專利名稱：分析物檢測的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及對樣品(例如，從動物獲得的生物樣品)中的分析物(例如，抗原)進 行化驗(assay)。具體地講，本發(fā)明涉及利用特異靶向所選分析物的結合部分來檢測分析物 的方法和裝置。更具體地講，將被檢測的分析物包括傳染劑和/或它們的成分。
背景技術：
已經(jīng)使用多種化驗來檢測身體樣品中的各種物質(通常一般稱作分析物或配體) 的存在。通常，這些化驗涉及抗原抗體反應、配體、抗配體、配體受體，并利用包括放射性金 屬可溶性標記、金屬酶可溶性標記、熒光金屬可溶性標記或視覺上可觀測到的金屬可溶性 標記在內(nèi)的合成綴合物和特別設計的反應室。大多數(shù)當前測試被設計成進行定量測定，但 是在許多情況下，需要的是定性指示或者陽性/陰性指示。已經(jīng)利用化驗來檢測傳染劑，例 如流感。由于測試液體中的目的分析物的濃度通常較低，所以即使陽性/陰性化驗也必 須非常靈敏。假陽性也會比較麻煩，特別是利用凝集或其它快速檢測方法(例如，浸量尺 (dipstick)和色變試驗)。由于這些問題，已經(jīng)開發(fā)出使用金屬溶膠或其它類型的色粒的 夾心(sandwich)化驗方法和其它靈敏的檢測方法。這些技術還未解決在這些快速檢測方 法中碰到的所有問題。此外，在高致病病原體(例如，流感病毒)出現(xiàn)的情況下，需要開發(fā) 有效的實驗室的或即時(point-of-care)的方法和系統(tǒng)，從而能夠有效而又準確地檢測一 種或多種傳染劑，例如流感類型或亞型內(nèi)的株。在遍及世界的局部暴發(fā)或流行病中常會看到流感。流行病可以在任何時間出現(xiàn)， 并可能在很少預兆或毫無預兆的情況下爆炸性地發(fā)生。受感染的人數(shù)可以從幾百變化到幾 十萬。流行病可能是短暫的，持續(xù)數(shù)日或數(shù)周，但大多數(shù)流行病會持續(xù)數(shù)月。雖然流行病對 于大多數(shù)人來說是輕型疾病，但是它對老年人、非常年幼或虛弱的人構成生命威脅。流行病 導致生產(chǎn)力受到巨大損失。因此，需要開發(fā)出在從受試者獲得的樣品中有效地檢測出存在 的病原體(pathogen)(例如，流感)的類型和亞型的裝置和方法，從而判斷傳染是否由流感 (季節(jié)性流感)的典型的或預想的亞型或者作為流行性或全國流行性病原體的亞型引起。本發(fā)明的目的在于提供一種快速且靈敏的用于檢測生物樣品中的分析物的方法。 另一目的在于提供一種化驗，該化驗具有高靈敏度，并且與傳統(tǒng)化驗相比具有較少的假陽 性。又一目的在于提供一種用于檢測在生物樣品中存在的低水平的分析物的裝置和系統(tǒng)。 再一目的在于提供一種化驗系統(tǒng)，該化驗系統(tǒng)涉及最少數(shù)量的程序步驟，即使該化驗系統(tǒng) 由未經(jīng)訓練的人使用，仍產(chǎn)生可靠的結果。再一目的在于提供一種用于測試傳染劑的系統(tǒng)， 該系統(tǒng)在幾分鐘之內(nèi)提供識別一種或多種傳染劑的結果。再一目的在于一種系統(tǒng)，在該系 統(tǒng)中，盡管在獲取結果所需的反應完成之后1小時至若干小時才能讀取結果，但測試器具 的結果對于目標分析物來說均是特定的且靈敏的。根據(jù)以下說明書、附圖和權利要求書，本 發(fā)明的這些和其它目的和特征將是顯而易見的。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的特定方面中，提供了一種樣品采集裝置(SCD)，用于檢測可能存在于樣 品中的一種或多種目標抗原或分析物。樣品采集裝置可以與測試裝置結合使用。一方面， 提供了一種用于檢測一種或多種分析物的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括SCD、測試裝置和讀取器，如 這里進一步所述。在各種實施例中，S⑶包括一個或多個上密封室，所述密封室可以包含相同或不同 的溶液。在一個實施例中，上密封室包括至少兩個區(qū)室或者均包括子室。在其它實施例中， 上室可以包括可穿刺、可破裂或可破壞的安瓿。在一些實施例中，S⑶提供必要的試劑，從 而與可能存在于樣品中的一種或多種不同的目標抗原形成復合物(complex)，其中，所述復 合物包括捕獲部分和可檢測的標記；測試裝置提供必要的工具，從而可尋址地捕獲一種或 多種由此形成的復合物；讀取器提供工具，用來檢測從可尋址地捕獲的復合物中檢測一個 或多個信號。在各種實施例中，上密封室包括提取緩沖液和/或試劑、樣品采集器具、樣品采集 器具固定器(holder)和多種試劑，其中，所述試劑包括多個特定結合的對，其中，每對包括 綴合到第一特定結合劑的標記和綴合到第二特定結合劑的捕獲部分，其中，第一特定結合 劑和第二特定結合劑特定地結合目標抗原，從而形成復合物。捕獲部分可以被“捕獲”或者 被固定，其中，設置在基底上的配對物捕獲部分結合到捕獲部分-特定結合劑綴合物。在各種實施例中，多種特定結合劑包括多組特定結合對，其中，每組包括特定結合 一種目標抗原的特定結合劑，第二組特定結合對特定結合第二種不同的抗原。因此，包含在 SCD中的多種特定結合對能夠檢測多種不同的抗原。在各種實施例中，捕獲部分是寡核苷酸、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、吡喃 RNA(pyranosyl, pRNA)、適體或者它們的組合。在各種實施例中，標記是金屬、熒光團、發(fā)色 團或它們的組合。在一些實施例中，包括在SCD中的多種特定結合對可以包括一種類型的 捕獲部分，而沒有不同的捕獲部分配對物，例如，每個特定結合劑綴合到PRNA，其中，針對不 同抗原的每組包括不同的PRNA。在其它實施例中，多個特定結合對包括一種或多種不同的 捕獲部分，例如，針對一組特定結合對的PRNA，而針對另一組的鏈霉抗生物素，或者不同類 型的捕獲部分的組合。在一些實施例中，包含在S⑶中的多個特定結合對可以包括一種類型的標記(例 如，特定結合對，其中，每組綴合到具有相同波長信號的熒光團或者不同波長信號的熒光 團)。在其它實施例中，特定結合對可以包括不同類型標記的組合(例如，金屬和熒光團的 組合)。在一個實施例中，捕獲部分是PRNA，標記是銪。在各種實施例中，特定結合劑是抗體，所以特定結合對包括抗體-標記結合劑 (“標記探針”)或者抗體-捕獲部分(“捕獲物探針”)。在這種實施例中，“配對物捕獲部分 (partner capture moiety) ”包含在設置在測試裝置中的測試膜上，配對物結合特定捕獲 探針，例如，PRNA配對物特定結合包含在捕獲探針(針對目標抗原的抗體)上的pRNA(即， 捕獲部分)。在一些實施例中，檢測的不同的分析物是病毒或者病毒的組分(例如，多肽)。在 各種實施例中，不同的抗原來自流感病毒和流感病毒的亞型。在一個實施例中，可以檢測到 的流感病毒是甲型流感病毒和乙型流感病毒以及流感病毒的亞型。一個實施例涉及檢測甲型流感病毒株和乙型流感病毒株以及HxNy形式的亞型，其中，χ可以是1至16，y可以是1 至9，或者為xy的任意組合。在又一實施例中，檢測的不同分析物是一種或多種不同的傳染劑和/或一種或多 種傳染劑的不同亞型。這種傳染劑包括HIV、HCV和分枝桿菌(myobacterium)、肺結核、細 菌、真菌、酵母、HSV、HPV或它們的組合。在各種實施例中，SCD包括采樣器具，所述采樣器具提供從受試對象采集樣品的工 具，其中，包含的采樣器具連接經(jīng)過采樣器具固定器連接到上室。采樣器具設置在軸的遠 端，所述軸可以是實心的、空心的或者半透的。在一些實施例中，采樣器具是藥簽、梳子、刷 子、刮板、棒、泡沫、絮狀的基底或旋轉的基底。在各種實施例中，SCD包括一個或多個密封的上室，其中，密封件作為閥來控制 SCD的上室和下室之間的流體連通。在一些實施例中，閥可以是破裂閥、擋板閥、扭轉閥、螺 旋閥、可破碎的閥、可刺穿的閥或可破壞的閥。在其它實施例中，上室可以包括一個或多個 安瓿，除非施加壓力使安瓿破裂、破壞或破碎從而釋放其中包含的任何成分，否則安瓿防止 其中包含的溶液流動下室。本發(fā)明的一方面涉及一種S⑶，S⑶包括活塞器具上游的貯樣品室、用于傳送一種 或多種溶液的多個可密封的孔、用于過濾來自樣品的一種或多種化合物從而便于樣品儲藏 的基底以及能夠特定結合所述樣品中的至少一種分析物的試劑。在本發(fā)明的另一方面中，提供了一種用于檢測一種或多種分析物的測試裝置，其 中，所述裝置包括主體中的橫向流動膜(lateral flow membrane)，橫向流動膜的上游的室 包含流體或溶液，其中，在所述室和所述橫向流動膜之間設置有間隙(gap)，從而防止所述 室和橫向流動膜之間的流體連通。在一個實施例中，對所述施加的壓力將所述間隙推緊，從 而在所述室和橫向流動膜之間形成流體連通。在一個實施例中，SCD的頂端適合的開口直 接設置在位于間隙下游而位于橫向流動膜上游的燈芯材料墊正上方。在一實施例中，測試裝置室包括含有相同或不同溶液的一個或多個子室。在其它 實施例中，子室的室包括可破裂、可破碎或可破壞的一個或多個安瓿。因此，對這種安瓿施 加壓力時，成分被可控制地釋放。如這里所述，測試裝置可以包括間隙工具或者不包括間隙 工具(gap means)，用于中斷所述室與橫向流動膜之間的流體連通。測試間隙可以形成為零 到 3. 0mm>0. 5mm 到 3. 5mm、L Omm 到 2. 5mm、L Omm 到 3. 0mm、或 2. Omm 到 4. Omm0在一些實施例中，測試裝置可以包括容納橫向流動膜的主體，其中，所述主體提供 一個或多個窗口，通過所述窗口可以觀察到橫向流動膜。在這里所述的各種實施例中，測試 裝置包括橫向流動膜，橫向流動膜包括燈芯材料基底和設置在所述橫向流動膜上的測試區(qū) 域的上游或下游的吸收基底。在一些實施例中，在SCD或測試裝置中提供了用于采集存檔 用的小體積樣品的基底。在一個實施例中，提供這種存檔工具的基底是采集小體積樣品的 過濾器、膜或紙，以后從裝置上去除所述基底。 在各種實施例中，S⑶和/或測試裝置包括一個或多個相同的識別標簽，可以從一 個裝置去除所述識別標簽并且放置在另一個裝置上。 在一些實施例中，測試裝置被形成為僅適于(特定配體(adaptor)的形狀)讀取 器的容納口(receiving port)，如果上游的室被壓下，則表示其中包含的清洗緩沖液或者 跟蹤緩沖液已經(jīng)通過橫向流動膜被釋放。在這種實施例中，特定配體的測試裝置和讀取器提供了一種工具來驗證測試裝置上游的室中的跟蹤緩沖液或溶液已經(jīng)釋放，從而清洗過的 任何樣品通過橫向流動膜而位于橫向流動膜的上游。因此，特定的配體提供了 “安全工具” 來防止讀取未處理的樣品。在本發(fā)明的另一方面中，處理過的樣品通過測試裝置的橫向流動膜來運轉，可以 放置30分鐘至幾個小時。在各種實施例中，多個樣品通過測試裝置來運轉，在0. 5小時、1 小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時或12小
時后讀取樣品，得到連續(xù)并且精確的信號。在本發(fā)明的特定方面，這里公開的裝置用在檢測可以存在于樣品中的一種或多種 分析物的方法中。在一些實施例中，方法涉及檢測傳染劑的一個或多個株。在一個實施例 中，一種方法涉及利用本發(fā)明的裝置來檢測一種或多種流感病毒及其亞型。例如，提供用于 檢測甲型流感和乙型流感以及可以存在于單個樣品中的甲型流感的亞型的方法。在一個實施例中，提供一種方法，來確定受試對象是否被感染流行性、非流行性流 感或者有疫苗的流感病毒的株。在一些實施例中，測試裝置排除能夠特定結合目標抗原的任何試劑或結合劑。在本發(fā)明的一方面，提供了一種讀取器，來檢測來自測試裝置的信號，其中，所述 讀取器是UV LED讀取器。在各種實施例中，檢測的信號是來自檢測器分子的熒光信號。在 另一實施例中，檢測器分子是鑭系元素。在又一實施例中，鑭系元素是銪。在一個實施例中，讀取器包括UV光電二極管。在又一實施例中，讀取器包括UV激 光二極管。在本發(fā)明的另一方面，讀取器被構造為包括至少一個硬性標準件。在另一實施例 中，讀取器被構造為包括至少兩個或多個硬性標準件。在各種實施例中，硬性標準件包括發(fā) 射可檢測信號的標記分子。在又一實施例中，標記是熒光標記。在又一實施例中，熒光標記 是鑭系元素。在再一實施例中，鑭系元素是銪。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的SCD和測試裝置用在檢測一種或多種分析物的方 法中，其中，這種分析物與疾病、病態(tài)或者其它生理條件有關。在各種實施例中，這種分析物 是與涉及心臟、肝臟、腎、腸、腦、胎兒或胰腺的條件有關的生物標記物。在一個實施例中，這 種分析物與心臟條件(例如，心肌梗死)有關。在各種實施例中，本發(fā)明的裝置可以用在檢測從受試對象得到的樣品中的抗原或 蛋白(分析物)的任何方法中，從而通過使用免疫反應的特定板或者針對期望分析物的特 定結合試劑來檢測任何這樣的分析物。在本發(fā)明的方面中，測試裝置包括上游室，上游室包括提供清洗/運轉緩沖液或 液體的工具。在各種實施例中，這種緩沖液或液體包括添加劑例如，通過光讀取器或通過肉 眼可以讀取的信號/檢測器分子。在特定實施例中，緩沖液或液體包含在由玻璃安瓿或膜 袋、囊組成的區(qū)室中，或者形成填充的囊。在又一實施例中，這種區(qū)室被破壞、被破碎，否則 通過對所述區(qū)室施加壓力來釋放它們的成分。在其它實施例中，這種區(qū)室被附件或針刺破 或切開。在再一實施例中，這種區(qū)室通過安全裝置保護，排除意外或不小心地釋放它們的組 分。通過引用而包含的內(nèi)容本說明書中提到的所有出版物和專利申請通過引用被包含于此，在某種程度上，就像每個單獨的出版物或專利申請被具體地并且單獨地指出通過引用而包含一樣。


在權利要求中具體列出了本發(fā)明的新穎性特征。通過參照闡述了示例性實施例的 以下詳細說明，將更好地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點，在示例性實施例中利用了本發(fā)明的原 理，在附圖中圖1示出了樣品采集裝置。圖2A示出了具有混合室的放大圖的樣品采集裝置。圖2B示出了采樣組件。圖3示出了測試裝置。圖4示出了讀取器。圖5示出了樣品采集裝置。圖6示出了樣品采集裝置。圖7示出了包括間隙工具的測試裝置。圖8示出了樣品采集裝置和測試裝置。圖9A和圖9B示出了利用不同體積的提取緩沖液測試的測試條(test strip)。圖IOA和圖IOB示出了背景清理(clean-up)的效果和不同量的提取緩沖液。圖11示出了檢測甲型流感的兩種不同的測試。圖12示出了檢測甲型流感和乙型流感的兩種不同的測試。圖13示出了使用金作為標記的甲型流感的檢測。圖14示出了使用金作為標記的乙型流感的檢測。圖15示出了使用銪綴合物的甲型流感的檢測。圖16示出了使用銪綴合物的乙型流感的檢測。圖17示出了在乙型流感的檢測中銪綴合物的靈敏度。圖18示出了利用甲型流感亞型測試的條。圖19示出了僅緩沖液對照。圖20示出了甲型流感和亞型H3N2的測試。圖21示出了乙型流感的測試。圖22示出了甲型流感和亞型H5m的測試。圖23示出了甲型流感和亞型Hmi的測試。圖24示出了乙型流感和甲型流感亞型H5W的測試。圖25示出了 Epstein-Barr病毒的測試。圖26示出了用于不同類型和亞型的分析物的包括多條測試線(test line)的測 試裝置；901-施加到樣品的過濾器或樣品墊(pad) ；902-試劑墊；903-用于分析物/傳染劑 的類型1的測試線；904-分析物/傳染劑的類型2 ；905-類型1或類型2的亞型；906-類 型1或類型2的亞型；907-對照線。圖27A至圖27C示出了一個測試裝置的各個方面；圖27A組裝的測試裝置1001 ；圖 27B未組裝的測試裝置，具有上部1002、下部1004和測試條1003以及用于容納樣品的孔/ 艙 1005 (aperture/port to receive a sample 1005)；圖 27C彈簧/按鈕室的較近視圖，可
15以將彈簧/按鈕室按下，從而將設置在膜/墊1006上方的緩沖液/液體室破裂(rupture)、 裂開(break)或刺破(puncture)，緩沖液/液體室與測試條1003處于液體連通狀態(tài)。圖28A示出了將S⑶1101和測試裝置1105組件連接的實施例，在該實施例中，提 供了環(huán)鎖(collar lock)，當環(huán)鎖 1104 在上鎖位置打開(turned in the lock position) (即，使液流從上游的緩沖液/液體室橫向穿過測試裝置)時，環(huán)鎖1104提供對上游室1102 打開的幾何結構的通道/孔1103。上游室1102可以是安瓿或成形的填充囊。圖28B示出了測試裝置的實施例，其中，該裝置包括保護蓋(safeguard cover) 1107，保護蓋1107在包含液體(例如，沖洗/運行(running)緩沖液)的上游室1106 之上。此外，該裝置包括貯液室1109，貯液室1109與樣品孔/艙1108處于液體連通狀態(tài)， 所述貯液室可以包括用于保持存檔樣品的膜或室。圖28C示出了設置在測試裝置中的具有破斷點(break point) 1110的室(例如， 安瓿)1111，其中，測試裝置被構造成提供槽(trough) /通道1112和支撐基底1113，支撐基 底1113將安瓿下游的液體內(nèi)含物引導到測試條；圖28D提供了包括囊/安瓿1114的室的 俯視圖，囊/安瓿1114位于發(fā)生樣品引入的位置1115的下游，該室被構造成提供液體斜坡 (ramp) 1119和載體(support) 1118，室的內(nèi)含物通過載體1118到達空間1117，空間1117與 吸水墊1116處于液體連通狀態(tài)。圖29提供了具有存檔組件的采樣裝置的一個示例；采樣藥簽1205附著到空心 軸(hollow shaft) 1201，套子(sleeve) 1202位于空心軸1201的側部并在疏水性玻璃料 (frit) (10+u) 1206和1203的上游，下面是能夠采用各種形狀的濾紙(圖29B)，濾紙具有用 于保持存檔樣品的區(qū)域1209和能夠例如保持試劑丸/珠的三個三維區(qū)域1210。此外，試劑 丸/珠還可以設置在濾紙1208的下游的室中，濾紙1208能夠在驅使樣品通過尖端1204之 前使樣品混合。圖30A示出了利用pRNA的條狀測試條；圖30B示出了利用單克隆抗體的條狀測試
^^ ο圖31示出了利用pRNA和抗體的靈敏度的比較，即，圖31示出了使用抗體和pRNA 作為捕獲比較乙型流感檢測的靈敏度。圖32提供了測試條上的多個分析物的pRNA結合的示意圖。圖33A至圖33H示出了硬性標準件(hard standard)；圖33A示出了由UV LED讀 取器讀取的銪的六個不同濃度的曲線圖；圖33B示出了六個硬性標準件的示圖；圖33C示 出了 1號濃度的曲線圖，其中，1號銪濃度大約2100計數(shù)；圖33D示出了 5號濃度的曲線圖， 其中，5號銪濃度大約2280計數(shù)；圖33E示出了 3號濃度的曲線圖，其中，3號銪濃度大約 2700計數(shù)；圖33F示出了 6號濃度的曲線圖，其中，6號銪濃度大約3310計數(shù)；圖33G示出 了 2號濃度的曲線圖，其中，2號銪濃度大約19500計數(shù)；圖33H示出了 4號濃度的曲線圖， 其中，4號銪濃度大約140000計數(shù)。圖34A和圖34B示出了硬性標準件；圖34A提供了由UV LED讀取器讀取的7個不 同硬性標準件的曲線圖；圖34B提供了具有多個窗口的測試裝置，當將測試裝置設置在讀 取器中時，通過所述多個窗口檢測信號。圖35示出了含液體的上游室1401 (例如，安瓿)與干燥吸水墊1402處于液體連 通狀態(tài)的實施例，當操作所述室以釋放其液體內(nèi)含物時，所述干燥吸水墊1402膨脹，其中，所述膨脹增大吸水墊1403的尺寸，從而使干燥吸水墊1402變成與設置在測試條1406上的 樣品1405處于液體連通狀態(tài)。因此，基于吸水材料1402的密度/類型，從通過測試條1406 的樣品1405的釋放位置到開始流動位置，可以將預定的時間延遲(predetermined time delay)構建到系統(tǒng)中。圖36示出了亞型H5W病毒的測試條，即，亞型H5W病毒的熒光強度。圖37示出了亞型Hmi病毒的測試條，即，亞型Hmi病毒的熒光強度的圖。圖38示出了乙型流感病毒的測試條，即，乙型流感病毒的熒光強度的圖。圖39示出了使用MAB捕獲系統(tǒng)的Nanogen甲型流感測試的靈敏度。圖40示出了使用pRNA捕獲系統(tǒng)的Nanogen甲型流感測試的靈敏度。圖41示出了使用pRNA捕獲系統(tǒng)Nanogen甲型流感測試和膜阻斷的靈敏度。圖42提供了 Nanogen甲型流感測試的靈敏度，即，MAB、pRNA和利用阻斷的pRNA 的靈敏度的比較。
具體實施例方式雖然在此已經(jīng)示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但對于本領域技術人員來講顯 而易見的是，這些實施例僅是通過示例方式提供的?，F(xiàn)在，在不脫離本發(fā)明的情況下，對于 本領域技術人員來說將做出許多改變、變化和替換。應當理解的是，在實施本發(fā)明中，可以 采用對在此描述的本發(fā)明的實施例做出的各種可選實施例。權利要求書意圖限定本發(fā)明的 范圍，由此將涵蓋處在這些權利要求書及其等同物的范圍內(nèi)的方法和結構。本發(fā)明的各個方面涉及利用特定的結合部分和捕獲部分對樣品中的所選的分析 物進行定性和/或定量分析的裝置和結合對化驗(binding-pair assay)。本發(fā)明在用于檢 測存在于樣品中的一種或多種傳染劑的各種化驗中是有用的。在本發(fā)明中使用的化驗包括 競爭性免疫化驗、非競爭性免疫化驗、夾心免疫化驗和阻斷化驗，但不限于此。然而，本發(fā)明的用途不限于免疫化驗，如包括配體-受體、配體-結合蛋白、適 體_結合劑、酶_基底的其它化驗，通過利用本發(fā)明的裝置或方法來檢測化學或生化反應。 根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)利用樣品采集裝置、測試裝置和讀取器。用于 實施本發(fā)明的各種特定的化驗方案、試劑、裝置或分析物是已知的，例如參見第4，313，734 號、第 4，366，241 號、第 5，266，266 號、第 6，235，539 號、第 6，468，474 號、第 6，565，808 號、 第6，448，001號或第5，415，994號美國專利以及
發(fā)明者克里斯多佛·約翰娜·約翰遜, 大衛(wèi)·迪克森·布克, 格雷厄姆·彼得·利德高, 理查德·拉斯衛(wèi)爾·伊根 申請人:納米基因有限公司