專利名稱：功能性色素皮膚等同物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有組成型色素形成的重建皮膚，和它們在評估皮膚色素形成
現(xiàn)象的方法中的應(yīng)用；因此，本發(fā)明涉及評估能夠調(diào)節(jié)該色素形成的試劑的方 法，無論所述色素形成是組成型的還是誘導(dǎo)的。本發(fā)明還涉及制備這類皮膚模 型的方法。
背景技術(shù)：
皮膚顏色主要由于在表皮中存在色素、黑色素。黑色素是由位于表皮基底 層的特殊樹突細(xì)胞，黑色素細(xì)胞合成的。黑素原生成發(fā)生在細(xì)胞器官中，負(fù)載 黑色素的黑色素體經(jīng)過樹突被轉(zhuǎn)移到附近的表皮細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞。
能夠M31物理因子來調(diào)節(jié)色素形成，例如UV射線、或者化學(xué)因素，例如 脫色(depigmenting)或者促色素形成(propigmenting)產(chǎn)品，禾口/或在 功能 的生理或病理修飾的過程中。
因此，期望一種模型， 一方面能夠?qū)嵤┩瑫r在機(jī)械的和生理學(xué)方面對更好
地理解皮膚的作用所必要的研究，另一方面，建立測試用于預(yù)觀u化妝品和/或藥 物制劑活性齊IJ活性，或者局部用成分或口服劑的副作用。
目前，存在體外模翻于評估色素形成的調(diào)節(jié)。特別地，它們是下述模型 - 在試管中G力ft^0)，抑制重組人或真菌酪氮酸酶(唯一的生物化學(xué)非
細(xì)胞模型)(ViradorAnalyticalBiochem1999); -正常的或來自黑色素瘤的黑色素細(xì)胞的單層單種培養(yǎng)(Virador
Analytical Biochem 1999， Ni-komatsu JID 2007 ); -正常的或者無限增殖的人類黑色素細(xì)胞-角質(zhì)細(xì)胞的單層共培養(yǎng)(R6
gnier Cell Mol Biol 1999 ， Yoon Pigment Cell Res 2003 );
-在去表皮的死真皮上或者在惰性聚碳酸酯過濾器上重建的色素表皮
僅僅由黑色素細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞組成的3D模型。
多年來，己經(jīng)努力開發(fā)重建皮膚模型，其一方面，能夠進(jìn)行對于在機(jī)械的 和生理學(xué)方面更好地理解皮膚的作用的必要研究，另一方面，構(gòu)成化妝品和/或藥物制劑活性齊U活性等作為口服成分的副作用的預(yù)測測試。
EP 285471因此描述了用于從來源于毛翻的角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物制備皮膚等 同物的方法；其通過在真皮等同物、分化表皮上進(jìn)行接種，其中獲得了結(jié)構(gòu)域 人表皮結(jié)構(gòu)接近的皮膚等同物。
隨后己經(jīng)提出了各種皮膚等同物，并且已經(jīng)暗示將黑色素細(xì)胞弓l入這些模 型中。
專利FR 2 689904和WO 95/10600描述了含有角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的表 皮等同物的制備，以及它們在在曬黑測試中的應(yīng)用。然而，這些表皮等同物是 在惰性載體上獲得的，其沒有再現(xiàn)與真皮的生理相互作用，并且不含油成纖維 細(xì)胞或基質(zhì)環(huán)境(matrix environments此外，由于使用種子啟動子(TPA或 PMA)，因此培養(yǎng)割牛不可能將黑細(xì)胞維持于正常表型。
然而，這些模型都不能夠得到對M真皮(成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、真 皮-表皮連接成分)參與的調(diào)節(jié)色素形成的理解，因為它們都不含有活性真皮。
即使開發(fā)了含有活性成纖維細(xì)胞的人類器官型模型，它們也不可能評價在 生理環(huán)境下色素形成的調(diào)節(jié)，因為它們具有功能缺陷(缺乏組成型色素形成或 者能夠特別通過UV暴露誘導(dǎo)的色素形成)。
已經(jīng)在去表皮的死真皮上或在海綿(膠原+GAG基質(zhì))上通過成纖維細(xì)胞 的再次形成集落(recolonize)開發(fā)了色素皮膚模型。然而，黑色素細(xì)胞在其中 的定位常常是不完美的，并且這些模型顯現(xiàn)出功能缺陷。具體地，它們顯示出 非常少或者沒有組成型色素形成，以及在這些模型中不鄉(xiāng)見察至嗵過UV射線 或者生理學(xué)色素形成劑刺激色素形成。
植入在自由膠原(非拉緊的)基質(zhì)的成纖維細(xì)胞也被用于重建色素皮膚。 然而，這些模型具有不肖,用于評估色素形成調(diào)節(jié)的缺點。
Bertaux等(BrJ Dermatol 1988)開發(fā)了一種色素皮膚的模型，其通過將皮 膚活組織樣品(bK)psy)弓l入到真皮等同物上，以使表皮細(xì)胞離開表皮并在格架 表面增殖。在這種技術(shù)的缺點中，需要提到缺乏對表皮細(xì)胞的控制，以及利用 活組織樣品僅可能有一種皮膚重建因此沒有實驗可以用于與其他進(jìn)行比較(無 可再現(xiàn)性)。此外，如Haake禾B Scott開發(fā)的模型(Scott and Haake， J.Invest Dermatol 1991)，這種模型不能顯示任何實際的功能組成型或誘導(dǎo)性出現(xiàn)黑色 素都沒有l(wèi)^見察到。在Archambault等人的模型中(J Invest Deimatol. 1995)，在UVB射線誘導(dǎo) 之后刺激黑色素形成，但是誘導(dǎo)表皮改變的劑量(細(xì)胞毒性劑量)構(gòu)成了完全 不能被接受的條件以肯的多研究在接近生理環(huán)境的體外環(huán)境中研究細(xì)胞形成及其 調(diào)節(jié)。
最近，已經(jīng)進(jìn)行了其他的努力以在自由格架支持物(free lattice support)上 重建色素重建皮膚；然而，所獲得的模型不對應(yīng)正常人皮膚的模型；因為，它 們是使用小鼠黑色素細(xì)胞形成的(YoshimuraJDermatolSci2001)，或者在存在 TPA時在誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)化的條件下培養(yǎng)黑色素細(xì)胞而形成的(Liu Cell Biol Int 2007)。至于由MartinhaoSauto等人(Sao Paulo Med J 2006)開發(fā)的模型，不存 在黑色素細(xì)胞，或者其不顯示在表皮中。
因而，需要一種模型，其能夠獲得對皮，極其破環(huán)、再現(xiàn)人皮膚生理相互 作用的相關(guān)理解。
還需要一種用于評估皮膚色素色素形成調(diào)節(jié)的方法，其能夠獲得對所有參 與皮膚色素形戯其破壞、再現(xiàn)人皮膚生理相互作用的機(jī)制的理解。
特別地，需要一種皮膚等同物，其含有功能活黑色素細(xì)胞，該活黑色素細(xì) 胞具有與存在于人皮膚中的相似定位，以及帶有活成纖維細(xì)胞的真皮區(qū)室 (dermal compartment )。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的主題是一種體外皮膚等同物，其特征在于它含有至少一種 表皮等同物和至少一種真皮等同物，以及特征在于它含有黑色素細(xì)胞，所述黑
色素細(xì)胞組成型地合成黑色素；該黑色素被被轉(zhuǎn)移到角質(zhì)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的 皮膚等同物還包含活成纖維細(xì)胞。
因此，根據(jù)本發(fā)明的皮膚等同物顯示了組成型色素形成，即在不存在任何 UV射線或者促色素形成活性齊魄lj激時的色素形成。術(shù)語"組成型色素形成"的 意思是指黑色素細(xì)胞在未刺激的基礎(chǔ)狀態(tài)上產(chǎn)生黑色素的能力。這種色素形成 對應(yīng)存在一種黑色素細(xì)胞，，生理條件下產(chǎn)生在黑色素體內(nèi)部的成熟黑色素； 通過黑色素細(xì)胞的樹突，黑色素被移到角質(zhì)細(xì)胞，其在表皮同等物中提供了 色素形成的均勻分配。在黑色素細(xì)胞和附近的角質(zhì)細(xì)胞中存在黑色素顆粒證 明了組成型色素形成。
更特別地，本發(fā)明是一種人皮膚等同物。特別地，本發(fā)明涉及整個以及功能性色素形成單元(或者復(fù)合物)，其包含
正常的人黑色素細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以及基質(zhì)環(huán)境；所述單元(或者 復(fù)合物)含有至少一種表皮等同物和至少一種真皮等同物，并且含有組成型和 功能性色素組分(在生理學(xué)條件下是組成型以及可誘導(dǎo)的色素形成)。
本發(fā)明的主題還是一種方法，用于評估試劑調(diào)節(jié)色素形成的能力，其特征 在于
(a) 所述試劑被施用到體外皮膚等同物上，所述皮膚等同物含有至少一種 含有組成型產(chǎn)生黑色素的黑色素細(xì)胞的表皮等同物，和至少一種含有活成纖維 細(xì)胞的真皮等同物，和
(b) 將已經(jīng)被施用待評估試劑的體外皮膚等同物的色素形成(i)與未被 施用所述試齊啲對照皮膚等同物的色素形成(ii)進(jìn)行比較。
除非另外指定，術(shù)語"一種(an)"試劑在本申請中應(yīng)該被理解為意思是"至 少一種"。
為了比較的目的，可以廣義上對色素形成的調(diào)節(jié)進(jìn)行定性和定量分析?？?以使用任何下列方法進(jìn)行分析
-色素形成和/，膚等同物的顏色，以及黑色素的量和性質(zhì)，及其轉(zhuǎn)移到角
質(zhì)細(xì)胞中以及在角質(zhì)細(xì)胞中卩絲軍；作為例子，可提及的方法有通過直接或間接
比色法(亮度和ITA測量)，通過選擇性光譜學(xué)((窄譜反射分光光度計 (mexameter)測量法)，通過皮內(nèi)分析分光光度法(siascopy)， ffl31高效液相色 譜HPLC測量法(測量DHI-黑色素，DHICA黑色素，褐色素(pheomelanin))， 在使用Soluene或者氫氧化鈉溶解皮膚后通過可見分光光度測定法，在使用 Fontana-Nasson對黑色素染色后Mil圖象分析法，通過共聚焦和多光子成像法， M電子順磁共振法，M31射電顯微鏡法；
-黑色素細(xì)胞中產(chǎn)生的、轉(zhuǎn)移至桷質(zhì)細(xì)胞和域在角質(zhì)細(xì)胞中被糊牟的黑色素
體的數(shù)量，形態(tài)和成熟度；
-黑色素體蛋白質(zhì)的量、成熟度和/或酶活性，例如pmel-17、酪氨酸酶、 TRP-1、 TRP-2 (DCT)、 MATP、蛋白質(zhì)PMART國1、 SCL117A、 SLC24A5
(nckx5)、 OA1; -黑色素細(xì)胞的數(shù)量、分布、形態(tài)(樹狀細(xì)胞(dendncity)); -細(xì)胞膜、胞液和細(xì)胞核水平上受體、分子、轉(zhuǎn)錄因子的量、成熟度和/或酶活性，其參與黑素原形成、在樹突細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運以及黑色素轉(zhuǎn)移至桷質(zhì)細(xì)
胞內(nèi)以及黑色素體轉(zhuǎn)移到角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。例如，可提及的例子有MC1-R、 m-KIT、 ETB-R、 ETA陽R、 MTTF、 USF-1、 SOXIO、阻凝蛋白Va、 Rho、 Rac、 Rab27A、黑色素親和素(melanophilin)。
所使用的方法可以是用于評估蛋白質(zhì)及其編碼基因表達(dá)的量和活性的方 法，例如多巴(Dopa)反應(yīng)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、組織染色、圖像分析、M 生物學(xué)(PCR)、分子化學(xué)(WB， ELISA酶免疫檢驗)等技術(shù)。
更特別地，該方法4頓人皮膚等同物，以及特別地至少包含來自人皮膚的 黑色素細(xì)胞和/或角質(zhì)細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞的皮膚等同物，有利地至少包含來自 人皮膚的黑色素細(xì)胞。
特別地，因此，該方法應(yīng)用于整個以及功能性色素形成單元(或者復(fù)合物)， 其包含正常的人黑色素細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以及基質(zhì)環(huán)境；所述單元 含有至少一種表皮等同物和至少一種真皮等同物，并且含有組成型和功能性色 素組分(在生理學(xué)條件下是組成型以及可誘導(dǎo)的色素形成)。
事實上，在本發(fā)明中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以獲得滿足，要求的模型，其具有下列 特征
-它包含參與色素形成的主要細(xì)胞參與物，即黑色素細(xì)胞，還包含其主要細(xì) 胞搭檔(partner):角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。
-它再現(xiàn)了皮膚的三維結(jié)構(gòu)以考慮和實現(xiàn)細(xì)胞搭檔之間、真皮-表皮連接和 細(xì)胞外基質(zhì)之間天然存在的接觸和影響。
-它是功能性的，即在基礎(chǔ)狀態(tài)中色素形成(組成型色素形成)，并且能夠 被UV射線和/或被促色素形成試劑在再現(xiàn)生理5嫁的^(牛下!頗臓的色素 形成。
根據(jù)本發(fā)明的模型含有三種在皮膚中出現(xiàn)的參與色素形成的主要細(xì)胞類 型， 結(jié)構(gòu)上接近皮膚，并因此能夠再現(xiàn)通過其細(xì)胞搭檔和細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié) 黑色素細(xì)胞和色素形成。
事實上，在皮膚中，色素細(xì)胞與附近的表皮和真皮細(xì)胞緊密聯(lián)系。禾l」用其 在基礎(chǔ)層中的定位，在表皮-真皮分界面處，在黑色素細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞之間以及 在黑色素細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間存在物理和化學(xué)聯(lián)系。與這兩種細(xì)胞類型的這 些相互作用的功能是調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞和色素形成。公認(rèn)的，ffi51角質(zhì)蛋白所釋放的旁分泌(paracrine)因子，以及M51由E-鈣粘蛋白所建立的直接物理連接，角質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞的粘附、生長和存 活以及所產(chǎn)生黑色素的量和性質(zhì)。這些因子中，可提及的例如，a黑色細(xì)MU 激激素(MSH)、內(nèi)皮素(endothelin) 1 (ET1)、干細(xì)胞因子(SCF)、前列腺 素E2和F2a (PEG2、 PEF2a)、減性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)或者神經(jīng) 生長因子(NGF)。
類似的，現(xiàn)在清楚了成纖維細(xì)胞在色素形成中所發(fā)揮的作用iiii分泌與 角質(zhì)細(xì)胞所產(chǎn)生的那些相同的因子例如bFGF、 SCF或者肝細(xì)胞生長因子 (HGF)，，或者不同的因子例如dickkopfl和基質(zhì)蛋白、成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)黑色素 細(xì)胞的發(fā)育、生長形態(tài)和分化。
此外，真皮-表皮連接的組分，真皮細(xì)胞外^質(zhì)(ECM)的M對黑色素細(xì) 胞和色素形成也具有影響。這是因為黑色素細(xì)胞M51整合素(integrin)和受體 粘附到基膜(basal membrane)的分子上，特別是粘附到層粘連蛋白(lammin) 和IV 原，并且基膜分子的存 于糾正黑色素細(xì)胞的基鵬立置是必要的。 真皮-表皮連接(或者DEJ)的質(zhì)量(其組分和它們的定位由成纖維細(xì)胞和角質(zhì) 細(xì)胞之間的相互作用而產(chǎn)生)，會影響在DEJ的錨定(整合素)類型。
來自成纖維細(xì)胞的ECM蛋白的調(diào)節(jié)也會影響增殖，形態(tài)和正常黑色素細(xì) 胞的黑素原活性。特別的，膠原I、 IV型膠原、成纖維細(xì)胞和層粘連蛋白(laminin) 刺激酪氨酸酶活性，和調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞的樹突(dendricity)和它們的增殖。
此外，存在調(diào)節(jié)的細(xì)胞循環(huán)角質(zhì)細(xì)胞能夠直接作用于黑色素細(xì)胞或者間 接作用于成纖維細(xì)胞，其接著會調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞例如，角質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-1 a和TNF- a能夠刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生HGF和SCF，這接著會激活黑色素細(xì)胞。 類似的，成纖維細(xì)胞可以釋放細(xì)胞因子，其刺激角質(zhì)細(xì)胞(例如KGF)。這些角 質(zhì)細(xì)胞接著會產(chǎn)生色素形成調(diào)節(jié)因子。
同樣還已知，將皮膚暴露到陽光下會誘導(dǎo)色素形成的刺激；這就是曬黑， 其對應(yīng)黑色素細(xì)胞的瞬時激活以及黑色素合成的提高。
這種應(yīng)答主要應(yīng)歸于搭檔細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的旁分泌因子，UV 射線提高了所述旁分泌因子的產(chǎn)生。
根據(jù)本發(fā)明的模型出乎意料的能夠再現(xiàn)這些現(xiàn)象并因此能夠測試物質(zhì)或者 能夠改變皮膚色素形成的刺激(stimuli)。根據(jù)本發(fā)明的評估方法倉,考慮所有這些現(xiàn)象，并因此評估物質(zhì)或旨嫩直 接和/或間接地調(diào)節(jié)皮膚色素形成的朿微的能力。
根據(jù)本發(fā)明的皮膚等同物或者重建皮膚具有分層分化(stratified differentiated)的含有至少一種表面層和至少一種基層(basallayer)的表皮等同 物。有利地，角質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)再現(xiàn)了表皮的特征，即具有與真皮等同物接觸的 基層的分層的多層上皮，其上層反應(yīng)了分化，從深底至外周再現(xiàn)了表皮的基底 (suprabasal)層(或棘細(xì)胞層)、顆粒層(stratum granubsum)和表皮的角質(zhì)層 (Stratum comeum)。表皮等同物的表面層應(yīng)被理解為意思是至少一層，其對應(yīng) 基底層、顆粒層或角質(zhì)層。
可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中任何已知的方法制備用于表皮等同物的角質(zhì)細(xì)胞。例 如，可提及的是培養(yǎng)從來源于正常或病理狀態(tài)皮膚樣品的分離的表皮。
im地，根據(jù)本發(fā)明，從來源于正常或病理狀態(tài)的人皮膚樣品的分離的表 皮樣品制備所〗頓的角質(zhì)細(xì)胞，特別是根據(jù)描述在Rheinwald和Green， Cell, vol. 6， 331-334， 1975中的方法。它們可以來源于高加索人、亞洲或者非洲人皮 膚，來源于不同的解剖學(xué)位置(例如，特別是背部、臉部、胸部、手背、手掌 等)，來源于暴露或者未暴露于陽光的區(qū)域?？梢允褂脕碓从谡Ｆつw的角質(zhì)細(xì) 胞。根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，同樣可以使用來源于病理狀態(tài)皮膚，例如老 年斑(光化學(xué)的斑點)、黑斑病(melasma)、白癜風(fēng)、痣、著色性干皮病或者黑 素瘤的角質(zhì)細(xì)胞。它們也可用是過表達(dá)(overexpressing)或表達(dá)不足 (undere鄧ressing)某些基因的遺傳像飾的角質(zhì)細(xì)胞。
黑色素細(xì)胞被整合至撥皮中并且被定位在本發(fā)明表皮等同物的基層中。這 些黑色素細(xì)胞被均勻±也分布在表皮等同物中，即，它們的分配密度在與所述真 皮等同物平行的表面中是基本上恒定的，并且與在人類皮膚中發(fā)現(xiàn)的那些基本 上類似。因此，所有這些黑色素細(xì)胞都在本發(fā)明表皮等同物的基層中，在表皮 等同物的上基層(suprabasal layer)和角質(zhì)層中黑色素細(xì)胞的缺乏證明了重建的
黑色素細(xì)胞是最初來源于成人、年輕人或者嬰兒皮膚，特別是成人皮膚的 黑色素細(xì)胞。這些黑色素細(xì)胞表達(dá)TRP-2酶，不同于毛囊的黑色素細(xì)胞。因此， 所合成的黑色素的性質(zhì)不同表皮中的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生由DHI-黑色素和 DHICA-黑色素構(gòu)成的真黑色素，然而，由于缺乏TRP-2的表達(dá)，因此，毛發(fā)中的黑色素細(xì)胞僅主要產(chǎn)生Dffl-黑色素。
此外，皮膚黑色素細(xì)胞的主要生理學(xué)刺激是UV射線，其通31激活黑色素
的黑素原形成和黑色素的重新分配，而誘導(dǎo)皮膚變棕色，曬黑。這種生理學(xué)功
能不包括毛發(fā)黑色素細(xì)胞，其色素形成也不是由uv射線誘導(dǎo)的。
該黑色素細(xì)胞可以是來源于高加索人、亞洲或者非洲人皮膚，來源于各種 解剖學(xué)位點(例如，特別是背部、臉部、胸、手臂部、手掌等)，來源于暴露或 未暴露于陽光的區(qū)域?？墒褂脕碓从谡Ｆつw的黑色素細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的特 定實施方案，還可以使用來源于病理狀態(tài)的皮膚例如，斑(光化學(xué)斑點)、黑
斑病(melasma)、白癜風(fēng)、痣、干皮病黑素沉著或者黑素瘤。它們也可以^！ 表達(dá)(overexpressing)或者表達(dá)不足(underexpressing)某些基因的遺傳^t布黑 色素細(xì)胞。
定位于在基層的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黑色素體和黑色素，黑色素體和黑色素被 轉(zhuǎn)移到附近的角質(zhì)細(xì)胞中。因此，可以再現(xiàn)皮膚的表型，即具有與該類型黑色 素細(xì)胞相關(guān)的或多或少強(qiáng)烈組成型色素形成的皮膚?？梢酝ㄟ^任何測量色素形 成或黑色素量的方法，例如通il分光光度法(spectrocobrimetiy)(亮度測量法)， fflii高效、液相色譜HPLC測量法，通過在用soluene或，氧化鈉^l軍皮膚之后 的可見分光光度法，或者^f頓Fotana-Masson對黑色素染色后M圖像分析，通 過共聚焦成像或者多光子成像，對組成型色素形成進(jìn)行定量。
有利地，根據(jù)Chardon等人的技術(shù)測量(在Biological responses to ultraviolet Aradiation， EdUrbach 1992)，根據(jù)本發(fā)明的皮膚等同物在不存在任何UV射線 暴露和/或促色素形成試劑時，具有小于或等于80的亮度。該數(shù)值可以更低，特 別是在非洲人皮膚等同物中，并且對于在非常亮到黑色的表型，該數(shù)值特別地 可以在+80至40的范圍內(nèi)。通常，在缺乏UV射線時，根據(jù)本發(fā)明的色素重建 皮膚與不包含黑色素細(xì)胞的重建皮膚相比，具有具有至少1.5的亮度差異(AL)。
根據(jù)本發(fā)明的真皮等同物含有主軸定位為至少兩個垂直方向的成纖維細(xì) 胞。有利的，相對于真皮等同物表面，縱向定位的成纖維細(xì)胞的百分比為低于 50%。
真皮等同物含有自由膠原基質(zhì)或者格架，其能夠在所有方向上收縮，并且 在沒有活組織樣品時是均勻收縮的；如合適，在連續(xù)的膠原凝膠體中分布有其
他細(xì)胞。真皮等同物含有至少一種I型膠原基質(zhì)，成纖維細(xì)胞分布在其中。它也可 以含有其他的細(xì)胞外基質(zhì)成分。術(shù)語"細(xì)胞外基質(zhì)成分"特別地g分子例如
膠原，特別是IVMJK原、層粘連蛋白(laminin)、巢蛋白(entactin)、纖連蛋白 (fibronectin)、蛋白聚糖、糊安聚糖或者透明質(zhì)酸。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案， 真皮等同物至少含有IV型膠原和層粘連蛋白； 地，它還含有巢蛋白。本領(lǐng) 域技術(shù)人員可以對這些各種成分的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，例如對于層粘連蛋白，在最 終#^只的1%至15%之間，對于IVMK原，在最終#^只為0.3%至4.5%之間， 對于巢蛋白在最終體積為0.5%至1 %之間。
所使用的膠原可以是來源于牛的膠原，來自大鼠尾部或者來自魚，或者任 何其他天然膠原來源^il過在存在成纖維細(xì)胞時，允許收縮的遺傳工程所制造 的膠原。
該基質(zhì)是M水平和垂直的收縮獲得的非拉緊膠原凝膠，其不利用成纖維 細(xì)胞的優(yōu)先組織。這樣的基質(zhì)，也稱術(shù)語"自由"(free),不會黏附到支持體上， 并且它們的體積能夠被無限制地更改，為其提供了不同的厚度和直徑；真皮等 同物的厚度通常為至少0.05cm，特別地為大約0.05至2cm，但是可以得到提高 而不破壞本發(fā)明皮膚等同物的有利性質(zhì)；同樣地，本領(lǐng)域技術(shù)人員將其厚度從 大約3mm調(diào)節(jié)到20cm或更大。
在含有活成纖維細(xì)胞的真皮區(qū)室與多層(multistra他ed)表皮等同物之間， 接觸是直接的，并且構(gòu)成與體內(nèi)所存在的類似的真皮-表皮連接，兩者都來自結(jié) 構(gòu)觀點和來自于生物化學(xué)觀點。從生物化學(xué)觀點，它含有基膜；致密板、透明 板和基底下部分的組分，例如，尤其是IV型膠原、vn型膠原、層粘連蛋白 (laminin) 5、巢蛋白或者纖連蛋白。
用于根據(jù)本發(fā)明評估方法的皮膚等同物，可以還含有內(nèi)皮細(xì)胞、真皮乳頭 細(xì)胞、免疫細(xì)胞例如淋巴細(xì)胞、樹枝狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或朗格漢斯細(xì)胞 (Langerhans)、月旨肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及其混合物。
如上所述，皮膚等同物表現(xiàn)出組成型色素形成，和色素形成也可以通31暴 露到促色素形成齊訴卩/或暴露到UV射線而得到增加。
特別的，在通過相當(dāng)于個體的人皮膚在生理條件下所受到的每日或露天 (zenithal)輻射的劑量下以UV射線刺激之后，根據(jù)本發(fā)明的模型的成纖維細(xì) 胞產(chǎn)生了胞液因子例如參與色素形成和/或其調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子(cytokines)或者
12增長因子。
此外，在UV射線刺激后，基層中黑色素細(xì)胞的數(shù)量提高至鵬別至少1.5 倍，所述黑色素細(xì)胞的形態(tài)被改變它們通過樹突數(shù)量和它們延長的提高而顯
示了顯著地樹突度(dendricity)的提高；通過合成以及M提高轉(zhuǎn)移到表皮層， 黑色素的量也提高到大于或等于1.5倍。
通過測量皮膚亮度的變化或其他定量黑色素的方法而評估色素形成的提 高，例如通過使用高效液相HPLC測量、在使用soluene或體氧化鈉溶解皮膚 之后可見光分光光度測量、使用Fontana-Masson染色黑色素后圖像分析或者通 過共聚焦或者多光子成像。
因此，在UV射線之后，根據(jù)本發(fā)明的模型的生理學(xué)功能表現(xiàn)出了下列參 數(shù)的改變
-宏觀顏色暴露到UV射線的皮膚比綠露的皮膚黑得多M亮度的
降低而對色素形成的這種宏觀刺、M行定量(DL=4.38)。
-黑色素細(xì)胞密度如同正常皮膚，UV射線之后，黑色素細(xì)胞密度得到提 -黑色素量在UV射線之后，色素形成的確得到刺激；黑色素的量得到
提高，并且fflii在Fontana-Masson染色(染色以顯示黑色素顆粒)之后的圖像 分析，或者M(jìn)31在JOT soluene或氫氧化鈉提取之后的檢驗，對該提高進(jìn)行定量。 本發(fā)明的主題還包括制備這，膚等同物的方法。特別地，該方法包括下 列步驟
a) 使成纖維細(xì)胞和膠原溶液進(jìn)行接觸，然后孵育充分的時間，以獲得在 其中分布成纖維細(xì)胞的收縮的膠原基質(zhì)，這構(gòu)成了真皮等同物，
b) 為a)中所獲得的真皮等同物接種角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的混合物，并 在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行浸沒式培養(yǎng)(immersionculture),
c) f吏得在b)中獲得的W4咅養(yǎng)物(接種在真皮等同物上的角質(zhì)細(xì)胞和黑 色素細(xì)胞)浮現(xiàn)(emersion),并在氣-液界面繼續(xù)培養(yǎng)，直到在膠原基 質(zhì)中含有成纖維細(xì)胞的表皮等同物上獲得了分層的含有黑色素細(xì)胞的 表皮等同物，這構(gòu)成了皮膚等同物。
4，地，表皮等同物形成了角質(zhì)層，黑色素定位于基底層之上。 可以將所獲得的皮膚等同物取出，或者在其支持物上用于各種評估方法中?？梢允褂肐型膠原進(jìn)4，驟a，特別是牛來源的或者在均勻懸浮液中的I型 膠原和111 原的混合物(相對于格架的中終體積為大約30%)。有利地，向 其添加其他成分，例如層粘連蛋白(特別地，相對于終體積的1%-15%)、 IV 型膠原(特別地，相對于終體積的0.3%-4.5%)禾口/或巢蛋白(特別地，相對于 終體積的0.05%-1 %)，以便獲得均勻的懸浮液。
從人皮膚獲得成纖維細(xì)胞，有利地來自成人皮膚。它們可以是乳頭狀和/ 或網(wǎng)狀成纖維細(xì)胞，單獨地或者任何比例的混合物，來自高加索人、亞洲人或 者非洲人皮膚，來自不同解剖學(xué)位點(背部、臉部、胸部、手背、手掌等)，來 自暴露或者沒有暴露至恍照的區(qū)域。在一^f寺定的實施方案中，j頓來自病理 狀態(tài)皮膚，例如老年斑(光化學(xué)斑點)、黑斑病(melasma)、白癜風(fēng)、痣、黑素 瘤或者干皮病黑素沉著的成纖維細(xì)胞。它們也可以是過表達(dá)(overexpressing) 或者皿不足(underexpressing)某些基因的遺傳修飾成纖維細(xì)胞。
將它們培養(yǎng)在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)培養(yǎng)基中，接著懸浮，隨后與膠 原和生長因子的懸浮液混合。在大約37。C、鵬下，通常在36。C和37.5。C之間， 將混合物孵育l-6天，優(yōu)選4或5天。有利的，將混合物孵育在支持物上，所述 支持物不允許混合物附著，特別是，防止混合物附著到支持物的邊緣；特別地，
可以iiii對其表面進(jìn)^f員處理而獲得這類支持物，例如通過為所述表面涂覆牛
白蛋白或血清。因此獲得了膠原凝膠，其中當(dāng)除掉營養(yǎng)培養(yǎng)基時，獲得的膠原 凍IK在多個方向上是自由收縮的，并且在所繊原凝膠中植入了成纖維細(xì)胞。
為了實施步驟b， j頓來源于人皮膚的角質(zhì)細(xì)胞，tti^自成人皮膚。它 們可以來源于高加索人、亞洲人或者非洲人，來源于不同的解剖學(xué)位點(背部、 臉部、胸部、手背、手掌等)，來源于暴露或者沒有暴驗光照的區(qū)域。在一個 特定的實施方案中，使用來源于病理狀態(tài)皮膚的角質(zhì)細(xì)胞，例如老年斑(光化 學(xué)斑點)、黑斑病(melasma)、白癜風(fēng)、痣或者黑素瘤。它們也可以是過表達(dá) (overexpressing)或者表達(dá)不足(underexpressing)某些基因的遺傳修飾角質(zhì)細(xì) 胞。
可以根據(jù)常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得角質(zhì)細(xì)胞的制備物。
特別地，可以l柳從個體提取的皮膚外植體(explant)實施下列程序
-使用解剖刀取出皮下組織；
-M抗生素處理來)t化皮膚樣品(例如慶大霉素)；-M31蛋白質(zhì)7j^率處理從表皮上分離真皮(例如胰蛋白麟n分散酶)， 接著切片；
- 隨后在存在0.05X胰蛋白酶和0.02XEDTA的溶液時，促翻胞的解離; ffl31添加含有10%血清的DMEM培養(yǎng)載體來中和胰蛋白酶的效果；
- 對細(xì)胞懸浮、M行勻漿，并隨后根據(jù)Rheinwald和Green (Cell, 1975)
的技術(shù)在角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行清洗。
在根據(jù)Rheinwald和Green (Cell, vol.6， 331-344， 1975)的技術(shù)進(jìn)行接禾中 之前，通過在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適培養(yǎng)其中在由3T3成纖維細(xì)胞構(gòu)成的 滋養(yǎng)支持物上的培養(yǎng)，在存在生長因子特別是氨基酸、血清、霍亂毒素、胰島 素、三碘甲狀腺氨酸禾口pH緩沖溶液時，對角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。特別地，這類培 養(yǎng)基可以特別地含有至少一種角質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂原生長因子(例如表皮生長 因子(EGF)禾口/或角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)，特別是KGF)，胰島素，氫化可 的松，以及任選地抗生素(例如慶大霉素、兩性霉素B)。
有利地，所述培養(yǎng)基還可以含有血清或者垂體提取物，例如牛來源、腎上 腺素、鐵傳遞蛋白和/或非必需氨基酸的提取物。
黑色素細(xì)胞是來源于年輕人或者成年人 的黑色素細(xì)胞，來自高加索人、 亞洲人或者非洲人皮膚，來自不同的解剖學(xué)位點(背部、臉部、胸部、包皮、 手背、手掌等)，來自暴露或者沒有暴驗光照的區(qū)域。在一M寺定的實施方案 中，i頓來源于病理學(xué)的皮膚的黑色素細(xì)胞，例如群斑(光化學(xué)斑點)、黑斑 病(melasma)、白癜風(fēng)、痣或者黑素瘤。它們也可以是過表達(dá)(overe鄧ressing) 或者皿不足(undere鄧ressing)某些基因的遺:傳修飾黑色素細(xì)胞。
在不存在佛波醇酯時，M5i在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中的培養(yǎng)對它們進(jìn)行擴(kuò)增，所 逸適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基例如DMEM/F12或者M(jìn)CDB153，并且補充了 黑色素細(xì)胞特異性生長因子(例如，bFGF、 SCF、 ET-1、 ET3或者aMSH)， 和特別地，在M2培養(yǎng)基(Promocell)或者其他i音養(yǎng)基例如M254 (Cascades Biologies )中。
黑色素細(xì)胞以及角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液是從這些培養(yǎng)物制備的，并且被混 合以獲得混合的角質(zhì)細(xì)膨黑色素細(xì)胞懸浮液。黑色素細(xì)膨角質(zhì)細(xì)胞的比例可以
在l: 10和2: l之間，以M常為大約h 1。
因此，根據(jù)本發(fā)明的皮l^等同物的制備方法包括分別在它們各自生長培養(yǎng)基中擴(kuò)增角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的步驟。然后，使細(xì)胞分離，并直接以限定的 密度和限定的比例離種至慎皮等同物上。
該方^^括在擴(kuò)增過程中，以及將表皮細(xì)胞接種到真皮等同物上的過程中， 對每種類型細(xì)胞的更好適應(yīng)性和可能的控制。對所接種每種細(xì)胞的量以及比例 的這種控制代表了工業(yè)應(yīng)用上就控制表皮重建以及再現(xiàn)性而言的優(yōu)點。
因此，根據(jù)本發(fā)明的變型，可以看出，可以j頓來自正常皮膚的角質(zhì)細(xì)胞 和黑色素細(xì)胞，或者可以使用來自病理狀態(tài)皮膚的黑色素細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞，甚 至可以使用一半來自病理狀態(tài)皮膚的細(xì)胞類型，另一半對應(yīng)正常的健康細(xì)胞。
將這種混合的懸浮液沉積在真皮等同物上；并有利地將真皮等同物fflil生 物材料例如膠原貼至忮持物上。將黑色素細(xì)鵬角質(zhì)細(xì)胞懸浮液沉積在環(huán)上或者
任何等同的裝置上以將其維持在劃界的表面部分(delimited surface part)上。液
體營養(yǎng)培養(yǎng)基以一種覆蓋細(xì)胞混合物的方式添加進(jìn)去；該培養(yǎng)基含有本領(lǐng)域技 術(shù)人員己知的生長因子，特別是EGF禾Q/或KGF。定期更換培養(yǎng)基，并以浸沒 方式繼續(xù)培養(yǎng)，通常持續(xù)2到10天之間，特別是5至8天，大約7天。有利地， 培養(yǎng)基從浸沒的第2天開始含有KGF，以及理想地在沉浸的第4天開始。
如上所述，皮膚等同物可以含有正常的成纖維細(xì)胞和/或病理來源的成纖維 細(xì)胞。這些不同類型的真皮可以從正常 例狀態(tài)角質(zhì)細(xì)膨黑色素細(xì)胞的混合 物制備的表皮等同物結(jié)合。
隨后，將皮膚以本身已知的方式浮現(xiàn)，以獲得角質(zhì)細(xì)胞的分化以及分層表 皮等同物的形成。該步驟c對應(yīng)對空氣-液體界面處作為高出水面的部分 (ememon)繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，直到獲得分化的結(jié)構(gòu)，通常大約為7天。然而，步 驟c可以延續(xù)更長實踐，例如大約28天，而同時保存了具有上文中所限定有利 特征的皮膚等同物。營養(yǎng)培養(yǎng)基可以被定期更換。隨后，取出皮膚等同物已進(jìn) 行必需的測試。
制備方法不使用誘變物質(zhì)例如TPA或PMA，并且細(xì)胞沒有展示出任何腫 瘤鄉(xiāng)的變化。
可以根據(jù)本發(fā)明獲得的皮膚模型顯示出組成型色素形成，以及允許可誘導(dǎo) 色素形成的功能，對于沒有任何移植到更完整活生物的體外模型就是如此。
根據(jù)本發(fā)明的皮l^模型f嫩從各種角度理解調(diào)節(jié)黑色素原形成的途徑。這 可以由對黑色素細(xì)胞的直接活性反映，也可以由角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、整體
16三位環(huán)境以及微環(huán)境影響所介導(dǎo)的(促色素形成或抗色素形成)活性反映。 特別地，其可以用于各種評估方法。
在實施本發(fā)明方法中要被評估的試劑可以是任何化學(xué)或生物學(xué)物質(zhì)或化合 物或物理處理或現(xiàn)象，其可以調(diào)節(jié)或者旨,直接或間接調(diào)節(jié)色素形成。
作為可以根據(jù)本發(fā)明來評估的物理處理的例子，可提及的有光輻射，例如
UV或者IR射線，特別是利用LED (發(fā)光二極管)處理。
"將試劑應(yīng)用到皮膚等同物"的意思是'皿待評估的試劑與至少一部 分皮膚等同物之間的相互作用的事實，而不管是M31直接接觸，還是通過其他 方式。
特別地，本發(fā)明涉及篩選可以調(diào)節(jié)色素形成的試劑的方法，所述試劑可以 是化合物或化合物的混合物，特另提通過化學(xué)合成或者艦從植物或者細(xì)菌膽 母原材料提取而獲得的。該方法特別可以用于篩選并鑒定用于化妝品領(lǐng)域的中 的活性劑。因此，所述試劑可以是任何分子、生長因子、維甲酸衍生物、激素 或者能夠影響表皮、真皮或者連接區(qū)室(compartment)的植物提取物。調(diào)節(jié)器 可以是siRNA或者antagomirso
該方法還可以用于評估用于制藥領(lǐng)域特別是皮膚病領(lǐng)域的活性劑的色素形 成調(diào)節(jié)。
根據(jù)其他方面，根據(jù)本發(fā)明的方法能夠評估當(dāng)施用色素形成調(diào)節(jié)劑時，所 參與的各種因子的修飾作用。
術(shù)語"調(diào)節(jié)色素形成"的意思是，根據(jù)本發(fā)明，改變組成型或者誘導(dǎo)的皮 膚色素形成，無論是提高，還是降低或者抑制，不管是直接還是間接。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，對照皮膚等同物將在與施用待評估試劑的皮膚等 同物的那些相同的條件下制備和儲存，并在相同的時間對對照皮膚等同物和已 經(jīng)接受待評估試劑的皮膚等同物進(jìn)行色素形成的測量。
根據(jù)一個實施方案，通過直接與一部分皮膚等同物接觸，而施用待評估的 試劑。根據(jù)另外一個實瓶左案，還可以在所述皮膚等同物的培養(yǎng)基中施用試劑， 甚至M將試劑與皮膚等同物的成分之一進(jìn)行間,觸的方法。作為向皮膚等 同物施用試劑的非限制性可替換方法，特別需要提到注射、中胚層療法 (mesotherapy)或者離子導(dǎo)入法。
特別地，待評估的試齊何以被施用到艦等同物，所述皮膚等同物至少包含來自色素異常例如老年斑(光化學(xué)斑點)的成纖維細(xì)胞和/或角質(zhì)細(xì)胞和/或黑 色素細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明方法的實施方案之一，待評估的試劑是色素形成抑制劑，其中
期望測量其脫色素(depigmenting)禾口域抗色素形成活性。特別地，該方法肖, 評估期望防止，減緩或者減小色素斑點和/或色素紊亂的產(chǎn)品的效果。
根據(jù)其一方面，該方法^^評估脫色劑，也就是評估所述減少組成型或者 誘導(dǎo)的色素形成試劑的能力。
根據(jù)其他方面，該方法針對評估抗-色素形成劑，艮卩測試所述試劑防止和/ 或^1>所誘導(dǎo)的色素形成的能力。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，待評估的產(chǎn)品被將施用在戰(zhàn)的病理模型中，例如 過度色素形成或不足色素形成的異樣，例如白癜風(fēng)、黑素瘤、痣、光化學(xué)斑點、 malasma等，4柳從這些病理狀態(tài)分離的或者已鄉(xiāng)St傳1針布(沉默、過表達(dá)等) 的細(xì)胞(黑色素細(xì)胞以及角質(zhì)細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞)
根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實施方案，待評估的活性劑是單獨或者同UV 射線^ 色素形成的試劑。
另外，根據(jù)一4^寺定的實施方案中，皮膚等同物還被接受了 UV射線，其 中UV射線是在實施待評估試劑之前、同時和/或之后施用，或者施用了與對照 皮膚等同物相同的時間。
特別地，根據(jù)本發(fā)明的方法將用于評估防曬劑。
本發(fā)明還肖詢多評估色素形成-調(diào)節(jié)劑的光防護(hù)(photoprotective)能力。這將 包括在所述試劑刺激或抑制色素形成前或后UV曝光所誘導(dǎo)的損傷水平進(jìn)行比 較，特別就日灼細(xì)胞(s皿burncell)的形成，對DNA的損傷以及氧化應(yīng)體。
如上所述，皮膚等同物展示出組成型色素形成，并且另外可以通過暴露到 促色素形成劑(propigmenting agent)禾口/或UV射線而提高色素形成。
特別地，在使用UV射線以等價于在生理條件下個體的人皮l^f接受的每 日或露天輻射的劑量刺激之后，根據(jù)本發(fā)明模型的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生胞液因子 (cytosoluble factors),例如參與色素形成和/或其調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子或者生長因子。
此外，在UV刺激后，基層中黑色素細(xì)胞的數(shù)量提高到特別是至少1.5倍， 所述黑色素細(xì)胞的形態(tài)被改變它們由于樹突數(shù)量和它們延長的提高而顯示了 顯著地樹突度(dendricity)的提高；黑色素的數(shù)量也被增加，并通過到表皮層的增加的轉(zhuǎn)移，所述增加是大于或等于1.5倍。
通過測量皮膚亮度的變化或其他定量黑色素的方法而評估色素形成的提
高，例如M3K頓高效液相HPLC測量、在{頓soluene或龍氧化鈉溶解皮膚 之后可見光分光光度測量、使用Fontana-Masson染色黑色素后圖像分析或者通 過共聚焦或者多光子成像。
根據(jù)本發(fā)明的方法旨,評估UV射線對色素形成的影響，該UV射線育雜 直接作用于黑色素細(xì)胞和/或間接作用于角質(zhì)細(xì)胞，這又歡活黑色素細(xì)胞(對黑 色素原形成，或黑色素細(xì)胞增值或粘附發(fā)揮作用)。
其還可以獨特地評估UV射線對色素形成的影響，其中UV射線能夠作用
于
-成纖維細(xì)胞，細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白質(zhì)，和真皮-表皮連接處的成分。作為應(yīng) 答，這些誘導(dǎo)的因子或者改變能夠直接刺激黑色素細(xì)胞和/或間接刺激角
質(zhì)細(xì)胞，這3l將刺激黑色素細(xì)胞。
角質(zhì)細(xì)胞，這又將調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，和真皮-表皮
連接成分，進(jìn)而調(diào)節(jié)色素形成。 它還可以測試干擾組成型色素形成或陽光誘導(dǎo)的色素形成(曬黑)的產(chǎn)品
或者分子減緩、抑制或者剌激，局部地或者全身地。 -脫色劑，抗色素形成劑
-促色素形成試劑(制蟲或結(jié)合uv射線的色素形成激活劑)。
根據(jù)本發(fā)明的評估方法的一個變型，還利用對其色素形成促進(jìn)活性或，相 反地，其色素抑制活性已知的對照產(chǎn)品，進(jìn)行附加組的測量。
在該變型中，還將已經(jīng)被施用待評估試劑的體外皮膚等同物的色素形成
(1)，與已經(jīng)被施用色素形成iSS或色素形成抑制對照t/質(zhì)的皮膚等同物的色素 形成(iiO進(jìn)行了比較。
還可以，例如，在色素形成，劑的情況中，選擇保留的試劑，對于該試 劑色素形成至少大于或等于對對照物質(zhì)所觀察到的色素形成。相反地，在脫色 素試劑的情況中，可以保留該試劑，對于該試劑色素形成低于或等于對對照物
質(zhì)所獲得的色素形成。
一方面，還可以比較已經(jīng)施用待評估試劑的皮膚等同物與對照皮膚等同物 (i) - (ii)之間所測量的色素形成中的變化，且另一方面，可以比較己經(jīng)施用
19對照物的皮膚等同物與對照皮膚之間(iii) - (ii)之間所測量的色素形成中的變 化，所選擇的試劑將是色素形成的調(diào)節(jié)至少等于對照物質(zhì)所測量的那些的試劑。 根據(jù)一W寺定的實驗案，體外的皮膚等同物至少含有角質(zhì)細(xì)胞，黑色素 細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞，其已經(jīng)被遺傳i針布，特別i艦過cDNA的31^， Mil 經(jīng)由定點誘變或^il dsRNA，根據(jù)siRNA技;^利用shRNA的表達(dá)的基因淬 滅。
根據(jù)另一個實施方案，該真皮等同物含有細(xì)胞外基質(zhì)等同物，所述細(xì)胞外 基質(zhì)等同物的成分至少含有I型膠原，并且該成分與來自健^#￥皮膚的細(xì)胞外 基質(zhì)等同物相比已經(jīng)經(jīng)歷了至少一次修飾。例如，這可以包括構(gòu)成真皮等同物 的大分子的性質(zhì)、量或比例的變化和/或化學(xué)修飾。所述真皮等同物的組成和/ 或特別是存在的IV型膠原、層粘連蛋白(laminins)、巢蛋白、纖連蛋白、蛋白 聚糖、葡胺聚糖和/或透明質(zhì)酸的比例因此可以改變超出通常使用和上面所指定 的濃度。特別地，細(xì)胞外基質(zhì)等同物的成分可以經(jīng)歷選自糖基化(glycation)， 交聯(lián)和氧化的化學(xué)斷布。
根據(jù)本發(fā)明的方法會詢多從各種角度理解調(diào)節(jié)黑色素原形成的途徑。這可以 由對黑色素細(xì)胞的直接活性反映，但也可以由被角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、整體 三位環(huán)境以及微環(huán)境影響所介導(dǎo)的(促色素形成或抗色素形成)活性反映。 它可以評估試劑對色素形成的影響，其中所述試齊脂g夠作用于 成纖維細(xì)胞，細(xì)胞外的基質(zhì)蛋白質(zhì)，和真皮-表皮連接處的成分。作為 應(yīng)答，這些誘導(dǎo)的因子或者改變能夠直接刺激黑色素細(xì)胞和/或間接刺 激角質(zhì)細(xì)胞，這又將刺激黑色素細(xì)胞； 角質(zhì)細(xì)胞，這又將調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，和真皮-表皮 連接成分，并進(jìn)而調(diào)節(jié)色素形成。
因此，該方法可以用于
測試對來源于過度色素形成(hypeipigmented)或者不足色素形成 (hypopigmented)的細(xì)胞色素形成的影響，所述過度色素形成或者不 足色素形成例如白癜風(fēng)、黑素瘤、痣、光化學(xué)斑點、黑斑病等，這里 使用己從這些病理狀態(tài)分離的或者已經(jīng)遺傳修飾(沉默(silencing)、 過表達(dá)等)的細(xì)胞(黑色素細(xì)胞，但也可是角質(zhì)細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞)；
研究破壞角質(zhì)細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞(病理^1^態(tài)角質(zhì)細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞)對色素形成的影響； 用于研究破壞細(xì)胞外基質(zhì)對色素形成(糖基化、橋接(交聯(lián)))、細(xì)胞 外基質(zhì)的大肝的氧化駄分子性質(zhì)、量和比例的改變的影響。 本發(fā)明還涉及生產(chǎn)重建皮膚的試劑盒，其含有真皮支持物、黑色素細(xì)胞和
角質(zhì)細(xì)胞，和上述i音養(yǎng)基。
本發(fā)明在其后實施例中更詳細(xì)地解釋。在這些實施例中，參考下列附圖


圖l:人類重建色素皮膚
圖2:人 建色素皮膚，其具有與黑色素細(xì)胞類型相關(guān)的組成型色素形成。
圖3:使用UV射線在重建色素皮膚中誘導(dǎo)色素形成
圖4:在重建色素皮膚中使用a-MSH誘導(dǎo)色素形成。
具體實施例方式
^jj例l:皿等同物的制備 微麵CW游縱
{柳牛I MJ^原和來源于真皮的人成纖維細(xì)胞制備真皮等同物。
根據(jù)Asselineau等人1985 (Exp Cell Res.vol.159, 536-539)禾口Bemerd禾口 Asselineau1997 (Dev Biol， vo1.183， 123-138)中描述的技術(shù)，使用牛I型膠原 和來源于真皮的人成纖維細(xì)胞制備真皮等同物。i亥用含有10X血清的MEM對 有蓋培養(yǎng)皿(Petri dish)進(jìn)fi^頁涂覆。
在倒入含有細(xì)胞的膠原制劑之前，將層粘連蛋白的溶液(3%/最終體積)、 IV,原(1.5%慮終體積)和巢蛋白(0.35%/最終體積)加入到混合物中，劇 烈攪拌。將該懸浮液置于孵育器(37°C-5%C02)中，以使格架旨嫩收縮。
麥辦微應(yīng)微色激應(yīng),
在格架收縮之后，將角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)接種在真皮等同物上。
為此，在接種前，細(xì)胞在它們各自的生長培養(yǎng)基中擴(kuò)增7天
在黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)基，缺乏任何佛波醇酯的M2培養(yǎng)基(Promocell)中
擴(kuò)增黑色素細(xì)胞。
通過在由3T3成纖維細(xì)胞構(gòu)成的滋養(yǎng)(feeder)支持物上的培養(yǎng)，根據(jù) Rheinwald和Green, Cell, vol.6,331-344，1975中的^t對角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。為了在真皮等同物上接種角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞，首先，將格架使用基于
膠原的制劑(對于2個格架，0.46ml的1.76X MEM+0.09ml的FCS+0.05ml的 0.1N的NaOH+0.1ml的MEM Hepes 10%FCS+0.3ml的透析膠原)附著到培養(yǎng) 皿的底部。
使用胰蛋白酶對黑色素細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行處理，并將細(xì)胞懸浮液調(diào)節(jié)到 200 000個細(xì)lfi/ml的濃度，均利用由下列構(gòu)成的培養(yǎng)基MEM10%FCS+2mM 的L-谷氨翻^HmM的丙酮酸鈉+lX非必需氨基fr0.2X的青霉素/鏈霉素+0.1 ^的抗真菌抗生素+10n^ml的EGF， 10—10M霍亂毒素+0.4 " 1/ml的氫化可的松 +0.625 ul/ml的補充混合物(Promocell) 二PRP培養(yǎng)基。
用0.25ml的角質(zhì)細(xì)胞懸浮液和0.25ml的黑色素細(xì)胞懸浮液制備黑色素細(xì)胞 和角質(zhì)細(xì)胞的混^i:浮液。因此最終的懸浮液含有50 000個角質(zhì)細(xì)胞和50 000 個黑色素細(xì)胞，該最終的懸浮液沉積在置于所附著格架上的環(huán)內(nèi)部(直徑為 14mm)。在環(huán)周圍加入6ml的PRP培養(yǎng)基。
將培養(yǎng)皿置于37。C-5XC02的孵育器中。2小時后，取出環(huán)。2天后，更換 (refreshed)相同的培養(yǎng)基。
接禾中4天后，使用KGF (10ng/ml)替換PRP培養(yǎng)基的EGF (10ng/ml)。
凝經(jīng),微游微游線節(jié)
沉浸-培養(yǎng)7天后，皮膚露出篩子(氣-液界面)。每2天更換培養(yǎng)基。 浮現(xiàn)7天后，準(zhǔn)備取出與正常人皮膚表現(xiàn)出形態(tài)非常相近的皮膚，并進(jìn)行
分析，或者對于各種實驗，能夠在i咅養(yǎng)物中保持更長的實驗，而培養(yǎng)基則為每2
天更換一次。
^M例2:含有3種細(xì)J3fa，的AS建色素皿黑色素細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞 和纖維源細(xì)胞(圖l)
浮現(xiàn)7天后，皮膚展示出與人皮膚相近的組織學(xué)和三維結(jié)構(gòu)。 它具有分層和分化的由各種細(xì)胞層(基底、棘狀-細(xì)胞、粒狀的)和角質(zhì)層 組成的表皮。
該真皮含有植入在膠原基質(zhì)中的活成纖維細(xì)胞(圖1A)。 黑色素細(xì)胞整合到表皮中并顯示出于正常皮膚相似的g和密度(圖1C， 在分離的表皮上的DOPA反應(yīng))。他們明確地定位在基底層(圖1B， TRP1免 疫標(biāo)記，虛白線表示真皮-表皮連接處)，以及產(chǎn)生黑色素體和黑色素，其被轉(zhuǎn)移到附近的角質(zhì)細(xì)胞中(圖1D，利用Fontana-Masson染色黑色素)。
儘例3: Att色素艦，駄有與黑色素細(xì)胞類相關(guān)的組成型色素形
成(圖2)
該模型能夠M^從最低色素到最高色素(顯著模型(soundmodel))的各禾中 黑色素細(xì)胞株，或多或少形成色素的所重建皮膚的表型(phenotype)對應(yīng)于所 使用的黑色素細(xì)胞類型(物理維持)事實上，黑色素細(xì)胞株的色素越多 (M03 M504)，皮膚的宏觀顏色越深，切片上可看到的黑色素的fiM大。該宏 觀色素形成是由亮度的降低反映的(圖2，亮度)。
^fi例4:UV皿^m建色素皿中誘導(dǎo)色素形成(圖3 )
從浮現(xiàn)的7天開始，將重建皮鵬行太陽UV射線以誘導(dǎo)色素形成。4頓 太陽模擬器其發(fā)出光譜與太陽相當(dāng)?shù)腢VB射線和UVA射線(UVB/UVA比 為14)。將皮膚暴露到UVB射線3次，每2天1次。在最后一次曝光之后48 小時，取出皮膚。并在不暴露到太陽模擬器時進(jìn)行對照條件。
在進(jìn)行UV射線的皮膚中，黑色素細(xì)胞仍存在，并明顯定位在基層(圖3， TRP1免疫標(biāo)記。虛白線表示真皮-表皮連接處)。它們被UV射線iir活與未暴 露皮膚相比，它們的數(shù)目多(圖3，黑色素細(xì)胞密度圖表)，樹枝狀更多，并且 多巴反應(yīng)的反應(yīng)性更強(qiáng)。與對照皮膚相比，在暴露于光的皮膚中Fontanna-Masson 染色之后，測量黑色素量的提高(X1.8倍)(圖3，黑色素的量)。通過測量亮 度(L*)而對通過UV射線的色素形，l」激進(jìn)fi^化亮度的減少(AL=4.38) 顯示UV暴露的皮膚比，露的皮膚更黑(圖3 ，亮度)。
，例5: 建色素皿中^促色素形成劑誘導(dǎo)色素形成(圖4)
在存在己知的促色素形成劑a MSH (被從浮現(xiàn)期開始以50nM的濃度置于 培養(yǎng)基中)時，18天后所提取的皮ltt觀上形成色素更多。亮度測量確認(rèn)了這 種變棕色，因為在未處理皮膚和4頓a MSH處理的皮膚之間存在6.7點的降低 (圖4，亮度)。
在存在a MSH時，黑色素細(xì)胞樹枝狀更高，并且通過Fontana-Masson標(biāo) 記產(chǎn)生了多得多的可見得黑色素(圖4， Fontana-Masson染色)。
權(quán)利要求
1、體外皮膚等同物，特征在于其含有至少一種表皮等同物和至少一種真皮等同物，其中所述表皮等同物含有形成至少一層基層和至少一層表面層的角質(zhì)細(xì)胞，并且其特征在于，所述皮膚等同物含有組成型產(chǎn)生黑色素的黑色素細(xì)胞，以及活成纖維細(xì)胞，所有黑色素細(xì)胞都位于表皮等同物的基層中。
2、 如前避少一項權(quán)利要求所述的體外皮膚等同物，其特征在于，在真皮 等同物中，相對于真皮等同物的表面，被縱向定位的成纖維細(xì)胞的百分比小于 50%。
3、 如前超少一項權(quán)利要求所述的體外皮膚等同物，其特征在于，真皮等 同物含有成纖維細(xì)胞分布在其中的I 原基質(zhì)。
4、 如前腿少一項權(quán)利要求所述的體外皮膚等同物，其特征在于，所述黑 色素細(xì)胞是來源于人皮膚的黑色素細(xì)胞。
5、 如前面任意一項權(quán)利要所述的皮膚等同物，其特征在于，它們的色素形 成^M31暴露于促色素形成齊訴卩/或UV射線而得到提高。
6、 制備前面任意一項權(quán)利要求所述的皮膚等同物的方法，其特征在于，該 方法包含有下列步驟a) 使成纖維細(xì)胞和膠原溶^a行接觸，然后孵育充分的時間，以獲得在其中分布成纖維細(xì)胞的收縮的膠原基質(zhì)，這構(gòu)成了真皮等同物，b) 為a)中所獲得的真皮等同物接種角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的混合物，并 在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行浸沒式培養(yǎng)，c) 使得在b)中獲得的在真皮等同物上角質(zhì)細(xì)胞和黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)物浮 現(xiàn)，并在氣-液界面繼續(xù)培養(yǎng)，直到在膠原基質(zhì)中含有成纖維細(xì)胞的表皮等同物 上獲得了分層的含有黑色素細(xì)胞的表皮等同物，這構(gòu)成了皮膚等同物。
7、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述黑色素細(xì)胞是從成人皮膚 獲得的人黑色素細(xì)胞，并被預(yù)先擴(kuò)增。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6和7至少之一所述的方法，其特征在于，所述角質(zhì)細(xì)胞和成纖維原細(xì)胞是力A^^^膚獲得的。
9、 根據(jù)權(quán)利要求6-8至少之一所述的方法，其特征在于，在存在IVM^原、層粘連蛋白和/鵬蛋白時進(jìn)，涉驟a)。
10、 評估試劑調(diào)節(jié)色素形成能力的方法，其特征在于(a) 將所述試劑施用于根據(jù)權(quán)利要求1-5至少之一的體外皮膚等同物，或 者i!51權(quán)利要求6-9之一方法獲得的體外皮膚等同物，(b) 將已經(jīng)施用待評估試劑的體外皮膚等同物的色素形成(i)與沒有進(jìn) 行所述試劑處理的對照皮膚等同物進(jìn)行比較。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，ffl31與所述皮膚等同物的 至少一部分的直皿觸而將所述試劑施用于皮膚等同物。
12、 根據(jù)權(quán)利要求10-11至少之一所述的方法，其特征在于，所述皮膚等 同物至少含有來源于色素異常的成纖維細(xì)胞和/或角質(zhì)細(xì)胞和/或黑色細(xì)胞。
13、 根據(jù)權(quán)利要求10-12至少之一所述的方法，其特征在于，所述試劑是 色素形成-抑制劑。
14、 根據(jù)權(quán)利要求10-13至少之一所述的方法，其特征在于，待評估的試 齊〖做施用到皮膚等同物表現(xiàn)出色素增加的區(qū)域。
15、 根據(jù)權(quán)利要求10-12至少之一所述的方法，其特征在于，所述待評估 的試劑是色素形成- 劑。
16、 根據(jù)權(quán)利要求10-15至少之一所述的方法，其特征在于，皮膚等同物 還被暴露于UV射線，其中UV射線是在實施待評估試劑之前、同時和/或之后 施用，或者施用了與對照皮膚等同物相同的時間。
17、 根據(jù)權(quán)利要求10-16至少之一所述的方法，其特征在于，還將已經(jīng)被 施用了待評估試齊啲體外皮膚等同物的色素形成(i)和已經(jīng)被施用了色素形成 鵬或色素形成抑制參照物質(zhì)的皮膚等同物的色素形成(iiO進(jìn)行了比較。
18、 根據(jù)權(quán)利要求10-17至少之一所述的方法，其特征在于，所述待評估 的試劑通過至少部分對角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)的成分和域真皮-表皮i^接處發(fā)揮作用而調(diào)節(jié)色素形成。
19、 根據(jù)權(quán)利要求16-18之一所述的方法，其特征在于，所述待評估的試 劑含有至少一種防曬劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及功能性色素皮膚等同物。本發(fā)明涉及一種體外皮膚等同物，其特征在于，其含有至少一種真皮等同物和至少一種表皮等同物，以及其中它含有組成型產(chǎn)生黑色素的黑色細(xì)胞，和成纖維細(xì)胞。本發(fā)明還涉及制備皮膚等同物的方法。
文檔編號C12N5/071GK101538555SQ20091013870
公開日2009年9月23日 申請日期2009年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月17日
發(fā)明者C·杜瓦爾, F·伯納德 申請人:萊雅公司