專利名稱：一種適合工業(yè)化生產(chǎn)雙歧桿菌的培養(yǎng)基及其配制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙歧桿菌的培養(yǎng)基及其制備方法，特別涉及一種適合工業(yè)化的雙l技桿菌培養(yǎng)基。。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌(Bifidobactemim)是人畜等溫rflL動(dòng)物腸道內(nèi)重要的生理性細(xì)菌之一，是人體健康的重要指 標(biāo)菌之一，它在腸道菌群中所占比例直接影響著宿主的健康狀況，與其它正常菌群一起構(gòu)成了阻止外來(lái)菌 入侵的定植阻力，具有一定的生物拮抗作用，同時(shí)雙歧桿菌體內(nèi)含有大量的消化酶，能消化一些機(jī)體內(nèi)依 靠本身的酶系不能消化的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，雙歧桿菌及其表面結(jié)豐勾成分可作為生物應(yīng) 答劑經(jīng)口服或非胃腸途徑增強(qiáng)宿主的免疫監(jiān)視功能，可增強(qiáng)各種細(xì)胞因子和抗體的產(chǎn)生，提高NK和巨噬 細(xì)胞活性，提高局部或全身的防御功能，發(fā)揮自穩(wěn)調(diào)節(jié)、抗感染、抗腫瘤效應(yīng)。目前2又歧桿菌多作為益生 菌添加在乳品中，在歐美、日本等國(guó)家的功能性食品市場(chǎng)占統(tǒng)治地位，僅2005年就有379種益生菌產(chǎn)品 上市。
目前，雙歧桿菌較常用的培養(yǎng)基有MRS、 NPNL、 TPY、 PTYG等。TPY和PTYG培養(yǎng)基緩沖能力較 弱，不適合大規(guī)模使用；MRS和NPNL營(yíng)養(yǎng)成分豐富，緩沖能力強(qiáng)，但目前MRS和NPNL培養(yǎng)基存在如 下問(wèn)題價(jià)格較高(NPNL13元/L、 MRS3元/L;緩沖體系中磷酸鹽易造成乳酸桿菌由耐凍的短棒變成不 耐凍的纖棒狀；較多無(wú)機(jī)鹽成分對(duì)人體和動(dòng)物健康具有潛在有害影響；L-十胱氨酸鹽酸鹽經(jīng)高溫滅菌產(chǎn)生 不愉快氣味等問(wèn)題限制其在工業(yè)上的應(yīng)用。為了降低成本研究人員所篩選雙歧桿菌培養(yǎng)基多是在生化培養(yǎng) 基的基礎(chǔ)上添加一定比例的具有雙歧增長(zhǎng)因子的天然物質(zhì)，如番茄汁、菊芋汁、胡蘿卜汁等，也達(dá)到了提 高活菌數(shù)的目的，但是此類培養(yǎng)基配制步驟較多，操作繁瑣，不適宜用于工業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，木發(fā)明提供了一種以玉米漿干粉為主要原料的雙歧桿菌培養(yǎng)基。其具 有成本經(jīng)濟(jì)和易于配制的特點(diǎn)。
1雙歧桿菌模板培養(yǎng)基篩選
為了對(duì)雙歧桿菌的生長(zhǎng)特性有一個(gè)初步的了解，選擇了耐酸耐膽鹽等性能較好的長(zhǎng)雙歧桿菌為實(shí)驗(yàn)菌 株，測(cè)定了長(zhǎng)雙歧桿菌在四種不同培養(yǎng)基下的生長(zhǎng)曲線。采用25mL厭氧螺口試管，NPNL、 MRS、 TPY、 PTYG培養(yǎng)基，接種量1%, 37'C靜置培養(yǎng)，每三小時(shí)取樣，測(cè)定活菌數(shù)，對(duì)比菌株在不同培養(yǎng)基中的生 長(zhǎng)速度和活菌數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖1所示。由SAS統(tǒng)計(jì)分析可知，長(zhǎng)雙歧桿菌在NPNL培養(yǎng)基中的培養(yǎng)12h進(jìn)入穩(wěn)定期以后活菌數(shù)與其他培養(yǎng) 基相比均有顯著性差異，因此選擇NPNL為模板進(jìn)行工業(yè)化培養(yǎng)基篩選。
NPNL培養(yǎng)基成分為蛋白胨10g，胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨3g，酵母浸粉10g，葡萄糖10g，牛肝 粉15g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，吐溫一80 1ml，可溶性淀粉0.5g，牛肉膏3g，溶液A10ml，溶液B5ml。(其 中，A液K2HP04-25g, KH2P04 25g,蒸餾水250ml; B液MgS04'7H205g， FeS04'7H20 0.5g， NaCl 0.5g, MnS04'H20 0.337g，蒸餾水250ml) pH7.2。
2限制NPNL培養(yǎng)基工業(yè)化應(yīng)用的因素
NPNL培養(yǎng)基組成成分包括碳源(葡萄糖)、氮源(蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、牛肝 粉)、緩沖體系(K2HP04, KH2P(D4)、抗氧化劑(L-半胱氨酸鹽酸鹽)、微量元素(MgSO+7H20 、 FeS04-7H20、 NaCl 、 MnS04.H20)。
NPNL培養(yǎng)基中不同種類的營(yíng)養(yǎng)素所占比例差別較大，如附圖2。氮源成本占到全部成本的93%,碳 源占到2.5%，抗氧化劑占4.0%，緩沖體系、微量元素、乳化劑共占0.5%。由附圖2可知，氮源成本較高 影響了NLNL培養(yǎng)基工業(yè)化應(yīng)用。此外，磷酸鹽緩沖液對(duì)菌體、較多無(wú)機(jī)鹽成分對(duì)人和動(dòng)物健康的有害影 響，以及L-半胱氨酸鹽酸鹽滅菌產(chǎn)生的不良風(fēng)味均是限制NPNL培養(yǎng)基工業(yè)化應(yīng)用的肉素。
3工業(yè)化培養(yǎng)基選擇
針對(duì)NPNL的缺點(diǎn)進(jìn)行工業(yè)培養(yǎng)基的篩選，在不降低雙歧桿菌生物發(fā)酵量的前提下對(duì)模板NPNL培養(yǎng) 基進(jìn)行迠當(dāng)修改。
3.1氮源的確定
NPNL中氮源的成本占總成本的90%以上，因此降低培養(yǎng)基成本主要是降低氮源的成本。 選用較為常見(jiàn)且成本較低的脫脂奶粉、乳清蚩白、玉米漿等氮源進(jìn)行研究，其他營(yíng)養(yǎng)成分及用量均按
照模板NPNL培養(yǎng)基中的成分及用量進(jìn)行添加。脫脂奶粉、乳清蛋白、玉米漿干粉等氮源的添加量為模板
NPNL培養(yǎng)基中粗蛋白質(zhì)含量(25g/L)，測(cè)定長(zhǎng)雙歧桿菌在各種培養(yǎng)基中的活菌數(shù)，結(jié)果如附圖3所示 在蛋白質(zhì)含量均為25g/L的條件下，長(zhǎng)雙歧桿菌在9h進(jìn)入穩(wěn)定期，在玉米漿干粉中的活菌數(shù)比脫脂奶
粉和乳清蛋白屮的活菌數(shù)有顯著性差異，和模板培養(yǎng)基NPNL沒(méi)有顯著性差異，因此選用玉米漿干粉作為氮源。
在碳源、抗氧化劑、乳化劑等其他條件都不變的情況下，選用不同玉米漿干粉蛋白質(zhì)含量的培養(yǎng)基， 1%接種，12h進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定，結(jié)果如附圖4所示。
由SAS統(tǒng)計(jì)分析可知，長(zhǎng)雙歧桿菌在蛋Q質(zhì)含量為22g/L和25g/L的培養(yǎng)基中活菌數(shù)均比其他含量的 培養(yǎng)基中活菌數(shù)有顯著性差異，這兩者沒(méi)有顯著性差異，因此在以玉米槳干粉作為培養(yǎng)基氮源時(shí)，優(yōu)選培 養(yǎng)基的蛋白質(zhì)含量為22 25g/L?？蛇x擇不同蛋白含量的玉米槳干粉作為氮源，并根據(jù)所需的培養(yǎng)基蛋白含量調(diào)節(jié)玉米槳干粉的添加 量。玉米漿干粉的蛋白含量?jī)?yōu)選為40重量％，其添加量可以為55~63g/L。
3.2緩沖體系的確定
玉米漿干粉培養(yǎng)基中具有較多的固形物，是一種良好的緩沖體系。設(shè)想可以取代磷酸鹽緩沖體系起到 緩沖作用，并進(jìn)行驗(yàn)證。在3.1篩選的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別添加和不'添加磷酸鹽緩沖體系，1%接種，在12h 達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)分別取樣，測(cè)定活菌數(shù)，添加磷酸鹽緩沖體系的培養(yǎng)基活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為9.61±0.03，不添加磷 酸鹽緩沖體系的培養(yǎng)基活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為9.65±0.05,經(jīng)SAS統(tǒng)計(jì)分析可知兩者沒(méi)有顯著性差異。
由結(jié)果可知，添加或者不添加磷酸鹽緩沖體系對(duì)玉米漿培養(yǎng)基的pH及活菌數(shù)變化沒(méi)有顯著影響，能 起到緩沖的作用。因此可以剔除模板NPNL培養(yǎng)基中磷酸鹽緩沖液，以避免其對(duì)菌體凍干存活率的影響。
3.3無(wú)機(jī)鹽溶液的確定
有研究表明，在含有玉米漿成分的培養(yǎng)基中添加或者不添加外來(lái)無(wú)機(jī)鹽成分對(duì)鼠李糖乳桿菌產(chǎn)乳酸能 力沒(méi)有顯著性差異，表明玉米漿中的無(wú)機(jī)鹽含量可以滿足乳酸菌對(duì)礦物鹽的需求，可以略去NPNL培養(yǎng)基 中的無(wú)機(jī)鹽溶液，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是否對(duì)雙歧桿菌的生長(zhǎng)有影響。在3.2篩選的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別添加和 不添加NPNL中的無(wú)機(jī)鹽溶液，1%接種，12h達(dá)到穩(wěn)定期是取樣測(cè)定活菌數(shù)，添加NPNL中無(wú)機(jī)鹽溶液的 培養(yǎng)基活臠數(shù)對(duì)數(shù)值為9.73±0.03，不添加NPNL中無(wú)機(jī)鹽溶液的培養(yǎng)基活菌數(shù)為9.60±0.07。
經(jīng)SAS統(tǒng)計(jì)分析可知兩者沒(méi)有顯著性差異，即玉米漿中的無(wú)機(jī)鹽成分已經(jīng)能夠滿足雙歧桿菌的生長(zhǎng)， 因此在所選的玉米漿培養(yǎng)基中不必添加NPNL中的無(wú)機(jī)鹽溶液。
3.4抗氧化劑的確定
有研究表明，抗壞血酸作為一種抗氧化劑也具有消除氧對(duì)雙歧桿菌的脅迫作用且其在膜過(guò)濾除菌和雙 歧桿菌培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有不良?xì)馕懂a(chǎn)生，因此可以考慮取代L-半胱氨酸鹽酸鹽，選用抗壞血酸作為抗氧化劑 添加到3.3所篩選的培養(yǎng)基中，1%接種，12h時(shí)取樣測(cè)定活菌數(shù)，結(jié)果如附圖5所示
其中，0表示不添加任何抗氧化劑。結(jié)果表明，添加不同量的抗壞血酸對(duì)雙歧桿菌在玉米漿培養(yǎng)基中 的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著性影響，肉此可以不添加任何抗氧化劑.究其原因可能為，玉米漿中含有約0.39% (下物質(zhì) 含量)的胱氨酸，而胱氨酸可以與半胱氨酸相互轉(zhuǎn)化，在雙歧桿菌發(fā)酵的過(guò)程中可以起到去除氧對(duì)菌體的 化學(xué)脅迫作用。
本發(fā)明以玉米槳作為雙歧桿菌培養(yǎng)基的氮源。具有以下優(yōu)勢(shì)
玉米漿中含有豐富的可溶性蛋白、氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽等，含大約70%同體物質(zhì)，蛋白質(zhì)含量約 40%,氨基酸含量約20%，其營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)很適合乳酸菌生長(zhǎng)繁殖的需要。
其來(lái)源廣泛，且經(jīng)噴霧干燥制得的玉米漿干粉，儲(chǔ)運(yùn)方便，適應(yīng)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的需要。近年玉米淀粉生產(chǎn)增長(zhǎng)較快，玉米漿的出路也成了問(wèn)題，特別是玉米淀粉廠比較集中的產(chǎn)區(qū)，很多小 廠均將玉米浸泡水直接排放，浪費(fèi)資源，且造成環(huán)境的污染。本發(fā)明開(kāi)拓了玉米漿的使用范圍。
其成本低廉，顯著地降低了培養(yǎng)基的成分，相比NPNL培養(yǎng)基價(jià)格下降95。/。，相比MRS培養(yǎng)基價(jià)格 下降80%。
其制作過(guò)程簡(jiǎn)單，適合雙歧桿菌的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。


附圖1:雙歧桿菌在四種雙歧培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。 附圖2: NPNL培養(yǎng)基中個(gè)營(yíng)養(yǎng)成分的成本。
附圖3:替換的三種氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)雙歧桿菌的結(jié)果。
附圖4:不同衛(wèi)米漿干粉蛋白質(zhì)濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)雙歧桿菌的結(jié)果。
附圖5:添加不同抗氧化劑的玉米漿干粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)雙歧桿菌的對(duì)比。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
(1) 制備玉米漿稱重玉米漿干粉后，補(bǔ)足水至55 63g/L，紗布過(guò)濾，備用；
(2) 添加葡萄糖，10 20g/L;吐溫-80, 0 1g/L;
(3) 調(diào)節(jié)pH值至6.5 7.2;
(4) 110。C 12rC， 10 15min滅菌備用。 實(shí)施例2:
(1) 制備玉米槳選擇經(jīng)過(guò)噴霧干燥加工的精制玉米漿干粉，稱重后，補(bǔ)足水至63g/L，調(diào)節(jié)pH值 到7.2， 8層紗布過(guò)濾，備用；
(2) 添加葡萄糖，10g/L;
(3) 調(diào)節(jié)pH值至6.5;
(4) 分裝，110'C 121'C， 10 15min滅菌備用。
實(shí)施例3:
(1)制備玉米漿選擇經(jīng)過(guò)噴霧干燥加工的精制玉米漿干粉，稱重后，補(bǔ)足水至58g/L，調(diào)節(jié)pH值到7.2， 8層紗布過(guò)濾，備用；
(2) 添加葡萄糖，15g/L;吐溫-80, 0.5g/L;
(3) 調(diào)節(jié)pH值至7.0;
(4) 分裝，110°C 121°C， 10 15min滅菌備用。 實(shí)施例4:
(1) 制備玉米漿選擇經(jīng)過(guò)噴霧千燥加T的精制玉米漿干粉，稱重后，補(bǔ)足水至55g/L，調(diào)節(jié)pH值 到7.2， 8層紗布過(guò)濾，備用；
(2) 添加葡萄糖，20g/L;吐溫-80， lg/L;
(3) 調(diào)節(jié)pH值至7.2;
(4) 分裝，110'C 12rC， 10 15min滅菌備用。
權(quán)利要求
1.一種適合工業(yè)化生產(chǎn)雙歧桿菌的培養(yǎng)基，其特征在于由以下成分組成以玉米漿干粉為氮源使培養(yǎng)基蛋白質(zhì)含量為22～25g/L；葡萄糖，10～20g/L；吐溫-80，0～1g/L；初始pH 6.5～7.2，余量為水。
2. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于其中玉米漿千粉的蛋白質(zhì)重量含量為40%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1或2所述的適合工業(yè)化生產(chǎn)雙歧桿菌培養(yǎng)基，其特征在于所述玉米漿干粉是經(jīng) 過(guò)噴霧下燥加工的精制玉米漿千粉。
4. 根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1或2所述的適合工業(yè)化生產(chǎn)雙歧桿菌培養(yǎng)基，其特征在于所述葡萄糖是分析純葡萄糖。
5. 根據(jù)權(quán)利要求書(shū)1或2所述的適合「.業(yè)化生產(chǎn)雙歧桿菌培養(yǎng)基，其特征在于所述吐溫-80是分析純 吐溫-80。
6. 根據(jù)權(quán)利要求書(shū)l一5所述的適合工業(yè)化生產(chǎn)雙歧桿菌培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1) 制備玉米漿稱重玉米漿干粉后，補(bǔ)足水至規(guī)定濃度，紗布過(guò)濾后，備用；(2) 在步驟(O的玉米漿中添加規(guī)定量的葡萄糖和/或吐溫-80;(3) 調(diào)節(jié)pH值至6.5 7.2;(4) 110。C 12rC，滅菌10 15min即得。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種適合工業(yè)化生產(chǎn)雙歧桿菌的培養(yǎng)基及其配制方法。所述培養(yǎng)基由以下成分組成玉米漿干粉(蛋白含量40％)，55～63g/L；葡萄糖，5～10g/L；吐溫-80，0～1g/L；初始pH 6.5～7.2。長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68及BB12在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，最大生長(zhǎng)量達(dá)到10⁹cfu/ml，優(yōu)于經(jīng)典雙歧桿菌培養(yǎng)基MRS及NPNL。該培養(yǎng)基成本低廉(相比NPNL培養(yǎng)基價(jià)格下降95％，相比MRS培養(yǎng)基價(jià)格下降80％)，制作過(guò)程簡(jiǎn)單，適合雙歧桿菌的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101597585SQ20091013651
公開(kāi)日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2009年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月6日
發(fā)明者任發(fā)政, 劉松玲, 劉愛(ài)萍, 張丁丁, 楊海鶯, 田寒友, 蔣菁莉, 亮 趙 申請(qǐng)人:任發(fā)政