專利名稱：一種功能性的固定化載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞固定化技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種功能性的固定化載體及其制備方法。
背景技術(shù)：
固定化細(xì)胞技術(shù)是20世紀(jì)70年代興起的一種生物技術(shù)。所謂固定化細(xì)胞技術(shù)是指用物 理、化學(xué)的手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持催化活性、反復(fù)使用的方法。 細(xì)胞被固定化后具有細(xì)胞密度高、反應(yīng)速度快、耐毒害能力強(qiáng)、產(chǎn)物容易分離、能實(shí)現(xiàn)連續(xù) 操作，可以大大提高生產(chǎn)能力等優(yōu)勢(shì)。因此，固定化細(xì)胞技術(shù)在生物化工上游和環(huán)境治理領(lǐng) 域具有誘人的應(yīng)用發(fā)展前景。
固定化細(xì)胞方法按照固定化載體與細(xì)胞作用方式的不同，可以分為吸附法、包埋法、共 價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法。共價(jià)結(jié)合法利用細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)(如氨基、羧基、羥基、巰基、咪 唑基)與活化的無(wú)機(jī)或有機(jī)載體反應(yīng)，形成共價(jià)鍵將細(xì)胞固定。此方法的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞與載體 結(jié)合緊密，不易脫落，但制備較難，而且細(xì)胞活力損失較大，具有一定的局限性。交聯(lián)法則 是利用雙功能或多功能試劑與細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)反應(yīng)，從而使細(xì)胞固定。此法化學(xué)反應(yīng)條 件劇烈，對(duì)細(xì)胞活性影響大，不適于單獨(dú)應(yīng)用，實(shí)際上此法經(jīng)常與其他方法結(jié)合。目前，固 定化細(xì)胞最常用的方法為吸附法和包埋法。吸附法利用載體和細(xì)胞表面所帶電荷的靜電引力， 使細(xì)胞吸附于載體上，該法操作簡(jiǎn)單，固定化過(guò)程對(duì)細(xì)胞活性影響小。但操作穩(wěn)定性較差， 細(xì)胞容易脫落，細(xì)胞泄漏率較高。包埋法是將細(xì)胞包裹在凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)中或半透性聚合薄膜 內(nèi)，小分子的底物和產(chǎn)物可以自由擴(kuò)散，而細(xì)胞卻不會(huì)擴(kuò)散到周圍介質(zhì)中去。該法操作簡(jiǎn)單， 對(duì)細(xì)胞活性影響小，細(xì)胞仍能保持較高活力，但載體內(nèi)部存在著擴(kuò)散限制作用，其內(nèi)部的孔 隙大小會(huì)影響底物的通透性或繁殖，這類方法只適用于小分子底物，對(duì)大分子底物不適用。
經(jīng)現(xiàn)有的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?5246085.8，專利名稱為一種固定化活酵母 載體，該專利以泡沫海綿的網(wǎng)絡(luò)空腔作為海藻酸鈣凝膠的骨架支撐，將凝膠填充進(jìn)海綿中作 為酵母固定化的載體，解決了載體不耐沖刷及磨損性能差的問(wèn)題，但由于海藻酸鈣凝膠具有 較為致密的結(jié)構(gòu)，會(huì)對(duì)微生物培養(yǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞造成阻力，進(jìn)而影響微生物的生長(zhǎng)及繁 殖。為了改善傳質(zhì)效果，劉錚等人(專利申請(qǐng)?zhí)?00510130675.9)發(fā)明了一種土壤修復(fù)用固 體復(fù)合微生物微球，該方法以海藻酸鈣為包埋材料，固體碳酸鈣為固體致孔劑，作為土壤修 復(fù)的復(fù)合菌劑使用，但作為發(fā)酵培養(yǎng)固定化的載體時(shí)，由于載體具有的超大孔使得微生物在 培養(yǎng)時(shí)由于攪拌或振蕩等作用很容易遺失，固定化效率極低。此外，為了改善傳質(zhì)效果，
Ogbonna， J.C (BioresourceTechnology)等人采用絲瓜海綿作為固定化載體用于乙醇的發(fā)酵，雖然絲瓜海綿具有較大的比表面積和豐富的網(wǎng)絡(luò)空腔有利于細(xì)胞的吸附，但在培養(yǎng)過(guò)程中菌 體遺失也較為嚴(yán)重，固定化效率較低。目前，尚未發(fā)現(xiàn)通過(guò)設(shè)計(jì)具有功能性外層和具有超大 孔的內(nèi)核組成的殼-核復(fù)合結(jié)構(gòu)載體同時(shí)解決傳質(zhì)阻力和菌體遺失的問(wèn)題，本發(fā)明中的超大孔 內(nèi)核有利于細(xì)胞負(fù)載和繁殖，功能性薄層不僅能防止高效菌體的流失，保持高生物濃度，而 且具有強(qiáng)化傳質(zhì)或磁性響應(yīng)的特性，提升了固定化載體的功效，拓寬了固定化載體的應(yīng)用范 圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于制備一種功能性的固定化載體，該面定化載體具有的主要特征是功能 性外層和具有超大孔的內(nèi)核組成殼-核復(fù)合結(jié)構(gòu)。載體內(nèi)部是由具有貫通的尺寸在l-40(Hun 的超大孔材料構(gòu)成，有明顯的內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，比表面積較大，有利于細(xì)胞負(fù)載和生長(zhǎng)。外部 由凝膠為主要基質(zhì)功能性薄層，厚度為200-400(Him，依據(jù)不同設(shè)計(jì)方法，可制備具有不同功 能的薄層，如大孔薄層、磁性薄層、或大孔磁性復(fù)合薄層。功能性薄層的存在，不僅能防 止高效菌體的流失，單位體積生物濃度高，而且具有強(qiáng)化傳質(zhì)、磁性感應(yīng)的特性，提升了固 定化細(xì)胞載體的功效，改善了傳質(zhì)性能。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體的技術(shù)方案為(本發(fā)明的所有濃度未加說(shuō)明者均為質(zhì)量體 積濃度)
一種功能性的固定化載體及其制備方法，具體步驟為(1)超大孔材料的制備。本發(fā)明
主要使用以下兩類超大孔材料。①自身就是超大孔材料，如裁剪尺寸為2.0-20.0mm的海綿 塊，用去離子水煮沸并用去離子水反復(fù)沖洗后，室溫干燥；②通過(guò)致孔劑的添加和去除來(lái)生 成超大孔的凝膠微粒。如將0.1-200nm的碳酸鈣微粒和1.0%-4.0%的海藻酸鈉溶液通過(guò)滴 注法加入1%-4%的CaCl2溶液中進(jìn)行固化，10-25分鐘后將微粒取出，并用去離子水沖洗干凈， 再用0.05-0.3mol/L的鹽酸浸泡至不再產(chǎn)生氣泡為止，再用去離子水反復(fù)沖洗至洗液為中性， (C下保存?zhèn)溆?。與此法相似可制備超大孔瓊脂微粒、超大孔聚乙烯醇微粒。
(2)外部殼層的制備①混合溶液的配制A溶液為0.5%-3.0%的海藻酸鈉溶液與 0. 05-2. Opm的碳酸鈣微粒混合溶液；B溶液為1.0%-2%的殼聚糖(0.5%-2%體積濃度的醋酸 為溶劑)與2%-20%磁流體的混合溶液；C溶液為2%-4%的瓊脂溶液與2%-20%磁流體的混合 溶液(溶液溫度為40'C-6(TC左右)；②將步驟(1)中制備好的海綿塊或超大孔微球浸入上述 A或B或C溶液中并迅速移出，需確保其表面被混合溶液包覆，然后分別將其放入固定化溶 液中，海藻酸鈉溶液的固定化溶液為1.0%-3.0%的CaCl2溶液；殼聚糖溶液固定化溶液為 1.0-2.0mol/L的NaOH溶液；瓊脂溶液不需要固定化溶液，只需將包覆凝膠的載體移出。若要 制備大孔磁響應(yīng)性復(fù)合薄層只需在C溶液中添加0.1-5.(Hmi的碳酸鈣微粒，待表層凝膠固化后用0.05-0.1mol/L稀鹽酸除去。也可以在A溶液中添加2%-20%磁流體以制備大孔磁響應(yīng)性
復(fù)合薄層。


圖1:為實(shí)施例1中的載體的葡萄糖傳質(zhì)曲線。
圖2:為對(duì)照實(shí)驗(yàn)所用海綿塊的截面圖。
圖3:為實(shí)施例1中的功能性固定化載體的截面圖。
圖4:為實(shí)施例2中的載體的葡萄糖傳質(zhì)曲線。
圖5:為實(shí)施例2中的載體的外觀照片。
圖6:為實(shí)施例3中的載體的葡萄糖傳質(zhì)曲線。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)例具體說(shuō)明功能性固定化載體及其制備方法。 實(shí)施例1:
(1) 載體內(nèi)核采用經(jīng)過(guò)事先處理過(guò)的海綿塊，該海綿先在煮沸的去離子水中煮IO分鐘，
然后用去離子水反復(fù)沖洗3遍后放置通風(fēng)處至完全干燥。海綿大小為3mmx3mmx5mm的立 方體。
(2) 選取10-20顆經(jīng)過(guò)步驟(1)處理過(guò)的海綿采用浸提法，迅速浸入3.0%的海藻酸鈉 與0. 05-2. Onm的碳酸鈣微粒混合溶液中，浸潤(rùn)后將載體取出。迅速放入3%的CaCl2溶液中， 輕輕攪拌固化10-15分鐘。待表層凝膠固化后用0.05-O.lmol/L稀鹽酸除去碳酸鈣微粒。固定 化后的載體用去離子水反復(fù)沖洗3遍，再用濾紙吸去表面的水后放置4'C下保存。
為了檢測(cè)功能性固定化載體的傳質(zhì)性能，測(cè)定了葡萄糖溶液從載體內(nèi)部向外部擴(kuò)散的情 況。并以未包覆凝膠的海綿塊、表層未致孔的凝膠薄層海綿塊作為對(duì)照，比較了三者的傳質(zhì) 性能。
具體方法為選取25顆左右的海綿塊3份，將其分別浸入5mL的20g/L的葡萄糖溶液中。 待海綿塊將葡萄糖溶液完全吸干后，選取其中的一份海綿將其作為功能性固定化載體的核。 然后按照上述步驟制備出表層包覆有海藻酸鈣殼層并用碳酸鈣致孔的功能性固定化載體。
將三種載體分別放入裝有100mL去離子水的500mL錐形瓶中，在恒溫振蕩搖床中以 160rpm的速度30'C下振蕩來(lái)測(cè)定傳質(zhì)的情況。每次取樣0.5mL，分別測(cè)定葡萄糖濃度在2小 時(shí)內(nèi)的變化情況。由于開始時(shí)傳質(zhì)速度較快，前半個(gè)小時(shí)內(nèi)每5分鐘取樣一次，半個(gè)小時(shí)后改為每30分鐘取樣一次。
葡萄糖濃度采用生物傳感分析儀進(jìn)行測(cè)定。圖1為實(shí)施例1中的載體的葡萄糖傳質(zhì)曲線。 從圖1中可以看出，由于海綿的內(nèi)部和表面均具有大孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，葡萄糖溶液很容易從
其中擴(kuò)散出來(lái)，而包覆了海藻酸鈣的海綿塊由于其表面具有的凝膠薄層則可以有效的防止葡
萄糖溶液較快的擴(kuò)散。具有大孔薄層的載體的傳質(zhì)效果要比無(wú)大孔薄層的載體好，主要是因
為薄層中的大孔可以強(qiáng)化傳質(zhì)。
圖2和圖3分別為在顯微鏡下放大相同倍數(shù)后的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中所用海綿的截面圖與實(shí)施例
1中的功能性固定化載體的截面圖。
實(shí)施例2:
(1) 載體內(nèi)核采用經(jīng)過(guò)事先處理過(guò)的海綿，該海綿先在煮沸的去離子水中煮10分鐘， 然后用去離子水反復(fù)沖洗3遍后放置通風(fēng)處至完全干燥。海綿大小為3mmx3mmx5mm的立 方體。
(2) 選取10-20顆經(jīng)過(guò)步驟(1)處理過(guò)的海綿采用浸提法，迅速浸入4.0%的瓊脂與10% 磁流體混合溶液(溶液溫度為4(TC-6(TC左右)，待海綿的所有表層均包覆有凝膠后只需將載 體移出。固定化后的載體用去離子水反復(fù)沖洗3遍，再用濾紙吸去表面的水后放置4'C下保 存。
磁流體的制備方法為將40mL濃度為35%的FeS(V7H20溶液與50mL濃度為54%的 FeCl3.6H20溶液混合后加入反應(yīng)容器中，以一定轉(zhuǎn)速攪拌并加熱至55。C，加入50mL濃度為 36%的NaOH溶液繼續(xù)攪拌30分鐘后加入5克聚乙二醇-10000同時(shí)升溫至80。C并保持轉(zhuǎn)速 不變，攪拌30分鐘后反應(yīng)結(jié)束。待反應(yīng)液體冷卻至室溫后以稀鹽酸進(jìn)行中和。
為了檢測(cè)新型載體的傳質(zhì)性能，測(cè)定了葡萄糖溶液從載體內(nèi)部向外部擴(kuò)散的情況。并以 未包覆凝膠的海綿塊、表層包覆瓊脂凝膠的海綿塊作為對(duì)照，比較了三者的傳質(zhì)性能。
具體檢測(cè)方法同實(shí)例l。圖4為實(shí)施例2中載體的葡萄糖傳質(zhì)曲線。從圖4中可以看出， 表皮添加了磁流體與未添加磁流體的海綿塊傳質(zhì)趨勢(shì)一致，說(shuō)明磁流體的添加并不影響傳質(zhì)。 而由于其表面具有凝膠薄層則可以有效的防止葡萄糖溶液較快的擴(kuò)散，同時(shí)磁流體具有磁性 可以對(duì)外界磁場(chǎng)產(chǎn)生磁響應(yīng)。圖5為載體的外觀照片。 實(shí)施例3:
(1) 載體內(nèi)核采用經(jīng)過(guò)事先處理過(guò)的海綿，該海綿先在煮沸的去離子水中煮10分鐘，然 后用去離子水反復(fù)沖洗3遍后放置通風(fēng)處至完全干燥。海綿大小為3mmx3mmx5mm的立方 體。
(2) 選取10-20顆經(jīng)過(guò)步驟(1)處理過(guò)的海綿采用浸提法迅速浸入4.0%的瓊脂與10%
磁流體、0.05-2.0pm的碳酸鈣微?；旌先芤?溶液溫度為4(TC-6(TC左右)，待海綿的所有表
層均包覆有凝膠后將載體取出。待表層凝膠固化后用0.05-0.lmol/L稀鹽酸除去碳酸鈣微粒。
6固定化后的載體用去離子水反復(fù)沖洗3遍，再用濾紙吸去表面的水后放置4'C下保存。為了 檢測(cè)功能性固定化載體的傳質(zhì)性能，測(cè)定了葡萄糖溶液從載體內(nèi)部向外部擴(kuò)散的情況。并以 未包覆凝膠的海綿塊、表層包覆瓊脂凝膠的海綿塊作為對(duì)照，比較了三者的傳質(zhì)性能。具體 檢測(cè)方法同實(shí)例l。圖6為實(shí)施例3中載體的葡萄糖傳質(zhì)曲線。從圖6中可以看出，添加了 致孔劑的復(fù)合薄層載體減小了薄層的傳質(zhì)阻力，與不添加致孔劑的載體相比具有更好的傳質(zhì) 效果，同時(shí)磁流體具有磁性可以對(duì)外界磁場(chǎng)產(chǎn)生磁響應(yīng)。
本發(fā)明不受上述具體實(shí)例描述的限制。載體所用材料和載體內(nèi)核制備的方法可在權(quán)利要 求書概括的范圍內(nèi)做各種改變，這些改變也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種功能性的固定化載體，其特征在于所述功能性的固定化載體具有功能性外層和超大孔的內(nèi)核組成的殼-核復(fù)合結(jié)構(gòu)。載體內(nèi)部是由具有貫通的尺寸在1-100μm的超大孔材料構(gòu)成，外層為由凝膠作為主要基質(zhì)的功能性薄層，厚度為200-2000μm，依據(jù)不同設(shè)計(jì)方法，可制備具有不同功能的薄層。
2、 如權(quán)利要求l所述的功能性的固定化載體，其特征在于具有不同功能的薄層為大孔薄層、 磁性薄層或大孔磁性復(fù)合薄層的一種。
3、 如權(quán)利要求1所述的功能性的固定化載體，其特征在于超大孔的內(nèi)核為裁剪尺寸為 2.0-20.0mm的海綿塊或通過(guò)致孔劑的添加和去除來(lái)生成超大孔的凝膠微粒。
4、 如權(quán)利要求2所述的功能性的固定化載體，其特征在于利用固體致孔劑碳酸鈣微粒制備的 超大孔的凝膠微粒為海藻酸鈣微粒、瓊脂微?；蚓垡蚁┐嘉⒘?。
5、 如權(quán)利要求2所述的功能性的固定化載體的制備方法，其特征在于大孔薄層中所用的致孔 劑為0.02-4.0pm的碳酸鈣微粒。
6、 如權(quán)利要求2所述的功能性的固定化載體的制備方法，其特征在于磁性薄層制備過(guò)程中加 入水基磁流體。
7、 如權(quán)利要求2所述的功能性的固定化載體的制備方法，其特征在于大孔磁性復(fù)合薄層中的 致孔劑和磁流體與權(quán)利要求5和6相同。
8、 如權(quán)利要求3或4所述的功能性的固定化載體的制備方法，其特征在于所用的致孔劑為 0.1-200nm的碳酸鈣微粒。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于制備一種功能性的固定化載體，該固定化載體具有的主要特征是功能性外層和具有超大孔的內(nèi)核組成的殼-核復(fù)合結(jié)構(gòu)。載體內(nèi)部是由具有貫通的尺寸在1-100μm的超大孔材料構(gòu)成，有明顯的內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，比表面積較大，有利于細(xì)胞負(fù)載和生長(zhǎng)。外部由凝膠為主要基質(zhì)的功能性薄層，厚度為200-2000μm，依據(jù)不同設(shè)計(jì)方法，可制備具有不同功能的薄層，如大孔薄層、磁性薄層或大孔磁性復(fù)合薄層。功能性薄層的存在，不僅能防止高效菌體的流失，單位體積生物濃度高，而且具有強(qiáng)化傳質(zhì)、磁性感應(yīng)的特性，提升了固定化細(xì)胞載體的功效，改善了傳質(zhì)性能。
文檔編號(hào)C12N11/04GK101544971SQ20091013659
公開日2009年9月30日 申請(qǐng)日期2009年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
發(fā)明者蕾 周, 鑫 周, 愷 婁, 楊 韓 申請(qǐng)人:鑫 周