專利名稱：一種殼-核復合結構的固定化載體及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞固定化技術領域。具體涉及一種殼-核復合結構的固定化載體及其制備方法。
背景技術：
固定化細胞技術是20世紀70年代興起的一種生物技術。所謂固定化細胞技術是指用物 理、化學的手段將游離細胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持催化活性、反復使用的方法。 細胞被固定化后具有細胞密度高、反應速度快、耐毒害能力強、產(chǎn)物容易分離、能實現(xiàn)連續(xù) 操作，可以大大提高生產(chǎn)能力等優(yōu)勢。因此，固定化細胞技術在生物化工上游和環(huán)境治理領 域具有誘人的應用發(fā)展前景。
固定化細胞方法按照固定化載體與細胞作用方式的不同，可以分為吸附法、包埋法、共 價結合法、交聯(lián)法。共價結合法利用細胞表面的反應基團(如氨基、羧基、羥基、巰基、咪 唑基)與活化的無機或有機載體反應，形成共價鍵將細胞固定。此方法的優(yōu)點是細胞與載體 結合緊密，不易脫落，但制備較難，而且細胞活力損失較大，具有一定的局限性。交聯(lián)法則 是利用雙功能或多功能試劑與細胞表面的反應基團反應，從而使細胞固定。此法化學反應條 件劇烈，對細胞活性影響大，不適于單獨應用，實際上此法經(jīng)常與其他方法結合。目前，固 定化細胞最常用的方法為吸附法和包埋法。吸附法利用載體和細胞表面所帶電荷的靜電引力， 使細胞吸附于載體上，該法操作簡單，固定化過程對細胞活性影響小。但操作穩(wěn)定性較差， 細胞容易脫落，細胞泄漏率較高。包埋法是將細胞包裹在凝膠網(wǎng)格結構中或半透性聚合薄膜 內(nèi)，小分子的底物和產(chǎn)物可以自由擴散，而細胞卻不會擴散到周圍介質(zhì)中去。該法操作簡單， 對細胞活性影響小，細胞仍能保持較高活力，但載體內(nèi)部存在著擴散限制作用，其內(nèi)部的孔 隙大小會影響底物的通透性或繁殖，這類方法只適用于小分子底物，對大分子底物不適用。
經(jīng)現(xiàn)有的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利申請?zhí)?5246085.8，專利名稱為一種固定化活酵母 載體，該專利以泡沫海綿的網(wǎng)絡空腔作為海藻酸鈣凝膠的骨架支撐，將凝膠填充進海綿中作 為酵母固定化的載體，解決了載體不耐沖刷及磨損性能差的問題，但由于海藻酸鈣凝膠具有 較為致密的結構，會對微生物培養(yǎng)時營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞造成阻力，進而影響微生物的生長及繁 殖。為了改善傳質(zhì)效果，劉錚等人(專利申請?zhí)?00510130675.9)發(fā)明了一種土壤修復用固 體復合微生物微球，該方法以海藻酸鈣為包埋材料，固體碳酸鈣為固體致孔劑，作為土壤修 復的復合菌劑使用，但作為發(fā)酵培養(yǎng)固定化的載體時，由于載體具有的超大孔使得微生物在 培養(yǎng)時由于攪拌或振蕩等作用很容易遺失，固定化效率極低。此外，為了改善傳質(zhì)效果， Ogbonna， J.C (Bioresource Technology)等人采用絲瓜海綿作為固定化載體用于乙醇的發(fā)酵，雖然絲瓜海綿具有較大的比表面積和豐富的網(wǎng)絡空腔有利于細胞的吸附，但在培養(yǎng)過程中菌 體遺失較為嚴重，固定化效率較低。目前，尚未發(fā)現(xiàn)通過設計具有功能性外層和具有超大孔 的內(nèi)核組成的殼-核復合結構載體同時解決傳質(zhì)阻力和菌體遺失的問題，本發(fā)明中的超大孔內(nèi) 核有利于細胞負載和繁殖，功能性薄層不僅能防止高效菌體的流失，保持生物濃度高，而且 具有強化傳質(zhì)或選擇吸附的特性，提升了固定化載體的功效，拓寬了固定化載體的應用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于一種殼-核復合結構的固定化載體，該固定化載體具有的主要特征是功 能性外層和具有超大孔的內(nèi)核組成殼-核復合結構。載體內(nèi)部是由具有貫通的尺寸在l-100pm 的超大孔材料構成，有明顯的內(nèi)部網(wǎng)絡結構，比表面積較大，有利于細胞負載和生長。外部 由含有活性炭的凝膠做為基質(zhì)的功能性薄層，厚度為200-2000pm，依據(jù)不同設計方法，可制 備具有不同功能的薄層，如吸附性薄層或大孔吸附性薄層。功能性薄層的存在，不僅能防 止高效菌體的流失，單位體積生物濃度高，而且具有強化傳質(zhì)、選擇吸附的特性，提升了固 定化細胞載體的功效，改善了傳質(zhì)性能。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體的技術方案為(本發(fā)明的所有濃度未加說明者均為質(zhì)量體 積比)
一種殼-核復合結構的固定化載體及其制備方法，具體步驟為(1)超大孔材料的制備。
本發(fā)明主要使用以下兩類超大孔材料。①自身就是超大孔材料，如裁剪邊長為2.0-20.0mm 的立方體海綿塊，用去離子水煮沸并用去離子水反復沖洗后，室溫干燥；②通過致孔劑添加 和去除來生成超大孔的凝膠微粒。如將0.1-200nm的碳酸鈣微粒和1.0%-4.0%的海藻酸鈉 溶液通過滴注法加入P/。-4n/。的CaCl2溶液中進行固化，10-25分鐘后將微粒取出，并用去離子 水沖洗干凈，再用0.05-0.3mol/L的鹽酸浸泡至不再產(chǎn)生氣泡為止，再用去離子水反復沖洗至 洗液為中性，4'C下保存?zhèn)溆?。與此法相似可制備超大孔瓊脂微粒、超大孔聚乙烯醇微粒。
(2)外部殼層的制備①混合溶液的配制A溶液為0.5%-3.0%的海藻酸鈉0.5-12%的 0.2-50.(^m活性炭微粒的混合溶液；B溶液為1.0%-2%的殼聚糖(0.5%-2%體積濃度的醋酸為 溶劑)與0.5-12%的0.2-50.0nm活性炭微?；旌弦?；C溶液為2%-4%的瓊脂溶液與0.5-12% 的0.2-50.0|im活性炭微粒的混合溶液(溶液溫度為4(TC-60"C左右)；②將步驟(1)中制備 好的海綿塊或超大孔微粒浸入上述A或B或C溶液中并迅速移出，需確保其表面被混合溶液 包覆，然后分別將其放入固定化溶液中，海藻酸鈉溶液的固定化溶液為1.0%-3.0%的CaCl2 溶液；殼聚糖溶液固定化溶液為1.0-2.0mol/L的NaOH溶液；瓊脂溶液不需要固定化溶液， 只需將包覆凝膠的載體移出。若要制備大孔吸附性復合薄層只需在A或C溶液中添加 0.1-5.(^m的碳酸鈣微粒，待表層凝膠固化后用0.05-0.1mol/L稀鹽酸除去。


圖1:為實施例1中的載體的葡萄糖傳質(zhì)曲線。 圖2:為實施例2中載體的葡萄糖^f專質(zhì)曲線。 圖3:為實施例3中載體的截面圖。
具體實施例方式
以下通過實例具體說明殼-核復合結構的固定化載體及其制備方法。 實施例1:
(1) 載體內(nèi)核采用經(jīng)過事先處理過的海綿，該海綿先在煮沸的去離子水中煮10分鐘，然 后用去離子水反復沖洗3遍后放置通風處至完全干燥。海綿大小為3mmX3mmX5mm的立 方體。
(2) 選取10-20顆經(jīng)過步驟(1)處理過的海綿，采用浸提法迅速浸入3.0%的海藻酸鈉 與1.5%活性炭(過300目篩)混合溶液中，待海綿的所有表層均包覆有凝膠后將載體取出。 迅速放入3%的CaCl2溶液中，輕輕攪拌固化10-15分鐘。待表層凝膠固化后用0.05-0.1mol/L 稀鹽酸除去碳酸鈣微粒。固定化后的載體用去離子水反復沖洗3遍，再用濾紙吸去表面的水 后放置4'C下保存。
為了檢測新型載體的傳質(zhì)性能，測定了葡萄糖溶液從載體內(nèi)部向外部擴散的情況。并以 未包覆凝膠的海綿塊、表層包覆凝膠但不含活性炭的海綿塊作為對照，比較了三者的傳質(zhì)性 能。
具體方法為選取25顆左右的海綿塊3份，將其分別浸入5mL的20g/L的葡萄糖溶液中。 待海綿塊將葡萄糖溶液完全吸干后，選取其中的一份海綿將其作為功能性固定化載體的內(nèi)核。 然后按照上述步驟制備出表層包覆有海藻酸鈣和活性炭粉末殼層的功能性固定化載體。
將三種載體分別放入裝有100mL去離子水的500mL錐形瓶中，在恒溫振蕩搖床中以 160rpm的速度3(TC下振蕩來測定傳質(zhì)的情況。每次取樣0.5mL，分別測定葡萄糖濃度在2小 時內(nèi)的變化情況。由于開始時傳質(zhì)速度較快，前半個小時內(nèi)每5分鐘取樣一次，半個小時后 改為每30分鐘取樣一次。
葡萄糖濃度采用生物傳感分析儀進行測定。圖1為實施例1的中載體的葡萄糖傳質(zhì)曲線。 從圖1中可以看出，由于海綿的內(nèi)部和表面均具有大孔網(wǎng)絡結構，葡萄糖溶液很容易從其中 擴散出來，而包覆了海藻酸鈣的海綿塊由于其表面具有的凝膠薄層則可以有效的防止葡萄糖溶液較快的擴散。表皮中添加活性炭的載體與包覆了海藻酸鈣未添加活性炭的載體傳質(zhì)趨勢 一致，說明活性炭的添加并不影響傳質(zhì)。而由于其表面具有凝膠薄層則可以有效的防止葡萄 糖溶液較快的擴散，同吋活性炭具有吸附性可用于功能性物質(zhì)的吸附。 實施例2:
(1)載體內(nèi)核采用經(jīng)過事先處理過的海綿，該海綿先在煮沸的去離子水中煮10分鐘，然 后用去離子水反復沖洗3遍后放置通風處至完全干燥。海綿大小為3mmX3mmX5mm的立 方體。
(2)選取10-20顆經(jīng)過步驟(1)處理過的海綿，采用浸提法迅速浸入濃度為3.0%的海 藻酸鈉與1.5%活性炭(過300目篩)、0.05-2.0pm的碳酸鈣微粒混合溶液，浸潤后將載體取 出迅速放入濃度為3%的CaCl2溶液中，輕輕攪拌固化10-15分鐘。待表層凝膠固化后用 0.05-0.1mol/L稀鹽酸除去碳酸鈣微粒。固定化后的載體用去離子水反復沖洗3遍，再用濾紙 吸去表面的水后放置4'C下保存。
為了檢測新型載體的傳質(zhì)性能，測定了葡萄糖溶液從載體內(nèi)部向外部擴散的情況。并以 未包覆凝膠的海綿塊、表層包海藻酸鈣覆凝膠的海綿塊作為對照，比較了三者的傳質(zhì)性能。 具體檢測方法同實例1。圖2為實施例2中微載體的葡萄糖傳質(zhì)曲線。從圖2中可以看出， 添加了致孔劑的復合薄層載體減小了薄層的傳質(zhì)阻力，與不添加致孔劑的載體相比具有更好 的傳質(zhì)效果，同時活性炭具有吸附性可以用于功能性物質(zhì)的吸附。 實細3:
(1) 載體內(nèi)核采用滴定法制備，即配制3%的海藻酸鈉溶液，溶液中含有0.1-100|_im的 碳酸轉微粒致孔劑，充分攪拌至溶液完全溶解，采用膠頭玻璃滴管或注射器以一定的速率滴 入3%的CaCl2溶液中進行固化，15-30分鐘后將載體取出并用去離子水反復沖洗干凈。采用 0.05-0.3mol/L稀鹽酸將載體充分浸泡至不再產(chǎn)生氣泡為止，再用去離子水反復沖洗至洗液為 中性。將微球表面的水用濾紙吸干后，4'C下保存?zhèn)溆谩?br> (2) 選取10-20顆經(jīng)過步驟(1)制備的凝膠微球，采用浸提法迅速浸入濃度為2%的殼 聚糖(0.5%-2%體積濃度的醋酸為溶劑)與1.5%活性炭(過300目篩)的混合溶液中，浸潤 后將載體取出迅速放入為0.5mol/L的NaOH溶液中，輕輕攪拌固化10-15分鐘。固定化后的 載體用去離子水反復沖洗3遍，再用濾紙吸去表面的水后放置4'C下保存。圖3為實施例3 中載體的截面圖。從圖中可以看到載體具有超大孔內(nèi)核和含有活性炭的薄層外殼。
本發(fā)明不受上述具體實例描述的限制。載體所用材料和載體內(nèi)核制備的方法可在權利要 求書概括的范圍內(nèi)做各種改變，這些改變也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權利要求
1、一種殼-核復合結構的固定化載體，其特征在于所述殼-核復合結構的固定化載體具有功能性外層和超大孔的內(nèi)核組成的殼-核復合結構。載體內(nèi)部是由具有貫通的尺寸在1-100μm的超大孔材料構成，外層為由凝膠作為主要基質(zhì)的功能性薄層，厚度為200-2000μm，依據(jù)不同設計方法，可制備具有不同功能的薄層。
2、 如權利要求1所述的殼-核復合結構的固定化載體，其特征在于具有不同功能的薄層為吸 附性薄層或大孔吸附性復合薄層。
3、 如權利要求1所述的殼-核復合結構的固定化載體，其特征在于超大孔的內(nèi)核為裁剪尺寸 為2.0-20.0mm的海綿塊或通過致孔劑的添加和去除來生成超大孔的凝膠微粒。
4、 如權利要求2所述的殼-核復合結構的固定化載體，其特征在于利用固體致孔劑碳酸鈣微 粒制備的超大孔的凝膠微粒為海藻酸鈣微粒、瓊脂微?；蚓垡蚁┐嘉⒘！?br> 5、 如權利要求2所述的殼-核復合結構的固定化載體的制備方法，其特征在于吸附性薄層中 所用的活性炭粒徑為0.2-50.0jmi。
6、 如權利要求2所述的殼-核復合結構的固定化載體的制備方法，其特征在于大孔吸附性復 合薄層中的致孔劑為0.02-4.0nm的碳酸鈣微粒，所用活性炭粒徑與權利要求5相同。
7、 如權利要求3或4所述的殼-核復合結構的固定化載體的制備方法，其特征在于所用的致 孔劑為0.1-200nm的碳酸鈣微粒。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于制備一種殼-核復合結構的固定化載體，該固定化載體具有的主要特征是功能性外層和具有超大孔的內(nèi)核組成的殼-核復合結構。載體內(nèi)部是由具有貫通的尺寸在1-100μm的超大孔材料構成，有明顯的內(nèi)部網(wǎng)絡結構，比表面積較大，有利于細胞負載和生長。外部由含有活性炭的凝膠做為基質(zhì)的功能性薄層，厚度為200-2000μm，依據(jù)不同設計方法，可制備具有不同功能的薄層，如吸附性薄層或大孔吸附性薄層。功能性薄層的存在，不僅能防止高效菌體的流失，單位體積生物濃度高，而且具有強化傳質(zhì)、選擇吸附的特性，提升了固定化細胞載體的功效，改善了傳質(zhì)性能。
文檔編號C12N11/10GK101544970SQ20091013659
公開日2009年9月30日 申請日期2009年5月8日 優(yōu)先權日2009年5月8日
發(fā)明者蕾 周, 鑫 周, 愷 婁, 楊 韓 申請人:鑫 周