專利名稱：利用RNAi技術(shù)和RNAi rescue原理制備突變型克隆載體的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用RNAi技術(shù)和RNAi rescue原理制備 突變型克隆載體的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNAi (RNA interference, RNA干擾)是一種高效的特異性強(qiáng)的基因阻斷技術(shù)，通 過切斷目的基因mRNA達(dá)到沉默目的基因的作用，RNAi技術(shù)是一種新興的基因研究工具，目 前已經(jīng)被廣泛常規(guī)應(yīng)用于各種領(lǐng)域的基因功能研究。隨著研究深入發(fā)現(xiàn)RNAi存在比較普遍的脫靶現(xiàn)象，為了證實(shí)沉默的是否為靶基 因，人們采用不同的RNAi靶點(diǎn)證實(shí)獲得相同的基因功能結(jié)果來證明對(duì)目的基因進(jìn)行了特 異性沉默，但這種方法存在所設(shè)計(jì)的RNAi靶點(diǎn)均發(fā)生脫靶的幾率，如果所設(shè)計(jì)的RNAi靶點(diǎn) 均發(fā)生脫靶，則無法證明對(duì)目的基因是否進(jìn)行了特異性沉默。另一種方法就是構(gòu)建RNAi target區(qū)突變體，即對(duì)該區(qū)的堿基序列進(jìn)行同義突變， 一方面不被RNAi沉默，一方面能保證表達(dá)的蛋白與內(nèi)源、野生型載體表達(dá)的蛋白功能一 致，該方法被稱為RNA干擾回復(fù)(S卩RNAi rescue)技術(shù)。通過RNA干擾回復(fù)技術(shù)對(duì)基因 表達(dá)進(jìn)行回復(fù)，如果回復(fù)的結(jié)果和RNAi的結(jié)果相反，則可以確認(rèn)該基因功能。RNA干擾回復(fù) 方法在設(shè)計(jì)上更加科學(xué)，也更加嚴(yán)格。對(duì)于RNA干擾回復(fù)的應(yīng)用目前報(bào)道不多，其主要原因 在于獲得突變型過表達(dá)載體的關(guān)鍵技術(shù)不夠成熟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種利用RNAi技術(shù)和RNAi rescue原 理制備突變型克隆載體的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明原理是在將目的基因相應(yīng)的RNAi target序列的堿基進(jìn)行同義突 變，從而獲得不被RNAi沉默，且能表達(dá)正常功能的克隆載體。本發(fā)明的最核心的技術(shù)關(guān)鍵是通過分子克隆的方法在目的基因的RNAi target序 列的所有第三個(gè)位置的堿基進(jìn)行同義突變，使其堿基序列改變但氨基酸不變，通過堿基同 義突變后獲得的克隆載體具有不被RNAi沉默又能表達(dá)正常功能蛋白的特性。上述突變型克隆載體能夠避免RNAi沉默，同時(shí)該突變型克隆載體能夠表達(dá)正常 功能的蛋白。本發(fā)明提供了一種利用RNAi技術(shù)和RNAi rescue原理制備突變型克隆載體的方 法，包括下列步驟目的基因RNAi有效靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、構(gòu)建shRNA載體；RNAi target mRNA區(qū)第 三個(gè)堿基同義突變；多重PCR獲得含同義突變的目的基因全長(zhǎng)mRNA ；突變型克隆載體構(gòu)建； 突變型克隆載體構(gòu)建成功證明；回復(fù)功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞克隆形成。所述目的基因RNAi有效靶點(diǎn)設(shè)計(jì)是指針對(duì)目的基因，按照RNAi序列設(shè)計(jì)原則， 設(shè)計(jì)RNAi靶點(diǎn)序列。
所述RNAi序列設(shè)計(jì)原則可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的RNAi序列設(shè) 計(jì)原則進(jìn)行自行選擇，如AA-N19設(shè)計(jì)原則、AA-N19-TT設(shè)計(jì)原則、QIAGEN公司的siRNA設(shè) 計(jì)原則等。所述AA-N19設(shè)計(jì)原則具體為從啟動(dòng)序列下游75個(gè)堿基開始尋找第一個(gè)AA序 列，確定AA序列之后的19個(gè)堿基序列為目的序列；計(jì)算AA2N19221序列中的G/C含量比 值，G/C含量為30% 70%，最優(yōu)為50%。如果在此序列中G/C含量不能達(dá)到要求，繼續(xù) 尋找下一個(gè)AA序列，直到獲得最優(yōu)結(jié)果。然后在GenBank表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫中用 BLAST檢索，確認(rèn)所設(shè)計(jì)siRNA序列的唯一性。所述AA-N19-TT設(shè)計(jì)原則具體為從啟動(dòng)序列下游100 200bp至翻譯終止密 碼上的0 IOObp的范圍內(nèi)搜尋AA序列，并記錄每個(gè)AA的3’端相鄰19個(gè)核苷酸作為候 選干擾序列靶位點(diǎn)；其中AA(N19)TT是最理想的序列，若無此序列，亦可選用NA(N21)或 NAR(W7) YNN(R表示嘌呤，Y表示嘧啶)，但在合成時(shí)，干擾序列的正義鏈3，端需用dT_dT代 替。需要注意的是在設(shè)計(jì)的干擾序列時(shí)不要針對(duì)mRNA的5’和3’端非編碼區(qū)，因?yàn)檫@些 區(qū)域有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)，而非編碼區(qū)(UTR)結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì) 影響siRNP(si protein complex，核酸內(nèi)切酶復(fù)合物)結(jié)合mRNA，從而影響干擾效果。最 后將候選的干擾序列在GenBank進(jìn)行BLAST檢索，與非同源基因具有3個(gè)或3個(gè)以上堿基 相異的序列方可選用。所述QIAGEN公司的siRNA設(shè)計(jì)原則具體為第一，在mRNA編碼區(qū)選擇21個(gè)或 23個(gè)堿基序列，序列中GC含量比值接近50 %，優(yōu)選的GC含量比值為45% 55 %，上限為 60%，超過70%作用明顯減弱。應(yīng)該避免50 IOOnt的AUG啟動(dòng)子和50 IOOnt的終止 子區(qū)域；第二，在一排序列中避免出現(xiàn)3個(gè)以上的鳥嘌呤；第三，優(yōu)先選擇AA起始序列。如 果難以發(fā)現(xiàn)AA起始序列和滿足第一、第二條原則，則選擇另外23nt編碼區(qū)域，繼續(xù)按第一 和第二條原則重新選擇；第四，確保所選靶序列與其他基因序列沒有同源性，在GenBank中 用BLAST軟件查對(duì)，確保靶序列的唯一性。優(yōu)選的，所述RNAi序列設(shè)計(jì)原則為啟動(dòng)序列下游75-100個(gè)堿基以后、終止密碼 子100個(gè)堿基以前的片斷；且GC比例為35% 55%的序列；最后要對(duì)該序列進(jìn)行blast同 源分析，確認(rèn)所設(shè)計(jì)RNAi序列的唯一性。所述滿足最佳動(dòng)力學(xué)參數(shù)的RNAi靶序列是指序列中GC含量為45% 55%，3’ 端自由能低于5’端自由能，且經(jīng)過同源分析后確認(rèn)該序列唯一的RNA干擾靶序列。所述ShRNA(小發(fā)卡或短發(fā)卡 RNA，small hairpin RNA or short hairpin RNA, shRNA)載體構(gòu)建的具體步驟為a)制備含有RNAi序列的雙鏈DNA oligo，將該雙鏈DNA oligo連接到RNAi載體 上制得shRNA載體；b) shRNA載體轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，real-time PCR (實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng))對(duì)目的基因敲 減效率進(jìn)行鑒定；c)獲得敲減效率達(dá)85%以上的shRNA載體進(jìn)行病毒包裝。 優(yōu)選的，所述步驟a)中的含有RNAi序列的雙鏈DNA oligo由siRNA (smal 1 interferingRNA，小干擾RNA)和莖環(huán)連接序列(loop)組成。所述莖環(huán)連接序列選自TCAAGAG、TTCAAGAGA、GAAGCTTG、TCTCTTGAA,優(yōu)選為TTCAAGAGA。所述步驟a)中的含有RNA干擾序列的雙鏈DNA oligo序列可以由本領(lǐng)域技術(shù)人 員使用免費(fèi)設(shè)計(jì)軟件，如Genelink公司的設(shè)計(jì)軟件、shRNA Designer或siSearch等軟件 進(jìn)行設(shè)計(jì)。優(yōu)選的，所述含干擾序列的雙鏈DNA oligo序列的兩端含有酶切位點(diǎn)粘端，可以直 接與酶切后的RNAi載體進(jìn)行連接。優(yōu)選的，所述步驟a)中的RNAi載體為慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGCL_GFP。優(yōu)選的，所述步驟b)中，real-time PCR方法對(duì)目的基因敲減效率進(jìn)行鑒定的具 體步驟為抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，然后使用SYBR Green法對(duì)目的基因mRNA進(jìn)行定量分析， 確定沉默效率。具體實(shí)驗(yàn)步驟可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)分子實(shí)驗(yàn)中的相關(guān)方法確定。所述步驟c)中的病毒選自腺病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺相關(guān)病毒，優(yōu)選為慢 病毒。所述步驟c)中的病毒包裝可使用市售試劑盒參照其說明書進(jìn)行操作，或者委托生物 公司進(jìn)行。所述RNAi target mRNA區(qū)第三個(gè)堿基同義突變是指將目的基因的RNA干擾靶序 列中，所有編碼氨基酸的三聯(lián)密碼子中的第三個(gè)堿基進(jìn)行同義突變，使其堿基序列改變但 表達(dá)的氨基酸種類不變。所述多重PCR獲得含同義突變的目的基因全長(zhǎng)mRNA的具體步驟為①在RNAi對(duì)應(yīng)的目的基因mRNA序列，設(shè)計(jì)正向引物RNAi-F和反向引物RNAi-R 引物，在目的基因兩端分別設(shè)計(jì)左側(cè)引物Gene-F和右側(cè)引物Gene-R ； ②第一輪PCR分別采用正向引物RNAi-F和右側(cè)弓|物Gene-R ；反向引物RNAi-R和 左側(cè)引物Gene-F進(jìn)行擴(kuò)增；③第二輪PCR以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板，采用左側(cè)引物Gene-F和右側(cè)引物 Gene-R引物進(jìn)行擴(kuò)增。所述步驟①中的正向引物RNAi-F和反向引物RNAi-R與目的基因RNA干擾靶序列 相對(duì)應(yīng)的序列中，所有編碼氨基酸的三聯(lián)密碼子中的第三個(gè)堿基進(jìn)行同義突變。所述步驟①中的正向引物RNAi-F、反向引物RNAi-R、左側(cè)弓丨物Gene-F和右側(cè)弓丨物 Gene-R可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)目的基因mRNA序列和目的基因序列，使用PCR引物設(shè)計(jì) 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。PCR反應(yīng)體系主要包括酶、模板、引物、buffer、MgCl2和dNTPs，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)采用不同的反應(yīng)體系及參數(shù)組合。PCR反應(yīng)條件參數(shù)主要包括變 性、退火、延伸，具體的時(shí)間和溫度，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。所述突變型克隆載體構(gòu)建的具體步驟為a載體進(jìn)行雙酶切；b線性化載體與多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接；c 轉(zhuǎn)化；d陽性克隆PCR鑒定；e陽性克隆測(cè)序鑒定。所述突變型克隆載體構(gòu)建成功證明的具體步驟為1) shRNA載體與突變型載體共同轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞；2)熒光顯微鏡下確定感染率達(dá)85%以上；
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3)收集細(xì)胞，抽提protein ；4) Western-blot鑒定突變型載體是否不被沉默。上述酶切、載體與插入片段的連接、轉(zhuǎn)化、PCR鑒定、測(cè)序、轉(zhuǎn)染、protein抽提以及 Western-blot過程均可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作。所述回復(fù)功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞克隆形成的具體步驟為(1) shRNA載體和突變型克隆載體分別或共同感染靶細(xì)胞；(2)細(xì)胞接種于6孔板中，每孔400個(gè)細(xì)胞，每隔2天換一次培養(yǎng)基；(3)第14天顯微鏡觀察細(xì)胞克隆數(shù)大小。本發(fā)明第二方面，公開了上述突變型克隆載體在基因功能研究方面的應(yīng)用，包括 下列步驟I將目的基因的RNAi序列對(duì)應(yīng)的shRNA (short hairpin RNA,短發(fā)夾RNA)插入載 體；II將shRNA載體與突變型載體分別或共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞；III抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行沉默效率鑒定；IV提取protein，western-blot對(duì)突變型克隆載體進(jìn)行鑒定，突變型載體不被 RNAi沉默則表明構(gòu)建成功；V細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)上述分別或共同轉(zhuǎn)染shRNA和突變型載體的細(xì)胞進(jìn)行功能檢 測(cè)。本發(fā)明的突變型克隆載體巧妙結(jié)合RNAi技術(shù)和RNAi rescue原理，與RNAi結(jié)合， 能夠?qū)?nèi)源目的基因進(jìn)行沉默，對(duì)外源導(dǎo)入的突變型克隆載體不沉默，但突變型克隆載體 表達(dá)的蛋白功能與內(nèi)源基因表達(dá)的蛋白功能一致，為基因功能研究提供一種新方法、新體系。本發(fā)明制備的突變型載體不被RNAi干擾沉默，能表達(dá)出功能與野生型載體相同 的蛋白；它是研究基因功能的良好模型，對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行沉默，外源基因?qū)牒蟛槐怀聊?同時(shí)，本發(fā)明通過RNAi沉默基因觀察功能變化情況，回復(fù)突變的載體與RNAi同時(shí)感染或轉(zhuǎn) 染目的細(xì)胞，一方面沉默內(nèi)源目的基因，但不沉默外源目的基因，通過外源突變型載體表達(dá) 與內(nèi)源相同功能的蛋白，經(jīng)過這樣組合處理細(xì)胞功能不發(fā)生改變；或者將突變型載體導(dǎo)入 RNAi沉默后，功能得到回復(fù)，證明功能表型是由此基因引起的。本發(fā)明為基因功能研究提供 了一種新的模型、方法。


圖1:RNA干擾(RNAi)技術(shù)原理示意圖。
圖2:RNA干擾回復(fù)(RNAi rescue)原理示意圖。
圖3shRNA載體構(gòu)建。
圖4用于shRNA構(gòu)建的質(zhì)粒圖譜。
圖5載體線性化電泳圖。
圖6= ShRNA載體陽性克隆PCR瓊脂糖電泳圖。
圖7突變型載體構(gòu)建流程圖。
圖8突變型載體質(zhì)粒圖譜。
圖9 突變型載體線性化電泳圖。圖10 突變型載體陽性克隆PCR瓊脂糖電泳圖。圖11 突變型載體功能研究流程圖。圖12 細(xì)胞克隆形成熒光圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非 限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說明配方的試劑均為按 照常規(guī)條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。實(shí)施例1突變型克隆載體制備1、原理實(shí)驗(yàn)原理如圖1和圖2所示，本實(shí)施例中使用的目的基因?yàn)?0PN(0steOpontin，骨橋蛋白)基因，突變型慢病毒過表達(dá)載體在RNAi target區(qū)堿基進(jìn)行 突變，在第三個(gè)堿基進(jìn)行同義突變，即雖然二者的堿基不同，但表達(dá)相同的氨基酸相同；因 此，該突變型能夠避免被RNAi降解，同時(shí)翻譯出的蛋白具有正確的生物學(xué)功能。制備兩端 含酶切位點(diǎn)粘端的含干擾序列的雙鏈DNA oligo序列，直接連入干擾載體；然后將連接好 的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)長(zhǎng)出的克隆先進(jìn)行PCR鑒定，在進(jìn)行測(cè)序比對(duì)后， 鑒定陽性的克隆即為構(gòu)建成功的目的基因RNA干擾慢病毒載體。2、制備步驟實(shí)驗(yàn)流程如圖3所示2. 1針對(duì)目的基因OPN基因，根據(jù)AA-N19-TT設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)RNA干擾靶序列，設(shè)計(jì) 結(jié)果如下2. 2根據(jù)已經(jīng)設(shè)計(jì)的RNA干擾序列，設(shè)計(jì)兩端含HpaI和XhoI酶切位點(diǎn)粘端的含干 擾序列的雙鏈DNA oligo序列，設(shè)計(jì)結(jié)果如下表1兩端含HpaI和XhoI酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNA oligo序列示意圖
其中，antisense序列為能夠識(shí)別并結(jié)合目的基因的mRNA序列，sense序列為與 antisense互補(bǔ)的序列。2. 3shRNA載體的構(gòu)建將兩端含HpaI和XhoI酶切位點(diǎn)粘端的含干擾序列的雙鏈 DNA oligo序列直接連入酶切后的RNA干擾載體上，該RNA干擾載體結(jié)構(gòu)如圖4所示，具體
步驟如下2. 3. 1載體的線性化本實(shí)施例所用限制性內(nèi)切酶(購自NewEngland Biolabs(NEB)公司)1)使用HpaI和XhoI進(jìn)行酶切消化，酶切反應(yīng)體系如下 將上述混合的反應(yīng)物置于37°C保溫Ih ；加人0. 5mol/L EDTA(pH8. 0)使終濃度達(dá) lOmmol/L，終止反應(yīng)；然后將上述混合的反應(yīng)物置于37°C保溫lh。2)驗(yàn)證載體酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖5所示。2. 3. 2感受態(tài)制備(氯化鈣法)1)從于37°C培養(yǎng)16小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100ml LB 培養(yǎng)基的IL燒瓶中。于37°C劇烈振搖培養(yǎng)3小時(shí)(旋轉(zhuǎn)搖床，轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分)。2)在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯 管中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至o°c。3)于4°C，以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，回收細(xì)胞。4)倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。5)以IOml用冰預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上。6)于4°C，以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，回收細(xì)胞。7)倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。8)每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸每份細(xì)胞沉淀。9)將細(xì)胞分裝成小份，放于_70°C凍存。2. 3. 3克隆制備1)連接連接反應(yīng)體系如下 上述混合物于4°C 12小時(shí)連接反應(yīng)制備克隆連接液，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。2)轉(zhuǎn)化a)冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200 μ 1轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心 管中，每管加2μ 1連接液，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘。b)將管放到預(yù)加溫到42°C的循環(huán)水浴中放好的試管架上，恰恰放置90秒，不要搖
動(dòng)試管。c)快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1-2分鐘。d)每管加800μ1 SOC培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C 搖床上，溫育45分鐘使細(xì)菌復(fù)蘇。e)將150 μ 1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/L MgSO4和Amp抗性的SOB瓊
脂培養(yǎng)基上。f)將平板置于室溫直至液體被吸收。g)倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，16小時(shí)。3)陽性克隆PCR鑒定Primer Up(+) :5，-GCCCCGGTTAATTTGCATAT-3，，如 SEQ ID NO 1 中所示。Down (-) 5，-GTAATACGGTTATCCACGCG-3，，如 SEQ ID NO 2 中所示。
其中，PCR循環(huán)條件為 其中，菌落PCR Template的制備在連接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物長(zhǎng)出菌克隆表面沾一下，溶于 10 μ ILB培養(yǎng)基中，混勻后取1 μ 1作為模板；陰性對(duì)照排除系統(tǒng)中外源核酸污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果；陽性對(duì)照以確定的含有GAPDH siRNA插入片段的載體作為模板，以標(biāo)定陽性克 隆PCR條帶的具體位置。瓊脂糖凝膠電泳圖片結(jié)構(gòu)如圖6所示；其中1#泳道對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照(ddH20) ；2#泳 道對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照(空載組);3# 泳道對(duì)應(yīng) Marker (5，3，2，1. 5，1Kb，750，500，250，IOObp) ；4# 泳道對(duì)應(yīng) Pscl-1，2，3，4，5。PCR條帶大小a)連接入shRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為366bp (從載體中切掉15bp)；b)沒有連接入shRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為322bp。4)陽性克隆測(cè)序鑒定挑選陽性克隆pscl-Ι菌液送測(cè)序(Invitrogen公司使用ABI 3733型測(cè)序儀進(jìn)行 測(cè)序分析)，測(cè)序結(jié)果RNAi靶點(diǎn)序列如SEQ ID NO 3中所示。2. 4突變型克隆載體構(gòu)建1)實(shí)驗(yàn)原理
以含有OPN(ΝΜ_001040058)的質(zhì)粒為模板，利用PCR方法釣取目的基因，將目的基 因與目的載體分別進(jìn)行酶切。純化酶切產(chǎn)物后進(jìn)行定向連接，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞， 對(duì)長(zhǎng)出的克隆先進(jìn)行PCR鑒定，其上下游引物分別設(shè)計(jì)在載體和目的基因上，PCR鑒定為陽 性的克隆，證明目的基因已經(jīng)定向連入目的載體。再對(duì)PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測(cè)序和分 析比對(duì)，比對(duì)正確的即為構(gòu)建成功的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體。將構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)載 體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提。實(shí)驗(yàn)流程圖如圖7所示。2)實(shí)驗(yàn)步驟a)載體的線性化本實(shí)施例中使用的載體結(jié)構(gòu)如圖8所示； 將上述混合的反應(yīng)物置于37°C，酶切l(wèi)h，載體酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖9 所示。2. 4引物合成l)opn-Age I—F 如 SEQ ID NO :4 中所示。CAGGATCCCCGGGTCGCCACCATGAGAATTGCAGTGATTTGC引物說明含交換配對(duì)堿基(CAGGATCCCCGGGT 1)、Age I酶切位點(diǎn)(^CGCiT ) 以及表達(dá)增強(qiáng)序列(CGCCACC)，并含有目的基因5’端部分序列(NM_000582. 2對(duì)應(yīng)序列位 置166-186，ATGAGAATTGCAGTGATTTGC)，用于 PCR 釣取目的基因。2) opn-Age I-R 如 SEQ ID NO :5 中所示TCACCATGGTGGCG 麵ACATTGACCTCAGAAGATGCACTA引物說明含交換配對(duì)堿基(TCACCATGGTGGCG遲)和Age I酶切位點(diǎn) (ACCGGT )，并含有目的基因3，端部分序列(NM_000582. 2對(duì)應(yīng)序列位置1044_1065， ATTGACCTCAGAAGATGCACTA)，用于 PCR 釣取目的基因。3)0PN-140-F 如 SEQ ID NO 6 中所示f CA Q TC B GA fl GA 1 TC _ GA I GAACTGGTCACTGATTTTCCCA引物說明在pscl40的相應(yīng)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了同義突變(其中，陰影標(biāo)出的位點(diǎn)部分為 同義突變位置，NM_000582. 2對(duì)應(yīng)序列位置495_535)。
4) 0PN-140-R 如 SEQ ID NO 7 中所示GTC I GA fc TC _ TC 爵 GA 0； TG § TGAGACTCATCAGACTGGTGAG引物說明在pscl40的相應(yīng)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了同義突變(其中，陰影標(biāo)出的位點(diǎn)部分為 同義突變位置，NM_000582. 2對(duì)應(yīng)序列位置473_513)。5)0PN-2_R 如 SEQ IDNO :8 中所示TGGAAGGGTCTGTGGGGCTAGGAGATTC引物說明用于獲得突變型OPN基因轉(zhuǎn)錄本與原OPN基因轉(zhuǎn)錄本相同的前半部分 (NM_000582. 2 對(duì)應(yīng)序列位置321-348)。6) 0PN-2-F 如 SEQ ID NO 9 中所示TAGCCCCACAGACCCTTCCAAGTAAGTCCA引物說明用于獲得突變型OPN基因轉(zhuǎn)錄本與原OPN基因轉(zhuǎn)錄本相同的后半部分 (NM_000582. 2 對(duì)應(yīng)序列位置329-358)。7) opn-SEQF 如 SEQ ID NO 10 中所示GTTTCGCAGACCTGACATCC引物說明該引物(NM_000582. 2對(duì)應(yīng)序列位置642_661)用于PCR鑒定目的基因 定向連接的陽性克隆菌落。8) pGC-FU-SEQR 如 SEQ ID NO 11 中所示CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG引物說明該引物(載體對(duì)應(yīng)序列位置3920-3939)用于PCR鑒定目的基因定向連 接的陽性克隆菌落以及測(cè)序。2.5PCR獲得目的基因片段PCR反應(yīng)體系 a)片段 APCR引物說明Primer (+) :opn_Age I-FPrimer (-) :0PN_2-RPCR儀進(jìn)行反應(yīng)，按以下循環(huán)條件 PCR 產(chǎn)物大小200bp ；b)片段 BPCR引物說明Primer (+) :0PN-2_FPrimer (-) :opn-140_RPCR儀進(jìn)行反應(yīng)，按以下循環(huán)條件 PCR 產(chǎn)物大小200bp ；c)片段 CPCR引物說明Primer (+) :opn-140_FPrimer (-) :opn_Age I-RPCR儀進(jìn)行反應(yīng)，按以下循環(huán)條件 PCR 產(chǎn)物大小593bpd)基因全長(zhǎng)的獲得(注模板為前面得到的片段A+B+C)PCR引物說明:Primer (+) :opn_Age I-FPrimer (-) :opn_Age I-RPCR儀進(jìn)行反應(yīng)，按以下循環(huán)條件 PCR 產(chǎn)物大小952bp2. 5重組克隆制備2. 5. IPCR產(chǎn)物交換連接入酶切真核表達(dá)載體反應(yīng)體系
反應(yīng)條件23°C反應(yīng)15分鐘，再于42°C反應(yīng)15分鐘制備克隆交換液，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。2. 5. 2感受態(tài)細(xì)胞的制備用氯化鈣制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞1)從于37°C培養(yǎng)16小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100ml LB 培養(yǎng)基的IL燒瓶中。于37°C劇烈振搖培養(yǎng)3小時(shí)(旋轉(zhuǎn)搖床，轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分)。2)在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯 管中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至o°c。3)于4°C，以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，回收細(xì)胞。4)倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。5)以IOml用冰預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上。6)于4°C，以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，回收細(xì)胞。7)倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘，使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。8)每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸每份細(xì)胞沉淀。9)將細(xì)胞分裝成小份，放于_70°C凍存。2. 5. 3 轉(zhuǎn)化1)用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200 μ 1轉(zhuǎn)移到無菌的微量離 心管中，每管加10μ 1連接液，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘。2)將管放到預(yù)加溫到42°C的循環(huán)水浴中放好的試管架上，恰恰放置90秒，不要搖
動(dòng)試管。3)快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1-2分鐘。4)每管加800 μ 1 LB培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C 搖床上，溫育45分鐘使細(xì)菌復(fù)蘇。5)將150 μ 1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/L MgSO4和AMP抗性(IOOug/ ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。6)將平板置于室溫直至液體被吸收。7)倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，16小時(shí)。
8)長(zhǎng)出的克隆進(jìn)行后續(xù)PCR鑒定。2.6陽性克隆的PCR鑒定PCR反應(yīng)體系 PCR引物說明Primer (+) :opn_SEQFPrimer (-) :pGC-FU_SEQRPCR儀進(jìn)行反應(yīng)，按以下循環(huán)條件 1)菌落PCR Template 在連接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物長(zhǎng)出菌克隆表面沾一下，溶于10 μ 1 LB, 混勻取1 μ 1作為模板；2)陰性對(duì)照排除系統(tǒng)中外源核酸污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果；3)陽性對(duì)照以確定的含有引物要釣取的其他目的基因的載體作為模板，如 GAPDH基因，以排除PCR反應(yīng)體系的異常造成的假陰性結(jié)果。
PCR產(chǎn)物大小506bp ；PCR陽性克隆鑒定結(jié)果如圖10所示；其中，1#泳道為陰性 對(duì)照(空載組)；2#泳道為陽性對(duì)照(有確定插入片段的載體組)；3#泳道為Marker (5kb， 3kb, 2kb, 1. 5kb,1Kb,750bp,500bp,250bp,IOObp) ；4# 泳道為 pGC-FU-opn (-1) ；5# 泳道 為 pGC-FU-opn (-2) ；6# 泳道為 pGC-FU-opn (-3) ； 7# 泳道為 pGC-FU-opn (-4) ；8# 泳道為 pGC-FU-opn (-5) ；9# 泳道為 pGC-FU-opn (-6)。2. 7陽性克隆測(cè)序，序列如SEQ ID NO 12中所示，且與數(shù)據(jù)庫中的已知OPN序列 (NCBI的序列號(hào)為NM_000582. 2)進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示陽性克隆序列與已知OPN 序列的形似度為99%以上。實(shí)施例2實(shí)施例1制備的突變型克隆載體的證實(shí)實(shí)驗(yàn)1.實(shí)施流程將RNAi和RNAi rescue的突變型載體共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，收集RNA和 protein進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)目的細(xì)胞的形態(tài)和功能改變情況，觀察細(xì)胞功能是否得到回復(fù)。2.實(shí)施流程如圖12所示2. 1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染1)細(xì)胞鋪板將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞胰酶消化后，鋪到24孔板中，10%匯合度2)病毒感染第二天將載體按圖10的組別感染細(xì)胞3)感染效率鑒定第四天熒光顯微鏡觀察細(xì)胞感染效率，保證細(xì)胞感染效率達(dá) 85%以上2. 2. RNAi沉默效率鑒定收集上述細(xì)胞，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，SYBR Green法對(duì) 目的基因(本實(shí)施例中的目的基因?yàn)?ΡΝ) mRNA進(jìn)行定量分析，確定沉默效率，具體步驟如 下反應(yīng)體系 反應(yīng)條件
analysisenabled 制作熔解曲線
統(tǒng)計(jì)方法Real-time PCR數(shù)值分析采用2_ Δ ACt分析法
制圖軟件GraphPad PRISM 4. 02.3.突變型載體構(gòu)建成功與否鑒定收集上述細(xì)胞，抽提蛋白，western-blot檢 測(cè)突變是否成功。判斷標(biāo)準(zhǔn)感染shRNA載體組目的基因(OPN)被沉默；感染突變型載體組 目的基因不被沉默。2. 4.突變型載體功能回復(fù)驗(yàn)證RNAi沉默效率達(dá)85%以上且突變型載體證實(shí)突變成功的組別的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞功 能研究(本實(shí)施例以細(xì)胞克隆形成檢測(cè)為例，具體過程參見2. 5)2. 5.克隆形成實(shí)驗(yàn)2. 5. 1基本原理細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞接種后貼壁和增殖活力，克隆形成率反映細(xì)胞群體依 賴性和增殖能力。克隆形成率測(cè)定時(shí)，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液，直接接種在培養(yǎng) 板中，持續(xù)一周，隨時(shí)檢查，到細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)。2. 5. 2操作步驟及每步需注意事項(xiàng)1)細(xì)胞懸液制備胰酶消化生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；2)細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度1 X IOVmL ；3)細(xì)胞接種接種于6孔板中，每孔200 400個(gè)之間，每組三個(gè)復(fù)孔；4)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)10 14天，觀察細(xì)胞克隆數(shù)(至少保證每個(gè)克隆大于50 個(gè)細(xì)胞)每3天換一次液；5)熒光拍照實(shí)驗(yàn)終止前熒光顯微鏡下對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行拍照(100倍)，白光背景 和熒光；2. 5. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯微鏡圖片如圖13所示，回復(fù)實(shí)驗(yàn)證明該基因的三個(gè)轉(zhuǎn)錄本中 只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄本(倒數(shù)第二個(gè)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本)可以回復(fù)目的基因被沉默之后降低的克隆形 成能°序列表<110>上海吉?jiǎng)P基因有限公司<120>利用RNAi技術(shù)和RNAi rescue原理制備突變型克隆載體的方法及應(yīng)用<130)090665<160>12<170>PatentIn version 3. 5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>1
gccccggtta atttgcatat20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>2
gtaatacggt tatccacgcg20
<210>3
<211>59
<212>DNA
<213>引物
<400>3
tgaccattct gatgaatctg atttcaagag aatcagattc atcagaatgg tcttttttc 59
<210>4
<211>48
<212>DNA
<213〉引物
<400>4
caggatcccc gggtaccggt cgccaccatg agaattgcag tgatttgc48
<210>5
<211>44
<212>DNA
<213>引物
<400>5
tcaccatggt ggcgaccggt acattgacct cagaagatgc acta44
<210>6 <211>41 <212>DNA <213>引物 <400>6
tcactccgac gagtccgacg aactggtcac tgattttccc a41
<210>7
<211>41
10
CNgccttgtatgcaccattcaactcctcgctt tccatgtgtg aggtgatgtcctcgtctgta420
gcatcagggtactggatgtcaggtctgcga aacttcttag attttgacctcagtccataa480
accacactatcacctcggccatcatatgtg tctactgtgg ggacaactggagtgaaaact540
tcggttgctggcaggtccgtgggaaaatca gtgaccagtt cgtcggactcgtcggagtga600
tgagactcatcagactggtgagaatcatca gtgtcatcta catcatcagagtcgttcgag660
tcaatggagtcctggctgtccacatggtca tcatcatctt catcatccatatcatccatg720
tggtcatggctttcgttggacttacttgga agggtctgtg gggctaggagattctgcttc780
tgagatgggtcagggtttagccatgtggcc acagcatctg ggtatttgttgtaaagctgc840
ttttcctcagaacttccagaatcagcctgt ttaactggta tggcacaggtgatgcctagg900
aggcaaaagcaaatcactgcaattctcatg gtggcgaccg gtacccggggatcctctaga960
gtcggtgtcttctatggaggtcaaacagcg tgatggcgtc tccaggcgatctgacggttc1020
actaaacgagctctgcttattagacctccc acgtcacgct accggccaattggcgtcaat1080
gggggcggagttttacgacatttgga110權(quán)利要求
一種利用RNA干擾技術(shù)和RNA干擾回復(fù)原理制備突變型克隆載體的方法，包括下列步驟目的基因RNAi有效靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、構(gòu)建shRNA載體；RNAi target mRNA區(qū)第三個(gè)堿基同義突變；多重PCR獲得含同義突變的目的基因全長(zhǎng)mRNA；突變型克隆載體構(gòu)建；突變型克隆載體構(gòu)建成功證明；回復(fù)功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞克隆形成。
2.如權(quán)利要求1所述利用RNA干擾技術(shù)和RNA干擾回復(fù)原理制備突變型克隆載體的方 法，其特征在于，所述突變型克隆載體能夠避免被RNAi沉默，同時(shí)該突變型克隆載體能夠 表達(dá)正常功能的蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述利用RNA干擾技術(shù)和RNA干擾回復(fù)原理制備突變型克隆載體的方 法，其特征在于，所述shRNA載體構(gòu)建的具體步驟為a)設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因mRNA的RNAi靶序列；b)根據(jù)原則分別設(shè)計(jì)成shRNA載體；c)shRNA載體轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，real-time PCR對(duì)目的基因敲減效率進(jìn)行鑒定；d)獲得敲減效率達(dá)85%以上的shRNA載體進(jìn)行病毒包裝。
4.如權(quán)利要求1所述利用RNA干擾技術(shù)和RNA干擾回復(fù)原理制備突變型克隆載體的方 法，其特征在于，所述多重PCR的具體步驟為①在RNAi對(duì)應(yīng)的目的基因mRNA序列，設(shè)計(jì)正向引物RNAi-F和反向引物RNAi-R引物， 在目的基因兩端分別設(shè)計(jì)左側(cè)引物Gene-F和右側(cè)引物Gene-R ；②第一輪PCR分別采用正向引物RNAi-F和右側(cè)引物Gene-R；反向引物RNAi-R和左側(cè) 引物Gene-F進(jìn)行擴(kuò)增；③第二輪PCR以第一輪的PCR產(chǎn)物為模板，采用左側(cè)引物Gene-F和右側(cè)引物Gene-R 引物進(jìn)行擴(kuò)增。
5.如權(quán)利要求1所述利用RNA干擾技術(shù)和RNA干擾回復(fù)原理制備突變型克隆載體的方 法，其特征在于，所述突變型克隆載體構(gòu)建的具體步驟為a載體進(jìn)行雙酶切；b線性化載體與多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接；c轉(zhuǎn)化；d陽性克隆PCR鑒定；e陽性克隆測(cè)序鑒定。
6.如權(quán)利要求1所述利用RNA干擾技術(shù)和RNA干擾回復(fù)原理制備突變型克隆載體的方 法，其特征在于，所述突變型克隆載體構(gòu)建成功證明的具體步驟為1)shRNA載體與突變型載體共同轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞；2)熒光顯微鏡下確定感染率達(dá)85%以上；3)收集細(xì)胞，抽提protein；4)Western-blot鑒定突變型載體是否不被沉默。
7.如權(quán)利要求1所述利用RNA干擾技術(shù)和RNA干擾回復(fù)原理制備突變型克隆載體的方 法，其特征在于，所述回復(fù)功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞克隆形成的具體步驟為(1)shRNA載體和突變型克隆載體分別或共同感染靶細(xì)胞；(2)細(xì)胞培養(yǎng)；(3)顯微 觀察細(xì)胞克隆數(shù)大小。
8.權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求中所述方法制備的突變型克隆載體。
9.權(quán)利要求8所述突變型克隆載體在基因功能研究方面的應(yīng)用，其特征在于，包括如 下步驟I將目的基因的RNAi序列對(duì)應(yīng)的shRNA插入載體； II將shRNA載體與突變型載體分別或共轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞； III抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行沉默效率鑒定；IV提取蛋白，使用western-blot對(duì)突變型克隆載體進(jìn)行鑒定，突變型載體不被RNAi沉 默則表明構(gòu)建成功；V細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)上述分別或共同轉(zhuǎn)染shRNA和突變型載體的細(xì)胞進(jìn)行功能檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用RNAi技術(shù)和RNAi rescue原理制備突變型克隆載體的方法及應(yīng)用，包括如下步驟目的基因RNAi有效靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和載體構(gòu)建；RNAitarget mRNA區(qū)第三個(gè)堿基同義突變；多重PCR獲得含同義突變的目的基因全長(zhǎng)mRNA；突變型克隆載體構(gòu)建；突變型克隆載體構(gòu)建成功證明；回復(fù)功能實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明的方法通過RNAi沉默基因觀察功能變化情況，回復(fù)突變的載體與RNAi同時(shí)感染或轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，一方面沉默內(nèi)源目的基因，但不沉默外源目的基因，通過外源突變型載體表達(dá)與內(nèi)源相同功能的蛋白，經(jīng)過這樣組合處理細(xì)胞功能不發(fā)生改變；或者將突變型載體導(dǎo)入RNAi沉默后，功能得到回復(fù)，證明功能表型是由此基因引起的。本發(fā)明為基因功能研究提供了一種新的模型和方法。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101880684SQ20091014626
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
發(fā)明者曹躍瓊 申請(qǐng)人:蘇州吉?jiǎng)P基因科技有限公司