專利名稱：抑制sars冠狀病毒n蛋白表達(dá)的小干擾rna分子及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子及其編碼基因。
背景技術(shù)：
引起嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)的病 原體SARS-CoV為一種新型的冠狀病毒，具有棘突蛋白S(spike)，基質(zhì)蛋白M(matrix)， 包膜蛋白E (Envelope)和核蛋白N (Nuclear protein)等數(shù)種主要結(jié)構(gòu)蛋白(Holmes KV. SARS-associated coronavirus. N Engl J Med， 2003， 348 (20):1948-51.)。 研究表明，S蛋白是該病毒的主要保護(hù)性抗原，N蛋白和M蛋白也可以誘導(dǎo)免疫效應(yīng)， 特別是N蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。SARS-CoV N蛋白由422個氨基酸殘基組成，相 對分子質(zhì)量48KD，其編碼基因的長度為1268bp，是SARS-CoV主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在冠 狀病毒顆粒中，N蛋白位于病毒顆粒的核心部分和基因組RNA結(jié)合(MarraMA， Jones SJ ， Astell CR ， et al . The genome sequence of the SARS-associated coronavirus. Science, 2003， 300(5624):1399-1404. ; Wang J， Ji J, Ye J， et al. The structure analysis and antigenicity study of the N protein of SARS-CoV. Genomics Proteomics Bioinformatics， 2003， 1 (2) : 145-154.)。以往對動物冠狀 病毒結(jié)構(gòu)蛋白的研究表明，N蛋白在病毒復(fù)制和產(chǎn)生的病理反應(yīng)中起重要作用(Hiscox JA， Wurm T, Wilson L， et al. The coronavirus infectious bronchitis virus nucleoprotein localizes to the nucleolus. J Virol，2001， 75 (1):506-512.)。 伹冃前，尚未有直接而有效的抑制SARS-CoV的方法。
RNA干擾技術(shù)(RNAi)是在小雙鏈RNA (dsRNA)分子的介導(dǎo)下特異性降解靶基因 的生物技術(shù)，能使基因表達(dá)沉默，達(dá)到拮抗靶基因和實現(xiàn)生物(基因)治療目的。長 度為21到22個堿基的所謂小干擾RNA (siRNA， small interfering RNA)介導(dǎo)特異 性干擾反應(yīng)，只降解與其高度互補(bǔ)的特定基因的mRNA (Elbashir, S. M. ， Harborth， J. ， Lendeckel， W. et al., Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001， 411 (6836): 494)。 RNAi技術(shù)因其在疾病治療方面具有巨大潛力而備受關(guān)注。迄今為止，有關(guān)siRNA可誘 導(dǎo)產(chǎn)生針對SARS病毒基因RNA的干擾效應(yīng)，從而使該病毒的復(fù)制和蛋白表達(dá)受到抑制對細(xì)胞形成保護(hù)作用，在ncbi上已有一些報道，但針對SARS-CoVN蛋白設(shè)計的siRNA
未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供可抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子及其編 碼基因。
本發(fā)明所提供的抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子，是下述l)和 2)中的至少一個雙鏈RNA序列
1) 正義鏈具有序列表中序列1的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列2的核 苷酸序列；
2) 正義鏈具有序列表中序列3的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中序列4的核 苷酸序列。
將具有1)的雙鏈RNA序列命名為siRNAl，其反義鏈與SARS-CoV N mRNA(序列表 中的序列9)的213-233位置序列5， GGGCGUUCCAAUCAACACCAA 3'互補(bǔ)。序列表中序 列1由21個堿基組成，序列的方向從左至右為5'端一3'端；序列表中序列2由21 個堿基組成，序列的方向從左至右為5'端一3'端。
將具有2)的雙鏈RNA序列命名為siRNA2，其反義鏈與SARS-CoV N mRNA的862-883 位置序列5' GGGGACCAAGACCUAAUCAGAC 3，互補(bǔ)。序列表中序列3由22個堿基組成， 序列的方向從左至右為5'端一3'端；序列表中序列4由22個堿基組成，序列的方 向從左至右為5'端一3'端。
上述抑制SARS-CoVN蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子的編碼基因可具有下述1)和2) 中至少一個雙鏈核苷酸序列
1) 有義鏈(正義鏈)(不做模板的DNA鏈)具有序列表中序列5的核苷酸序列 或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈(做 模板的DNA鏈)具有序列表中序列6的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序 列6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；
2) 有義鏈(正義鏈)(不做模板的DNA鏈)具有序列表中序列7的核苷酸序列 或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列7限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈(做 模板的DNA鏈)具有序列表中序列8的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序 列8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0. 1XSSPE (或0. 1XSSC)， 0.1% SDS的溶液中，在65°C 下雜交并洗膜。
將具有l(wèi))的雙鏈寡核苷酸序列編碼基因命名為siDNAl，編碼siRNAl。序列表中序列5由58個堿基組成，序列的方向從左至右為5'端一3'端；序列表中序列6由 54個堿基組成，序列的方向從左至右為3'端一5'端。
將具有2)的雙鏈寡核苷酸序列編碼基因命名為siDNA2，編碼siRNA2。序列表中 序列7由60個堿基組成，序列的方向從左至右為5'端一3'端；序列表中序列8由 56個堿基組成，序列的方向從左至右為3'端一5'端。
含有上述抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子的編碼基因的表達(dá)載體、 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明提供的siRNAl和siRNA2小干擾RNA分子均可對SARS冠狀病毒N蛋白的 表達(dá)產(chǎn)生干擾效應(yīng)，且隨著含有siRNAl編碼基因的RNAi干擾載體的轉(zhuǎn)染量的增加， SARS-CoV N蛋白的表達(dá)量逐漸下降，表明針對SARS-CoV N蛋白設(shè)計的siR懸的有效 性和其抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的劑量效應(yīng)，為SARS冠狀病毒N蛋白的功能研究 奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究SARS-CoV N蛋白在SARS-CoV的致病機(jī)制中的作用提供了 新的平臺，對于揭示SARS的致病機(jī)制具有重要意義，同時也為預(yù)防和治療SARS提 供了新的思路和方法。本發(fā)明將在SARS的特異性預(yù)防和治療方法中具有潛在的應(yīng)用 價值，特別是在制備以抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子或攜帶所述 抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子編碼基因的表達(dá)載體為活性成分的 藥物中將發(fā)揮重要作用。


圖1為SARS-CoV N蛋白的RNAi載體pBS/U6 + labcd和pBS/U6 + 2abcd的酶切鑒 定結(jié)果
圖lb為抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的RNAi干擾載體的工作原理示意圖 圖2為含SARS-CoV N蛋白的全基因序列的真核重組表達(dá)載體pcMyc+N的酶切鑒 定結(jié)果
圖3為重組SARS-CoV N蛋白表達(dá)的westernblot檢測結(jié)果
圖4為RNAi干擾載體對SARS-CoV N蛋白表達(dá)的干擾效應(yīng)的westernblot檢測結(jié)
果
圖5為上樣與圖4完全對應(yīng)的對照(內(nèi)參)P-actin的Western blot檢測結(jié)果 圖6為RNAi干擾載體對SARS-CoV N蛋白干擾效應(yīng)的定量分析結(jié)果
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用DNA序列均由上海生工 合成。
實施例l、抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子的設(shè)計、RNAi干擾載體的構(gòu)建及其酶切鑒定
一、 抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子的設(shè)計 按下述方法設(shè)計抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子
1、 在SARS-CoV N的mRNA序列(序列表中序列9)中篩選連續(xù)的"GGG"序列， 該序列通常應(yīng)選擇在AUG下游至少lOObp后；
2、 截取GGG后18-19bp的序列，以使加上GGG后序列總長度為21-22bp;
3、 對經(jīng)步驟l和2獲得的siRNA序列進(jìn)行篩選，具體篩選要求為
1) 21-22bp siRNA的G/CX為45—65%;
2) 在ncbi上對siRNA序列進(jìn)行序列同源性比對，以確保所篩選的抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的siRNA序列經(jīng)檢測和除SARS-CoV外的其它種屬序列無同源性。
經(jīng)上述步驟獲得了兩對抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子，分別命名 為siRNAl (序列表中序列1和序列2)和siRNA2 (序列表中序列3和序列4) ， siRNAl 作用于SARS-CoV N mRNA(序列表中的序列9)的213-233位置序列 5， GGGCGUUCCAAUCAACACCAA 3， ， siRNA2作用于SARS-CoV N mRNA的862-883位置序 列5' GGGGACCAAGACCUAAUCAGAC 3'。
二、 抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的RNAi干擾載體的構(gòu)建及其酶切鑒定
1、 根據(jù)siRNAl和siRNA2所作用的耙序列以及載體pBS/U6 (Sui GC et
al. PNAS. 2002 April;99 (8) :5515-5520)的使用要求，設(shè)計siRNAl和siRNA2的siDNA 序列，分別命名為siDNAl和siDNA2，具體序列如下(下劃線堿基序列為針對SARS-CoV N mRNA的耙序列) siDNAl政練
5， 一gggcgttcc城caacaccaaa agcttttggtgttgattggaacgccctttttctgca -3 (序歹!j 5) siDNAl反義鏈
3， 一cccgcaaggttagttgtggttttcga aaaccacaactaaccttgcgggaaaaag -5，(序歹U 6) si證JBC鏈
5， -ggggaccaagacctaatcagaca agcttgtctgattaggtcttggtcccctttttctgca-3 (序歹lj 7) si薩欣鏈
3， - cccctggttctggattagtctgttcga acagactaatccagaaccaggggaa肪ag-5， (序列8)
2、 根據(jù)所設(shè)計的siDNM和siDNA2序列合成8條寡核苷酸，序列如下 1W -ggcgttccaatcaacaccaaa-3，
lb: 3， -ccgcaaggttagttgtggttttcga-5，
lc: 5; -agcttttggtgttgattggaacgccctttttctgca-3，
6Id: 3， -aaaccacaactaaccttgcgggaaaaag-5，
2a: 5， -gggaccaagacctaatcagaca-3，
2b: 3， -ccctggttctggattagtctgttcga-5，
之c: 5' - agcttgtctgattaggtcttggtcccctttttctgca-;B'
2d: 3， - acagactaatccagaaccaggggaaaaag-5，
將上述8條兩兩互補(bǔ)的寡核苷酸片斷經(jīng)煮沸后緩慢退火得到lab、 lcd、 2ab、 2cd 四條雙鏈dsRNA，對lab和2ab分別進(jìn)行以下操作用限制性內(nèi)切酶如a I和 進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物克隆入經(jīng)同樣酶酶切的含有U6啟動子的載體pBS/U6中，將 含有l(wèi)ab的載體命名為pBS/U6十lab，將含有2ab的載體命名為pBS/U6 + 2ab。再將
icd分別用限制性內(nèi)切酶仏'/^ in和尸"I進(jìn)行雙酶切后克隆入經(jīng)同樣酶酶切的載體
pBS/U6 + lab中，得到以5， GGGCGUUCC層CAACACCAA 3，為耙序列的SARS-CoV N蛋 白的RNAi載體，將其命名為pBS/U6 + labcd;將2cd用同樣方法克隆入載體pBS/U6 + 2ab中，得到以5， GGGACCAAGACCUAAUCAGACA 3'為耙序列的SARS-CoVN蛋白的RNAi 載體，將其命名為pBS/U6 + 2abcd。對pBS/U6+labcd和pBS/U6+2abcd用^boWI & A^7l、 &^^1分別進(jìn)行雙酶切鑒定(以空載體pBS/U6為對照)，結(jié)果如圖l
所示(泳道M為Marker,泳道1為pBS / U6+2abcd的￡cov I和《/m I雙酶切產(chǎn)物，泳 道2為pBSU6+labcd的fcMI和/T/m I的雙酶切產(chǎn)物，泳道3為pBS / U6的fco7 I和 A>/71的雙酶切產(chǎn)物，泳道4為pBS / U6十2ab的&2 I和I的雙酶切產(chǎn)物，泳道5 為pBS / U6+lab的I和化/71的雙酶切產(chǎn)物，泳道6為pBS / U6的I和I 的雙酶切產(chǎn)物)，空載體pBS/U6經(jīng)雙酶切可以釋放長度約為500bp左右的DNA片段， 而構(gòu)建的載體pBS/U6+lab、 pBS/U6+2ab、 pBS/U6十labcd和pBS/U6+2abcd因插入 dsRNA使限制酶切位點缺失而不能釋放該長度約為500bp左右的DNA片段，表明正確構(gòu) 建了分別含有siDNAl和siD脆抑制SARS-CoV N蛋白表達(dá)的RNAi干擾載體，其工作原 理示意圖如圖lb所示。
實施例2、SARS-CoVN蛋白的真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)以及用western blot 法檢測RNAi干擾載體對SARS-CoV N蛋白表達(dá)的干擾效應(yīng)及定量分析
一、SARS-CoV N蛋白的真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建及該蛋白的表達(dá)
1、 SARS-CoV N蛋白的真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)SARS-CoV N蛋白的CDS區(qū)設(shè)計引物，引物序列如下
引物l:(上游引物)5， -TATAGAATTCTGTCTGATAATGGACCCCAAT-3':(劃線部分 堿基為&MI識別位點)
引物2:(下游引物)5， -TATAGGTACCTTATGCCTGAGTTGAATCAG-3，(劃線部分堿基為A]W7l識別位點)
以經(jīng)SARS-CoV HKU-39849株(Zeng FW et al Exp Biol Med (Maywood). 2003 Jul;228(7) :866-73)感染的vero E6細(xì)胞(ATCC)的RNA提取物為模板，在引物1 和引物2的引導(dǎo)下，用RT-PCR法擴(kuò)增SARS-CoV N蛋白的全基因序列并在其兩端分別 添加限制性內(nèi)切酶和A>771識別位點，然后將SARS-CoV N蛋白的全基因序列 克隆入質(zhì)粒載體pGEM-T easy (proraega公司)中，再利用限制性內(nèi)切酶^coT I和A^
I將SARS-CoV N蛋白的全基因序列亞克隆入真核表達(dá)載體pCMV-Myc (美國Clontech 公司)中，將重組載體命名為pcMyc+N，并對其進(jìn)行酶切鑒定(以空載體pCMV-Myc 為對照)，結(jié)果如圖2所示(泳道M為Marker,泳道1為pcmyc+N的fe/z^I單酶切 產(chǎn)物，泳道2為pCMV-Myc的知s I和勤"I雙酶切產(chǎn)物，泳道3為pcmyc+N的命a
I和Ip/7l雙酶切產(chǎn)物，泳道4為pCMV-Myc的^a^I單酶切產(chǎn)物)，表明重組載體 pcMyc+N比空白載體pCMV-Myc多釋放一條1200bp左右的DNA片段，該片段大小與 SARS-CoV N蛋白的全基因序列的大小相符，證明獲得了正確的含有SARS-CoV N蛋白 全基因序列的真核重組表達(dá)載體pcMyc+N。 2、 SARS-CoV N蛋白的表達(dá)
將pcMyc+N用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染(所用轉(zhuǎn)染試劑Tfx -20購自promega公司)293細(xì) 胞(ATCC，用購自美國Gibco公司的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng))，以pCMV-Myc空白載體為對照， 48小時后收獲細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后進(jìn)行westernblot檢測SARS-CoV N蛋白的表達(dá)情 況，結(jié)果如圖3所示(泳道1為用pcMyc+N轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物，泳道2為用pCMV-Myc 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物)，表明用pcMyc+N轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞表達(dá)有分子量大小約為48kD 的蛋白，與SARS-CoV N蛋白的分子量大小一致，而對照空白載體pCMV-Myc沒有蛋白 表達(dá)。
二、用western blot法檢測RNAi干擾載體對SARS-CoV N蛋白表達(dá)的干擾效應(yīng) 將步驟一構(gòu)建的SARS-CoVN蛋白的真核表達(dá)載體pcmyc+N、RNAi干擾載體pBS/U6 + labcd和pBS/U6+2abcd分別用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)293細(xì)胞檢測其對SARS-CoV N蛋白表 達(dá)的干擾效應(yīng)，同時設(shè)定不同劑量關(guān)系測定RNAi干擾載體PBS/U6 +labcd及pBS/U6 + 2abcd干擾SARS-CoV N蛋白表達(dá)的劑量效應(yīng)，具體方法為在保證總轉(zhuǎn)染量和pcmyc +N轉(zhuǎn)染量相同的情況下，改變RNAi干擾載體pBS/U6 +labcd或pBS/U6+2abcd的轉(zhuǎn) 染量，即分別以pcrayc+N: RNAi干擾載體為1: 1、 1: 3禾B1: 6的比例(質(zhì)量比)共轉(zhuǎn) 293細(xì)胞，48小時后收獲細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后進(jìn)行westerablot檢測SARS-CoV N蛋 白的表達(dá)情況(選擇購自Santa Cruz公司的小鼠anti-Myc單克隆抗體和HRP標(biāo)記的 羊抗小鼠IgG及ECL試劑)，結(jié)果如圖4所示(泳道1為pcMyc&pBS/U6 + 2abcd，泳道2為pcmyc+N&pBS/U6+2abcd (1: 6)，泳道3為pcmyc+N&pBS/U6 + 2abcd (1: 3)，泳道4為pcmyc+N&pBS/U6 + 2abcd (1: 1)，泳道5為pcmyc+N&pBS / U6，泳 道6為pcmyc+N&pBS/U6 + labcd (1: 1)，泳道7為pcmyc+N&pBS/U6 + labcd(l: 3),泳道8為pcmyc+N&pBS/U6 + labcd(l: 6)，泳道9為pcmyc&pBS/U6 + labcd， 泳道M為蛋白Marker)，表明SARS-CoV N蛋白的表達(dá)隨著siRNA劑量的增加被明顯 的抑制，然后相對應(yīng)于上述的劑量和條件下以293細(xì)胞自身表達(dá)的0 -actin作內(nèi)參， 用Western blot法作鑒定(選擇購自Santa Cruz公司的山羊anti-P-actin單克隆 抗體和HRP標(biāo)記的鼠抗羊IgG及ECL試劑)，結(jié)果如圖5所示，可按下述方法對SARS-CoV N蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。
三、RNAi干擾載體對SARS-CoV N蛋白干擾效應(yīng)的定量分析 通過UVISoft UVIBand Application V97. 04軟件對圖5中的SARS-CoV N蛋白禾口 P-actin進(jìn)行定量測定，通過計算統(tǒng)一P-actin內(nèi)參為固定值并設(shè)定只轉(zhuǎn)染pcmyc +N的SARS-CoV N蛋白表達(dá)量為1 (100% )，分析RNAi干擾載體和SARS-CoV N蛋白 表達(dá)載體共轉(zhuǎn)后SARS-CoV N蛋白表達(dá)下降的百分比，結(jié)果如圖6所示，縱坐標(biāo)為 SARS-CoV N蛋白表達(dá)量，橫坐標(biāo)為pcmyc+N與RNAi干擾載體pBS/U6+ labcd或pBS/U6 十2abcd的質(zhì)量比。圖6結(jié)果表明隨著RNAi干擾載體轉(zhuǎn)染量的增加(從1: 0增加到 1: 6) ， SARS-CoV N蛋白的表達(dá)百分比下降顯著，1: 6時表達(dá)百分比僅為只轉(zhuǎn)染pcmyc + N時的20% ，說明RNAi對SARS-CoV N蛋白的表達(dá)具有明顯抑制作用。序列表
<160〉 9
<210〉 1
〈211〉 21
〈212〉 RNA <213〉人工序列
<220〉 〈223〉
〈400〉 1
gggcguucca肌caacacca a
21
〈210> 2 〈211〉 21 〈212> 薩 <213>人工序列
〈220> <223>
<400> 2
uugguguuga uuggaacgcc c 21
〈210> 3
<211> 22
<212> 腿 <213>人工序列
<220><223〉
<400〉 3
ggggaccaag accuaaucag ac 22
〈210〉 4
〈211〉 22
〈212〉 薩 〈213〉人工序列
<220> 〈223〉
<400> 4
gucugauuag gucuuggucc cc 22
<210> 5
〈211> 58
<212〉 腿 <213>人工序列
<220> <223>
〈400〉 5
gggcgttcca atcaacacca aaagcttttg gtgttgattg gaacgccctt tttctgca 58
<210> 6
<211〉 54
<212〉 DNA <213>人工序列〈220〉 〈223〉
〈400〉 6
gaaaaagggc gttccaatca acaccaaaag cttttggtgt tgattggaac gccc 54
<210〉 7
〈211〉 60
<212〉 DNA <213〉人工序列
〈220〉 <223>
<400> 7
ggggaccaag acctaatcag acaagcttgt ctgattaggt cttggtcccc tttttctgca 60
<210> 8
〈211〉 56
<212〉 腿 <213>人工序列
<220> <223〉
<400> 8
gaaaaagggg accaagacct aatcagacaa gcttgtctga ttaggtcttg gtcccc 56
<210> 9
<211> 1269
<212> m腿
<213〉 人工序列
12<220〉 〈223〉
〈400〉 9
angucugmi3auggaccccacguagugccccccgcaxiuacauuuggugga60
cccacag肌uuaacca_g￡L￡LUg眺gacgca呵gggc肌ggccetetaacag120
cgccgaccccaa_gguuu￡iccgcgucuugguUC3CagCUCUc3cuc3gcm1180
ggcaagg已gg犯cuimgaiiucccucgaggcc郷gcguuccammguggu240
ccagmig3cc3am1uggcuacuaccgaagagcuacccgacg3guucguggugg卿cggc300
aaaauga^agagcucagccccagaugguacuucumiimccimgg^cuggcccagaagcu360
UC3CUUCCCUacggcgcuaacaaagaaggc塞gumigggUUgC83CUgagggagccuug420
aauac3cccauggcacccgcMuccuaanaacaaxigcugcC3CCgUgCU3480
c^cuuccucggcuucuacgcagagggaagc卿ggcggc540
agucaagccuCLlUCUCgCUCcucancacguagucgcgguaanuca^ga^uucaacuccu600
ggcagc卿agggg3amjucuccugcucgamiggcimgcgg鄉(xiāng)uggugaa3CUgCCCUC660
gcgcuaimgcugcuagacagamigaacc3gcuugagagcaa^guuucugguaa^ggccaa720
caax)aac犯ggcca^acuguucugcugcugaggcaucuaaaaagccucgc780
ca^aacgimcugcc3caa^ac3guac^cguc3cucaagcauuugggagacguggucca840
aaggaaau皿cggggaccaagaccimaucagacaaggaac900
cauuggccgcaaanugc3caauuugcuccaagugccucugcamicuuuggaaugucacgc960
肌uggcaugga^guc3caccuucgggaacauggcugacuuaucauggagcC3uu犯mmg1020
gaugacaaagcaa^g3C3acgucaimcugcugaacaagcacauugacgca1080
UCCC3CC犯Cugaugaagcu1140
cagccuuugccccacugugacucuucuuccugcggcugac1200
auggmigamiucucca^C33cuucaa^anUCC肌g3gUgg3gcuucugcugauuc犯cu1260
caggcmia^1269
權(quán)利要求
1、抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子，是一個雙鏈RNA序列，正義鏈為序列表中序列3表示的核苷酸序列，反義鏈為序列表中序列4表示的核苷酸序列。
2、 權(quán)利要求1所述的抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子的編碼基因。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述抑制SARS冠狀病毒N蛋白表 達(dá)的小千擾RNA分子的編碼基因是一個雙鏈核苷酸序列，其有義鏈為序列表中序列7 的表示的核苷酸序列，反義鏈為序列表中序列8表示的核苷酸序列。
4、 含有權(quán)利要求2或3所述的抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子 編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌。
5、 以權(quán)利要求1所述的抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子或攜帶 所述抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子編碼基因的表達(dá)載體為活性成 分的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子及其編碼基因與應(yīng)用。該抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子，是一個雙鏈RNA序列，其正義鏈為序列表中序列3的核苷酸序列，反義鏈為序列表中序列4的核苷酸序列。本發(fā)明將在制備以抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子或攜帶所述抑制SARS冠狀病毒N蛋白表達(dá)的小干擾RNA分子編碼基因的表達(dá)載體為活性成分的藥物中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N1/00GK101597607SQ20091014221
公開日2009年12月9日 申請日期2005年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日
發(fā)明者力 劉, 云 張, 曹穎莉, 王樹惠 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所