)胞因子的基因或蛋白質(zhì)作為分子免疫佐劑。本發(fā)明的疫苗可以制成注射液、干粉針劑或噴霧劑等多種形式。上述各種劑型的 藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。上述亞單位疫苗的用量可采用藥學(xué)領(lǐng)域中亞單位疫苗的常規(guī)劑量，如1-10 μ g，并 可根據(jù)實際情況調(diào)整。本發(fā)明提供了一種通過核苷酸序列優(yōu)化使破傷風(fēng)毒素重組疫苗Hc在大腸桿菌中 獲得高效可溶性表達(dá)的方法。根據(jù)國內(nèi)破傷風(fēng)梭菌C. Tetani強(qiáng)毒株CMCC64008株的測序 結(jié)果(GeneBank No :AF154828)，對451Aa的破傷風(fēng)毒素Hc序列進(jìn)行分析優(yōu)化，采用大腸桿 菌常用密碼子替換稀有密碼子，并使優(yōu)化后序列的AT含量由72. 57 %降低為52. 47 %，優(yōu) 化后的序列如SEQ ID No. 1，其編碼的蛋白序列如SEQ ID No. 2。在Hc序列的兩端分別加 入EcoRI和XhoI酶切位點，進(jìn)行全基因合成。合成后的基因經(jīng)雙酶切后連接入表達(dá)載體 pET32a(+)中，重組Hc在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了可溶性高表達(dá)，目的蛋白占碎菌上清 總蛋白的約46%，并且能夠與破傷風(fēng)馬抗毒素發(fā)生特異性的結(jié)合。經(jīng)QFF柱、苯基疏水柱和 SP柱三步純化后，目的蛋白純度可達(dá)95%以上，得率在300mg/L以上。通過本發(fā)明的方法 制備的重組蛋白具有很好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度保護(hù)性抗體，抵御高劑量 致死毒素的攻擊。本發(fā)明在破傷風(fēng)毒素重組亞單位Hc的大規(guī)模高效制備中具有廣闊的應(yīng) 用前景。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc蛋白在大腸桿菌BL21 (DE3)中的可溶性表達(dá)的 SDS-PAGE蛋白電泳圖及western-blot鑒定圖。其中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為表達(dá)Hc的 BL21(DE3)碎菌上清；2為空載體碎菌上清。圖2為經(jīng)QFF柱、苯基疏水柱和SP柱三步純化后得到的Hc的SDS-PAGE蛋白電泳 圖。圖3為不同劑量的Hc蛋白免疫BALB/c小鼠后檢測血清中的抗體滴度。圖4為不同程度稀釋的Hc免疫后血清對Tet-Hc和神經(jīng)節(jié)苷酯GTlb結(jié)合的抑制作用。
具體實施例方式實施例一、破傷風(fēng)毒素亞單位疫苗Hc的序列優(yōu)化、根據(jù)國內(nèi)破傷風(fēng)梭菌C. Tetani強(qiáng)毒株64008株的測序結(jié)果(GeneBank序列號 AF154828)，對451Aa的Tet-Hc序列進(jìn)行分析優(yōu)化(優(yōu)化前后序列比較如下)，采用大腸桿 菌常用密碼子替換稀有密碼子，并使優(yōu)化后序列的AT含量由72. 57%降低為52. 47%。在 Tet-Hc序列的兩端分別加入EcoRI和XhoI酶切位點，并在起始密碼子前加入TAA終止密碼 子以終止載體pET32a(+)上Trx蛋白的表達(dá)，進(jìn)行全基因合成。Hc序列優(yōu)化前后比較優(yōu)化前 AAAAATCTGGATTGTTGGGTTGATAATGAAGAAGATATAGATGTTATATTAAAAAAGAGT優(yōu)化后AAAAACCTTGATTGTTGGGTCGACAACGAAGAAGACATCGATGTTATCCTGAAAAAGTCT優(yōu)化前ACAATTTTAAATTTAGATATTAATAATGATATTATATCAGATATATCTGGGTTTAATTCA 優(yōu)化后ACCATTCTGAACTTGGACATCAACAACGATATTATCTCCGACATCTCTGGTTTCAACTCC優(yōu)化前TCTGTAATAACATATCCAGATGCTCAATTGGTGCCCGGAATAAATGGCAAAGCAATACAT優(yōu)化后TCTGTTATCACATATCCAGATGCTCAATTGGTGCCGGGCATCAACGGCAAAGCTATCCAC優(yōu)化前TTAGTAAACAATGAATCTTCTGAAGTTATAGTGCATAAAGCTATGGATATTGAATATAAT優(yōu)化后CTGGTTAACAACGAATCTTCTGAAGTTATCGTGCACAAGGCCATGGACATCGAATACAAC優(yōu)化前GATATGTTTAATAATTTTACCGTTAGCTTTTGGTTGAGGGTTCCTAAAGTATCTGCTAGT優(yōu)化后GACATGTTCAACAACTTCACCGTTAGCTTCTGGCTGCGCGTTCCGAAAGTTTCTGCTTCC
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優(yōu)化前 AGAGAGGATAATAATATAACATTAAAACTAGATAGATGTAATAATAATAATCAATACGTT優(yōu)化后CGTGAGGACAACAACATCACTCTTAAGCTGGACCGTTGCAACAACAACAACCAGTACGTA優(yōu)化前TCTATTGATAAATTTAGGATATTTTGCAAAGCATTAAATCCAAAAGAGATTGAAAAATTA優(yōu)化后TCCATCGACAAGTTCCGTATCTTCTGCAAAGCACTGAACCCGAAAGAGATCGAAAAACTG優(yōu)化前TACACAAGTTATTTATCTATAACCTTTTTAAGAGACTTCTGGGGAAACCCTTTACGATAT優(yōu)化后TATACCAGCTACCTGTCTATCACCTTCCTGCGTGACTTCTGGGGTAACCCGCTGCGTTAC優(yōu)化前GATACAGAATATTATTTAATACCAGTAGCTTATAGTTCTAAAGATGTTCAATTGAAAAAT優(yōu)化后GACACCGAATATTACCTGATCCCGGTAGCTTACAGCTCTAAAGACGTTCAGCTGAAAAAC優(yōu)化前ATAACAGATTATATGTATTTGACAAATGCGCCATCGTATACTAACGGAAAATTGAATATA優(yōu)化后ATCACTGACTACATGTACCTGACCAACGCGCCGTCCTACACTAACGGTAAACTGAACATC優(yōu)化前TATTATAGAAGGTTATATAGTGGACTAAAATTTATTATAAAAAGATATACACCTAATAAT
優(yōu)化后TACTACCGACGTCTGTACAGCGGCCTGAAATTCATCATCAAACGCTACACTCCGAACAAC優(yōu)化前GAAATAGATTCTTTTGTTAGATCAGGTGATTTTATTAAATTATATGTATCATATAACAAT優(yōu)化后GAAATCGATTCTTT CGTTCGCTCTGGTGACTTCATCAAACTGTACGTTTCTTACAACAAC優(yōu)化前AATGAGCACATTGTAGGTTATCCGAAAGATGGAAATGCCTTTAATAATCTTGATAGAATT優(yōu)化后AACGAACACATCGTTGGTTACCCGAAAGACGGTAACGCTTTCAACAACCTGGACAGAATC優(yōu)化前CTAAGAGTAGGTTATAATGCCCCAGGTATCCCTCTTTATAAAAAAATGGAAGCAGTAAAA優(yōu)化后CTAAGAGTAGGTTACAACGCTCCGGGTATCCCGCTGTACAAAAAAATGGAAGCTGTTAAA優(yōu)化前TTGCGTGATTTAAAAACCTATTCTGTACAACTTAAATTATATGATGATAAAGATGCATCT優(yōu)化后CTGCGTGACCTGAAAACCTACTCTGTTCAGCTGAAACTGTACGACGACAAAGATGCTTCT
優(yōu)化前 TTAGGATTAGTAGGTACCCATAATGGTCAAATAGGCAACGATCCAAATAGGGATATATTA優(yōu)化后CTGGGTCTGGTTGGCACCCACAACGGTCAGATCGGTAACGACCCGAACCGTGACATCCTG優(yōu)化前ATTGCAAGCAACTGGTACTTTAATCATTTAAAAGATAAAACTTTAACATGTGATTGGTAC優(yōu)化后ATCGCTTCTAACTGGTACTTCAACCACCTGAAAGACAAAACCCTGACCTGCGACTGGTAC優(yōu)化前TTTGTACCTACAGATGAAGGATGGACAAATGAT優(yōu)化后TTCGTTCCGACCGATGAAGGTTGGACCAACGAC實施例二、破傷風(fēng)毒素亞單位疫苗Hc表達(dá)載體構(gòu)建將優(yōu)化合成后的Tet-Hc基因用EcoRI和XhoI雙酶切后，連接入同樣用EcoRI和 XhoI雙酶切后的表達(dá)載體pET32a(+)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，37°C培養(yǎng)過夜。 次日挑取單克隆于5mL LB (Amp+)培養(yǎng)基中，37°C，220rpm培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，EcoRI和XhoI 雙酶切鑒定目的基因的插入，并送測序。測序正確的質(zhì)粒命名為pET32a-Tet-HC。實施例 三、破傷風(fēng)毒素重組亞單位疫苗Hc的大腸桿菌表達(dá)及western-blot鑒定正確連接入Tet-Hc基因的pET32a(+)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)， 挑取單克隆于5mL LB (Amp+)液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm培養(yǎng)至0D600nm ^0.6時，加入終 濃度為0. 2mM的IPTG，28°C，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)6h。5，OOOg，4°C離心收集菌體，用PBS重懸后 超聲碎菌。12，000g，4°C離心取上清，行SDS-PAGE電泳，以空載體表達(dá)產(chǎn)物為對照，鑒定大 小為50KD的Hc蛋白的表達(dá)。Western-blot分析Tet-Hc與鼠抗破傷風(fēng)單克隆抗體的特異性結(jié)合。將含有 Tet-Hc蛋白的超聲碎菌上清及空載體碎菌上清行SDS-PAGE蛋白電泳后，蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸 纖維素膜上，用含3% BSA的PBS室溫封閉Ih后，加入1 1000稀釋的小鼠抗破傷風(fēng)單克 隆抗體，37°C反應(yīng)lh。將膜用PBST洗滌4遍后，加入1 5000稀釋的辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 二抗，37 V反應(yīng)Ih后PBST洗滌4遍，采用化學(xué)發(fā)光法顯色、壓片、曝光。從圖1的實驗結(jié)果可以看到，與空載體對照相比，轉(zhuǎn)化有pET32a-tet-Hc質(zhì)粒的菌 株在50KD左右有明顯的條帶，western-bolt結(jié)果證實該蛋白可與鼠抗破傷風(fēng)單克隆抗體 發(fā)生特異性的結(jié)合，說明該條帶即為Hc目的條帶。經(jīng)薄層掃描分析目的蛋白約占碎菌上清 總蛋白的46%，說明Tet-Hc蛋白在大腸桿菌中得到了高效可溶性表達(dá)。實施例四、破傷風(fēng)毒素亞單位疫苗Hc的大腸桿菌發(fā)酵及純化表達(dá)Hc蛋白的種子液1L，轉(zhuǎn)接入30L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)至0D600nm ^0.6時，加入 終濃度為0. 2mM的IPTG，28°C，300rpm繼續(xù)培養(yǎng)6h。10，000g，4°C離心收集菌體，用20mM Tris-HCl緩沖液(pH 8. 5)重懸后勻漿碎菌。20，000g，4°C離心收集上清。上清液過QFF柱進(jìn)行陰離子交換，用20mM Tris-HCl緩沖液(pH 8. 5)平衡后，用含0-0. 5M NaCl的Tris-HCl 緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。含有目的蛋白的洗脫液加入終濃度為0.5M的(NH4)2SO4后，過苯基 疏水柱進(jìn)行下一步純化。目的蛋白用含濃度0. 5-0M的(NH4)2SO4的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行 梯度洗脫。含有目的蛋白的洗脫液用脫鹽柱置換緩沖液為20mM NaAc(pH4.0)后，過SP柱 進(jìn)行陽離子交換，目的蛋白用含0-0. 5M NaCl的20mM NaAc (pH 4.0)緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。 經(jīng)過三步純化后，無標(biāo)簽的目的蛋白Hc得到了很好的純化，純度可達(dá)95%以上(圖2)，得 率在300mg/L以上，目的蛋白最終保存在PBS緩沖液中。實施例五、Tet-Hc的免疫原性研究 不同劑量的Hc蛋白Iygjyg禾Π 10 μ g/只，免疫6-8周齡Balb/c小鼠，每兩周 免疫一次，共免疫三次，第一次采用福氏完全佐劑，第二第三次采用福氏不完全佐劑，每次 免疫后兩周、下一次免疫前取血檢測血清中的抗體滴度；抗體滴度的測定采用ELISA的方 法，破傷風(fēng)類毒素1 μ g/mL, 100 μ L/孔包被96孔酶聯(lián)板，4°C包被過夜。PBST洗滌4次， 5min/次。將抗血清用PBSTWl 100依次倍比稀釋后，加入酶聯(lián)板中，37°C反應(yīng)lh，同時 設(shè)PBS免疫后的血清為對照。PBST洗滌4次，5min/次。加入HRP-抗小鼠鼠二抗，37V反應(yīng) 30-40min。加入TMB顯色液，50 μ L/孔，顯色后用2M H2SO4終止，酶標(biāo)儀450nm/測定光吸收 值。以加入陰性對照血清孔的顯色值為對照，以0D450nm大于0. 1且高于陰性孔2倍為陽性 稀釋滴度。從實驗結(jié)果可以看到，Hc組的抗體滴度基本在1 200,000以上，均高于文獻(xiàn)報 道。而抗原的免疫劑量與抗體滴度基本無關(guān)，1 μ g的Hc便可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的抗體滴度。實施例六、免疫后血清的體外生物學(xué)活性研究神經(jīng)節(jié)苷酯GTlb是破傷風(fēng)毒素通過Hc結(jié)構(gòu)域與神經(jīng)細(xì)胞結(jié)合的受體之一，我們 通過競爭ELISA的方法檢測了含有中和性抗體的Hc免疫小鼠后的血清對Tet-Hc和GTlb結(jié) 合的抑制作用。將GTlb用甲醇稀釋至終濃度為2 μ g/mL后4°C包被96孔酶聯(lián)板過夜。將 Hc免疫后的小鼠血清用PBST做不同程度的稀釋后與等體積的2 μ g/mL的Tet-Hc在37°C 混合孵育30min，加入包被有GTlb且洗滌過的96孔板，37°C反應(yīng)lh，以PBST與Tet-Hc混 合孔作為對照。PBST洗滌4次后，加入1 100稀釋的人抗破傷風(fēng)多抗血清，100 μ L/孔， 37°C反應(yīng)lh。PBST洗滌4次，加入1 5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG 二 抗，37°C反應(yīng)40min后，加入TMB顯色，并用2M H2SO4終止，0D450nm讀取吸光值。按以下公 式計算抑制率抑制率=(1-試驗孔0D450nm/Hc對照孔0D450nm) X 100%從圖4的實驗結(jié)果可以看出不同程度稀釋的免疫血清均能不同程度地抑制 Tet-Hc與受體神經(jīng)節(jié)苷酯GTlb的結(jié)合，說明Tet-Hc免疫后的小鼠血清中含有具有體外生 物學(xué)活性的中和性抗體。隨著血清稀釋倍數(shù)的增大，中和抗體含量逐漸減少，抑制作用逐漸 減弱。實施例七、Hc蛋白作為亞單位疫苗對小鼠的保護(hù)效果三次免疫后進(jìn)行破傷風(fēng)毒素攻擊實驗，將2X IO3LD5tl劑量的破傷風(fēng)毒素溶于 0. 5mL的硼酸鹽緩沖液中，腹腔注射進(jìn)行攻毒，觀察Hc蛋白作為亞單位疫苗對小鼠的保護(hù) 效果。從表一的實驗結(jié)果可以看出不同劑量的Hc免疫小鼠3次后，均可以完全保護(hù)小鼠抵 御2X IO3LD5tl劑量的破傷風(fēng)毒素的攻擊，說明Tet-Hc作為亞單位疫苗在體內(nèi)可以誘發(fā)小鼠 產(chǎn)生大量的中和性抗體，具有很好地預(yù)防效果。表1不同劑量的Hc亞單位疫苗免疫BALB/c小鼠后對小鼠的體內(nèi)保護(hù)效果
SEQ ID No. 1<110>軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所<120>破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc在大腸桿菌中的高效表達(dá)及應(yīng)用<160>1<170>PatentIn Version 3. 5<210>1<211>1353<212>DNA<213>人工序列<220><221>gene<222>(1). . . (1353)<223><400>1aaaaaccttg attgttgggt cgacaacgaagaagacatcg atgttatcct gaaaaagtct60accattctga acttggacat caacaacgatattatctccg acatctctgg tttcaactcc120tctgttatca catatccaga tgctcaattggtgccgggca tcaacggcaa agctatccac180ctggttaaca acgaatcttc tgaagttatcgtgcacaagg ccatggacat cgaatacaac240gacatgttca acaacttcac cgttagcttctggctgcgcg ttccgaaagt ttctgcttcc300cacctggaac agtacgacac taacgagtactccatcatca gctctatgaa gaaatactcc360ctgtccatcg gctctggttg gtctgtttccctgaagggta acaacctgat ctggactctg420aaagactccg cgggcgaagt tcgtcagatcactttccgcg acctgtctga caagttcaac480gcgtacctgg ctaacaaatg ggttttcatcactatcacta acgatcgtct gtcttctgct540aacctgtaca tcaacggcgt tctgatgggctccgctgaaa tcactggtct gggcgctatc600cgtgaggaca acaacatcac tcttaagctggaccgttgcaccagtacgta 660tccatcgaca agttccgtat cttctgcaaagcactgaacc cgaaagagat cgaaaaactg720tataccagct acctgtctat caccttcctgcgtgacttct ggggtaaccc gctgcgttac780gacaccgaat attacctgat cccggtagcttacagctcta aagacgttca gctgaaaaac840atcactgact acatgtacct gaccaacgcgccgtcctaca ctaacggtaa actgaacatc900tactaccgac gtctgtacag cggcctgaaattcatcatca aacgctacac tccgaacaac960gaaatcgatt ctttcgttcg ctctggtgacttcatcaaac tgtacgtttc ttacaacaac 1020aacgaacaca tcgttggtta cccgaaagacggtaacgctt tcaacaacct ggacagaatc 1080ctaagagtag gttacaacgc tccgggtatcccgctgtaca aaaaaatgga agctgttaaa 1140
ctgcgtgacc tgaaaaccta ctctgttcag ctgaaactgt acgacgacaa agatgcttct 1200ctgggtctgg ttggcaccca caacggtcag atcggtaacg acccgaaccg tgacatcctg 1260atcgcttcta actggtactt caaccacctg aaagacaaaa ccctgacctg cgactggtac 1320ttcgttccga ccgatgaagg ttggaccaac gac1353SEQ ID No. 2 <110>軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所<120>破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc在大腸桿菌中的高效表達(dá)及應(yīng)用<160>1<170>PatentIn Version 3. 5<210>1<211>451<212>PRT<213>人工序列<220><221>mat_peptide<222>(1). . . (451)<223><400>2KNLDCffVDNE EDIDVILKKS TILNLDINND IISDISGFNS SVITYPDAQL VPGINGKAIH 60LVNNESSEVI VHKAMDIEYN DMFNNFTVSF WLRVPKVSAS HLEQYDTNEY SIISSMKKYS 120LSIGSGffSVS LKGNNLIffTL KDSAGEVRQI TFRDLSDKFN AYLANKffVFI TITNDRLSSA 180NLYINGVLMG SAEITGLGAI REDNNITLKL DRCNNNNQYV SIDKFRIFCK ALNPKEIEKL 240YTSYLSITFL RDFffGNPLRY DTEYYLIPVA YSSKDVQLKN ITDYMYLTNA PSYTNGKLNI 300YYRRLYSGLK FIIKRYTPNN EIDSFVRSGD FIKLYVSYNN NEHIVGYPKD GNAFNNLDRI 360LRVGYNAPGI PLYKKMEAVK LRDLKTYSVQ LKLYDDKDAS LGLVGTHNGQ IGNDPNRDIL 420IASNffYFNHL KDKTLTCDffY FVPTDEGffTN D45權(quán)利要求
破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No.2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激發(fā)機(jī)體對破傷風(fēng)毒素產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的核苷酸序列；4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白，其特征在于所述蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQID No. 2 ；2)將序列表中SEQID No. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失 或添加且具有激發(fā)機(jī)體對破傷風(fēng)毒素產(chǎn)生生免疫保護(hù)作用的蛋白質(zhì)。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
5.一種表達(dá)權(quán)利要求2或3所述破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)He基因編碼蛋白的方法，是將 含有權(quán)利要求1所述破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)He基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得 到破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)He基因編碼蛋白。
6.權(quán)利要求2或3所述破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)He基因編碼蛋白在制備破傷風(fēng)毒素亞 單位疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過核苷酸序列優(yōu)化使破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc在大腸桿菌中獲得高效可溶性表達(dá)的方法。根據(jù)國內(nèi)破傷風(fēng)梭菌C.Tetani強(qiáng)毒株CMCC64008株的測序結(jié)果，對破傷風(fēng)毒素受體結(jié)合區(qū)Hc序列進(jìn)行分析優(yōu)化，優(yōu)化后的序列如SEQ ID No.1，其編碼的蛋白序列如SEQ ID No.2。合成后的Hc基因經(jīng)雙酶切后連接入表達(dá)載體pET32a(+)中，重組Hc在大腸桿菌中獲得了可溶性高表達(dá)，目的蛋白占碎菌上清總蛋白的約46％。經(jīng)QFF柱、苯基疏水柱和SP柱三步純化后，目的蛋白純度可達(dá)95％以上，得率在300mg/L以上。通過本發(fā)明的方法制備的重組蛋白具有很好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度保護(hù)性抗體，抵御高劑量致死毒素的攻擊。本發(fā)明在破傷風(fēng)毒素重組亞單位疫苗Hc的大規(guī)模高效制備中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N5/10GK101880675SQ20091013597
公開日2010年11月10日 申請日期2009年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日
發(fā)明者于蕊, 于長明, 任軍, 侯利華, 劉樹玲, 房婷, 陳薇 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所