專利名稱：一種熱穩(wěn)定性羧酸酯酶基因、編碼蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種羧酸酯酶基因、編碼蛋白及其應用，特別是具有熱穩(wěn)定性 的羧酸酯酶基因、編碼蛋白及其應用。
技術背景酯酶(estemses， EC 3丄1.X)是一大類能夠催化酯鍵水解和形成的酶類，廣泛 分布于動物、植物和微生物。酯酶主要包括羧酸酯酶(carboxylesterases，carboxyl ester hydrolases, EC 3. l.l.l)禾卩月旨肪酵(lipase, triacylglycerol hydrolases, EC 3丄1.3)。羧酸酯酶能夠水解或者合成?；滈L度小于10的甘油脂類，以三丁酸 甘油酯(tributyryglycerol)為標準底物，而脂肪酶一般以?；滈L度大于等于10個 碳原子的甘油酯為底物，三油酸甘油酯為其標準底物，不過大多數(shù)脂肪酶也能 水解羧酸酯酶的底物。酯酶屬于典型的a/p水解酶超家族，具有由Ser, His和Asp 構成的催化中心三組合(catalytic triad),其中Ser通常位于具有保守的 Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly五肽結構內。構成催化中心三組合的三個氨基酸一級結構 相差很遠，但是空間結構排列在靠近的位置上，親核氨基酸Ser殘基通過氫鍵與 His相連，Asp殘基也通過由羧基形成的氫鍵與His相連。酯酶作為一種重要的工業(yè)用酶，在全球酶制劑市場上占有很大比例。由于 酯酶基因的表達量和重組酯酶的性質受許多因素的影響(l)酯酶是一類對細胞 有毒性的物質，在異源宿主表達時常會對宿主細胞造成毒性導致細胞的裂解； (2)酯酶蛋白在折疊過程中常需要分子伴侶幫助其折疊成正確的構象；(3)酯酶在 培養(yǎng)過程中常需要誘導物的存在；(4)酯酶基因的非翻譯區(qū)，酯酶前肽和信號肽 的存在、密碼子的差異以及不同表達系統(tǒng)表達重組酯酶的糖基化等都會影響酯 酶基因的異源表達。特別是大腸桿菌，其作為低等的原核生物，缺乏完善的翻 譯后修飾系統(tǒng)，酯酶在其中的表達常以包涵體形式存在，極少獲得活性蛋白，同時熱穩(wěn)定性酯酶主要來自于嗜熱或者超嗜熱的環(huán)境中，來自中溫菌株中的熱穩(wěn)定性酯酶尚未見報道。發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的第l個技術問題是提供一種熱穩(wěn)定性的羧酸酯酶基因。本發(fā)明所要解決的第2個技術問題提供是上述基因編碼的蛋白質。本發(fā)明所要解決的第3個技術問題上述蛋白質的應用。本發(fā)明從變鉛青鏈霉菌中獲得熱穩(wěn)定性羧酸酯酶新基因^^F，其編碼如SEQ IDNO:l所示的氨基酸序列，上述由基因推導出來的氨基酸一級序列分析表明該 基因編碼蛋白是true lipases subfamily 1.7中的新成員；將esf『與pET28b質粒連接， 構建重組表達質粒pET28b-e^『；該重組質粒轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，構建用 于M,達的基因工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-eW『；上述工程菌在低溫25 'C和0.5 mM IPTG條件下獲得了較好的表達;對羧酸酯酶EstW進行純化并檢測酶 學性質表明，該酶最適反應溫度和pH分別為50'C， pH 8.0。 EstW具有極高的熱 穩(wěn)定性，95'C下溫育12.5h以后酶活為51.34n/。，隨后開始達到半衰期。本發(fā)明的酯酶在制備非類固醇消炎藥或阿魏酸的生產的應用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，含有EstW的酯酶為目前從已知中溫菌株中的鏈霉 菌獲取的熱穩(wěn)定性的酯酶，可廣泛應用于非類固醇消炎藥或阿魏酸的生產。


圖1為eW『基因的PCR擴增圖。在圖l中Ml為MarkerIII， l為as^^因的PCR擴增產物。 圖2為AWe I /屈o I雙酶切鑒定重組質粒pET28b-eW『的PCR擴增圖。 在圖2中M2為1 kb DNA Marker; 2為pET28b-eW『經A/^e I /屈o I雙 酶切產物。圖3 SDS-PAGE分析EstW的表結果示意圖。在圖3中M3為蛋白質Marker; 31為攜帶有pET28b質粒的粗酶液；32為攜帶有pET28b-e^『質粒的未經IPTG誘導的粗酶液；33為帶有pET28b-eW『質粒 的0.5mMIPTG誘導的粗酶液；34為EstW的純化蛋白圖4為EstW的酶活與溫度的關系圖。圖5為EstW的酶活與pH值的關系。在圖5中，國為Na-citrate緩沖液(pH 5.5-7.0); *為Tris—HC1 (7.0—9.0) 緩沖液；A為KH2P04-NaOH(8.5-9.5)緩沖液。.圖6為在95'C條件下，EstW的殘余酶活與時間的關系。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作詳細的說明。 實施例1:1、 羧酸酯酶基因ew『獲得培養(yǎng)變鉛青鏈霉菌TK64并提取基因組，以其基因組DNA為模板，以eW『-F: ATACGTCCATATGAGTTTCCTCAATCCCCGCAT 和 e,畫R : TAACTCGAGCGATTATAAAGCTTCCCG (下劃線分別為AWeI和Wol酶切位 點)為引物，在98 。C， 10 s， 55 。C， 10 s， 72 。C, 1 min 10 s， 35個循環(huán)的條件下進 行PCR擴增，產物進行瓊脂糖凝膠電泳(圖l)，隨后，擴增產物與載體pET28b(+) 分別經iV&I、屈ol雙酶切后，連接，轉化大腸桿菌DH5a、卡那霉素抗性篩選 陽性克隆，獲得表達質粒pET28b-eW『，雙酶切鑒定(圖2);將表達質粒 pET28b-e^『進行測序，氨基酸序列如SEQ ID NO:l所示。2、 表達工程菌構建將表達質粒pET28b-eW『按照現(xiàn)有技術轉化至大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài) 細胞，卡那霉素和氯霉素篩選陽性克隆，構建重組工程菌Rosetta(DE3) /pET28b-es氛3、 EstW的表達和純化挑取重組工程菌Rosetta(DE3) /pET28b-W『于含5 ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37 °C， 225rpm，過夜擴大培養(yǎng)；將培養(yǎng)物以1:100接種于LB液體培養(yǎng)基的 錐心瓶中，37°C， 225rpm，振蕩培養(yǎng)至OD6。o為0.4-0.6時；加入0.5 mM異丙基硫 代半乳糖苷(isopropyl-(3-D-thiogalactopyranoside， IPTG)， 25TH秀導表達10 h; 4 °C， 5,000 rpm，離心5 min，收集菌體，超聲波破碎。用Cc^+離子親和柱(TALON purification Kit)純化。純化后的蛋白質經聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定 (圖3)，如圖3所示在分子量33kDa處有一特異性很高的條帶，說明純化后的蛋 白純度較高，SDS-PAGE顯示EstW的大小約為33kDa,與通過氨基酸序列計算的 帶有6個His-tag的EstW分子量大小(32.4 kDa)相一致。 4、序列分析利用BioEdit分析eW瞎因序列，該基因全長870bp，起始密碼子為GTG，終 止密碼子為TGA， 0(:含量為68.39%,體現(xiàn)了鏈霉菌基因組的高GC含量特征。利 用ClustalX1.8和Megalign6丄分析不同家族羧酸酯酶/脂肪酶序列，表明該羧 酸酯酶屬于true lipases subfamily 1.7家族成員。EstW —級結構具有 Glyl37-Phel38-Serl39-Glul40-Gly141五肽保守區(qū)，符合酯酶保守的 Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly五肽結構，三級結構含有Ser139 - Asp235 - His270催化三亞 基，Serl39作為親核基團與Asp235、 His270通過氫鍵相連。實施例2:EstW最適溫度檢測EstW的酶活檢測標準體系lml， 50mMTris-HCL(pH8.0)， 1%乙腈，0.5 mM 的對硝基苯酚已酸酯，5pl純酶液，使用可以自動控溫的Cary300UV分光光度 計，檢測波長為410nm。設置反應溫度(1(TC-6(TC)，試驗獨立重復3次，取平均 值，結果表明該酶的最適溫度是5(TC (圖4)。實施例3:EstW最適pH檢測采用標準的測定體系，反應溫度為5(TC，在相應的pH范圍使用相應的緩沖液，pH 5.0 to 7.04, 50 mM sodium citrate buffer; pH 7.0-9.0, 50 mM Tris,HCl buffer; pH 8.5-9.0, 50 mM K2HP04-KOH buffer。檢測波長為00348，試驗獨立重復3次， 結果顯示該酶的最適pH是8.0 (圖5)。 實施例6:EstW熱穩(wěn)定性檢測將EstW純酶在20°C- 95'C范圍間不同溫度溫育一定時間，采用標準檢測體系， 50'C檢測殘余酶活，確定熱穩(wěn)定性，以未處理的純酶活性設為100%。結果表明， 該酶在5(TC和卯t:條件下分別放置173 h和13.7 h，酶活性無明顯變化。95°C 下EstW放置6.7 h，酶活仍在90%以上，12.5 h以后逐漸達到半衰期(圖6)。 EstW 是目前已知的來自鏈霉菌中熱穩(wěn)定性最高的酯酶，也是該酶所屬true lipases subfamily 1.7家族中熱穩(wěn)定性最高的酶。該酶甚至較許多來自嗜熱環(huán)境的酯酶， 如來自 T7zer附o/ /w7/c 5ac/〃ws sp.禾卩77 erwoawaera6acfer tewgcowge"s/s的月旨肪酶 及來自^^^og/oZ^s/M/gW附和嗜熱環(huán)境宏基因組文庫中的羧酸酯酶熱穩(wěn)定性 都高。序列表<110>安徽師范大學<120> —種熱穩(wěn)定性羧酸酯酶基因、編碼蛋白及其應用 <130> 1 <160> 1< 170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 289 <212> PRT<213> 變鉛青鏈霉菌(streptomyces lividands) <400> 1Val Ser Phe Leu Asn Pro Arg lie Pro Gly Val Asn Ser Asp Asp Val 1 5 10 15Val Thr Asp lie Thr Glu Ala Pro His Arg Leu Gly Ala Val Val Gin20 25 30Ala Gly Gly Ala Gin Val lie Ala Thr Val Asp Val Gin Ala Gly Glu 35 40 45Asp Asp Tip Asn Thr Pro Pro Ser Glu Glu His Pro Arg Pro Val Val50 55 60Leu Val His Gly Thr Phe Gly Asn Arg Gly Tyr Thr Tip Asn Thr Ala 65 70 75 80Val Pro Leu Leu Arg Arg His Gly His Arg Val Phe Arg Leu Asp Tyr85 卯 95Val Pro Leu Leu Arg Arg His Gly His Arg Val Phe Arg Leu Asp Tyr 85 90 956dsyS8乙 08Z SZXbiv nsi可v s人i ti9i iBA ni￡> usy nsi ib八usy j人工ojj ppmOZX S9Z 09乙J9S IBA s!h 。w iq丄s!h dsy dsV 0Jd dsy qi dsy ui￡> p八qi "乙usv usv PA W丄sX3 yCi￡) W丄s乂i可v ns^可v iq丄W工se乙 ok0Jd JilL PA PA dsy dsy "丄WD oq丄biv叩ib八JiU s!h i它八ok siz oi乙々O WO Jq丄巧工nio々{) t\9i dsy biv ni￡> Sjy uio 9iy nsq s舊SO乙 00Z S6Idsy s!h WO mi WD cxy di工biv ojj p八ib八WO ib八061 SSI 081uIO ni￡) nsi ni￡> ib八biv勺o ojj叩iqo 可v n3l usv "I 0/J S9Imi々9 uid biv iq丄ib八々o s!h usv 叩々o ib八叫d091 "I 0"usv s!H I它A sXq ojd人io ^0 nsi usy nsi jX丄jX丄§oy 0Jds￡i 0U pjA[々￡)々￡> uio 叫d iba ti3i dsy f八xqo ui{)可y々￡)hi on巧工3"TV nsi iB八nio dsy卩a siy dsv biv n9l ui￡) §JV可v J9S Oil SOI 001s!H an dsy AO 々{) sqd叩ojd usy s!H WO ^
權利要求
1、一種熱穩(wěn)定性羧酸酯酶，其特征在于它具有SEQ ID NO1，所示的氨基酸序列。
2、 一種編碼權利要求1所述的熱穩(wěn)定性羧酸酯酶的基因。
3、 權利要求1所述的熱穩(wěn)定性羧酸酯酶在制備非類固醇消炎藥或阿魏酸 的生產的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種熱穩(wěn)定性羧酸酯酶基因、編碼蛋白及其應用，所述的酯酶具有SEQ ID NO1，所示的氨基酸序列。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，含有EstW的酯酶為目前從已知中溫菌株中的鏈霉菌獲取的熱穩(wěn)定性的酯酶，可廣泛應用于非類固醇消炎藥或阿魏酸的生產。
文檔編號C12N9/18GK101603037SQ20091014421
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月23日 優(yōu)先權日2009年7月23日
發(fā)明者平 宋, 曹正宇, 朱國萍, 鵬 王, 王寶娟, 蘇蕊蕊, 葛亞東, 陳露露 申請人:安徽師范大學