專利名稱：一種用Zeocin篩選千年桐SAD基因的產(chǎn)油酵母表達(dá)載體及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，主要涉及一種用Zeocin篩選千年桐基因的產(chǎn)油酵母表達(dá) 載體及構(gòu)建方法，具體涉及酵母表達(dá)載體重組，新建表達(dá)載體產(chǎn)物可用博來霉素篩選轉(zhuǎn)千年 桐基因的產(chǎn)油酵母轉(zhuǎn)化子。
背景技術(shù)：
為應(yīng)對愈演愈烈的石油危機(jī)，世界各國都在積極制定和實(shí)施新的能源發(fā)展戰(zhàn)略，希望通 過各種可能途徑尋找到新的石油替代品，生物柴油便是其中之一。目前，生產(chǎn)生物柴油的原 料主要依賴于油料作物、木本油料人工林、動物脂肪及廢棄油脂等。從油料樹木中提取油脂， 具有占用耕地面積、周期長、成本高等一系列制約因素。發(fā)展動物油脂也同樣面臨一系列制 約因素。因此，開辟新的植物源油脂生產(chǎn)途徑，特別是工業(yè)化生產(chǎn)途徑對滿足不斷增長的生 物柴油的需求具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，除高等植物和動物能生產(chǎn)油脂外，低等的微生物也能產(chǎn)生油脂，大部分微生 物油脂的脂肪酸組成和一般植物油相似。通常情況下微生物細(xì)胞僅含油2~3%，但在適宜條件 下，某些微生物產(chǎn)生并貯存的油脂占其生物總量的20%以上，在已知細(xì)菌、酵母、霉菌和藻 類中都發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)油脂的菌株。利用微生物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)脂肪酸，為生物柴油原料生產(chǎn) 開辟了一條新的技術(shù)途徑。微生物生產(chǎn)油脂時，具有增殖快，生長周期短，適合工廠化生產(chǎn)， 投入較少，收獲穩(wěn)定，不受季節(jié)、氣候等環(huán)境條件影響，且不消耗化學(xué)肥料和農(nóng)藥，因而對 環(huán)境污染減輕。但目前微生物存在產(chǎn)油率低，油脂成分組成復(fù)雜，與生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生物柴油的原 料要求仍為較大距離。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，將植物脂肪酸合成相關(guān)基因特別是控制產(chǎn)脂量 和脂肪酸品質(zhì)的基因?qū)胝婢?，?gòu)建優(yōu)質(zhì)"基因工程菌株"，使植物脂肪酸合成酶基因在微 生物細(xì)胞中的高效表達(dá)，增加微生物產(chǎn)脂量，提高和控制脂肪酸組成。此種新方式可從根本 上解決微生物產(chǎn)脂菌油質(zhì)差、產(chǎn)油率低的缺陷，又可充分發(fā)揮微生物適合于生物反應(yīng)器發(fā)酵 以及林源優(yōu)質(zhì)脂肪酸合成酶的優(yōu)點(diǎn)。△9硬脂酰-ACP脫飽和酶(Stearoyl-ACPdesaturase，簡稱SAD)是目前研究最多、最 廣泛的Acyl-ACP脫飽和酶。該酶催化的反應(yīng)是在第9 10碳原子之間形成第一個雙鍵，是 不飽和脂肪酸生物合成途徑的第一步脫飽和，直接調(diào)控膜脂與貯脂中飽和與不飽和脂肪酸的 比例，該酶對調(diào)節(jié)油料作物種子中脂肪酸含量和組分具有非常重要的意義。千年桐是生產(chǎn)生 物柴油的理想樹種之一，將千年桐的S^D基因構(gòu)建在酵母表達(dá)載體上并整合到產(chǎn)油酵母中高效表達(dá)，使產(chǎn)油酵母的飽和脂肪酸向油酸轉(zhuǎn)化，從而大大提高油脂成分中油酸的含量，為酵 母產(chǎn)油符合生物柴油的質(zhì)量要求奠定基礎(chǔ)。目前高效篩選產(chǎn)油酵母轉(zhuǎn)化子的表達(dá)載體還鮮見報(bào)道。酵母是一種重要的基因表達(dá)系統(tǒng)， 其中釀酒酵母和畢赤酵母應(yīng)用最廣，但它們的表達(dá)載體在產(chǎn)油酵母中沒有相應(yīng)的表達(dá)元件， 因此不能直接作為產(chǎn)油酵母的表達(dá)載體。pCAMBIA系列的表達(dá)載體是植物中常用的表達(dá)載 體，其中pCAMBIA3300被改造后曾被用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)甘油的假絲酵母，獲得了轉(zhuǎn)基因工程菌。 pCAMBIA2300也屬于這類表達(dá)載體，但它本身所攜帶的抗性標(biāo)記基因——新霉素磷酸轉(zhuǎn)移 酶基因(NPTII)具有卡那霉素抗性，而產(chǎn)油酵母對卡那霉素不是很敏感，因此也不能直接 作為產(chǎn)油酵母的表達(dá)載體。新一代的畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZ A、 B、 C具有博來霉素(Zeocin) 抗性標(biāo)記基因幼他，重組轉(zhuǎn)化子可直接用Zeocin進(jìn)行篩選。幼他基因編碼一種13，665 Da 的蛋白，具有Zeocin抗性的細(xì)胞可以避免Zeocin結(jié)合和剪切細(xì)胞DNA。 Zeocin可用于選擇 哺乳動物細(xì)胞系、酵母、昆蟲和細(xì)菌。在含Zeocin平板上生長的酵母轉(zhuǎn)化子中，100%具有 外源基因的整合，大大簡化了重組轉(zhuǎn)化酵母的篩選過程。將S/zWe基因從pPICZA、 B、 C表 達(dá)載體上克隆下來連接到常用的表達(dá)載體上，使該載體獲得Zeocin抗性，有利于產(chǎn)油酵母轉(zhuǎn) 化子的篩選。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服上述技術(shù)的不足,而提供一種用Zeocin篩選千年桐基因的產(chǎn)油 酵母表達(dá)載體及構(gòu)建方法。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)-本發(fā)明所述的用Zeocin篩選千年桐基因的產(chǎn)油酵母表達(dá)載體，該載體以 pCAMBIA2300為基本骨架，其所含的幼We基因，適用于篩選具有Zeocin抗性的轉(zhuǎn)基因產(chǎn) 油酵母；該載體含有千年桐&4Z)基因，可以改變產(chǎn)油酵母脂肪酸成分從而提高油酸含量。本發(fā)明所述的用Zeocin篩選千年桐&4?；虻漠a(chǎn)油酵母表達(dá)載體的構(gòu)建方法,步驟如下1 、千年桐基因cDNA編碼區(qū)全長序列獲得根據(jù)在GenBank上登錄的基因核苷酸和氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物，以千年桐種子總 RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，獲得全長cDNA，電泳回收基因cDNA片段，克 隆到pGEMT-Easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，測序，命名該載體為pGEM-T-Vesad。2、 &10正義表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)合表達(dá)載體pCAMBIA2300的限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)——Kpn I、 I、 I、 Xba I、Sal I、 Pst I，分析基因的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，由于基因不含Sal I、 Kpn I，因 此選用Sal I、 Kpiil兩個限制性內(nèi)切酶來作為插入WZ)基因的酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)正義引物帶Kpn I、反義引物帶SalI酶切位點(diǎn)的引物，以克隆載體質(zhì)粒pGEM-T-Vesad為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。 將擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pCAM2300分別用Sal I和Kpn I雙酶切。電泳后回收擴(kuò)增產(chǎn)物和 pCAMBIA2300的酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化五.co// DH 5a感受態(tài)細(xì)胞。 提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。表達(dá)載體命名為pCAM2300-sad。3、 Zeocin抗性標(biāo)記基因幼We的克隆根據(jù)pCAM2300-sad酶切位點(diǎn)特征，選擇作為幼We基因的插入位點(diǎn)，設(shè)計(jì)包含幼We基 因TEF1、 EM7雙啟動子引物，兩端含HindIII酶切位點(diǎn)，以畢赤酵母表達(dá)載體pPICZB為模板， 用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳回收目的片段，克隆到pGEMT-Easy載體上，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌E co//DH5a，測序。命名該克隆載體為pGEM-T-Z。4、 酵母表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化用HindIII分別酶切pCAM2300-sad和pGEM-T-Z，回收相應(yīng)的片段，用T4 DNA連接酶 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化五.co// DH 5a感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。表達(dá)載體命名為 pCAM2300-sad-z。本發(fā)明有益的效果1、 本發(fā)明將從千年桐種子總RNA中分離的基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pCAMBIA2300 上，為產(chǎn)油酵母油酸含量的提高提供基因轉(zhuǎn)移供體。2、 本發(fā)明根據(jù)畢赤酵母表達(dá)載體pPICZB設(shè)計(jì)引物分離了 Zeocin抗性基因S/z We，與上述重 組載體連接組成新載體，大大簡化了產(chǎn)油酵母遺傳轉(zhuǎn)化過程，對于篩選具有Zeocin抗性 的轉(zhuǎn)SAD基因的產(chǎn)油酵母具有重要作用。


圖1:千年桐sad全長cDNA的RT-PCR結(jié)果，其中M是分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000, 1為擴(kuò)增得到的目的基因片段。圖2:重組質(zhì)粒載體pCAM2300-sad酶切電泳圖，其中，2為重組質(zhì)粒，1.3.4為表達(dá)載 體酶切產(chǎn)物。圖3:重組質(zhì)粒載體pCAM2300-sad-z酶切電泳圖，其中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000， 1為 非重組質(zhì)粒，2， 3， 4為重組質(zhì)粒HindIII酶切產(chǎn)物 圖4:質(zhì)粒pCAM2300-sad-z表達(dá)載體構(gòu)建過程。
具體實(shí)施方式
通過以下實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。 1實(shí)驗(yàn)材料1.1植物材料2006年8月25日至9月10日，從中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所樹木園采取千 年桐發(fā)育中的果實(shí)，將種子剝出在液氮中速凍后一80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?1.2菌株與質(zhì)粒大腸桿菌DH5a、根癌農(nóng)桿菌EHA 105為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pCAMBIA2300為本 實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體pGEM-TEasy購自Promega公司。 1.3主要生化試劑RNA提取試劑盒購自天澤基因工程有限公司(四川綿陽)；cDNA合成試劑盒、IPTG、 X-gal、購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠純化回收試劑盒購 自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司；高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase、大腸桿菌￡.co//DH5a感受態(tài)細(xì)胞、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶￡coR I、 5awHI、 ^>a/I、 Sa/I、尺/wI均購自寶生物工程(大連)有限公司。引物合成及菌液測序分別由上海 生工生物工程技術(shù)有限公司和上海聯(lián)合基因公司完成。 2實(shí)驗(yàn)方法2.1千年桐發(fā)育中種子總RNA提取(1) 液氮研磨破碎細(xì)胞，取約100mg左右的細(xì)粉至新離心管中；(2) 加入1 mL溶液A振蕩混合30 s;(3) 加入0.3mL溶液B和0.2mL氯仿，振蕩混勻；(4) 室溫離心13000 g, 5min，取上清(約0.8mL)移至新離心管中；(5) 加入0.5mL溶液C和0.2mL氯仿，振蕩混勻；(6) 室溫離心13000 g， 3min，取上清(約950mL)移至新管中；(7) 力tU/2體積的溶液D，振蕩混勻；(8) 室溫離心13000 g， 5min，形成白色沉淀；(9) 加1 mL75X乙醇振蕩混勻，離心13000 g, 3 min，棄上清；(10) 重復(fù)步驟9，吹干后溶于30uLDEPC處理的純水中。(11) 取2 uL在1.0%的瓊脂糖凝膠中快速電泳檢測總RNA的完整性。于一8(TC保存待用。 2.2反轉(zhuǎn)錄運(yùn)用(上海生工)AMV第一鏈cDNA合成試劑盒，以總RNA為模板，合成cDNA第一 鏈。具體方法如下 (1)冰浴中加總RNA 3 uL下游特異性引物 luL 無RNA酶去離子水 3 uL總體積 7uL(2) 混勻離心3 5s， 70。C5min，冰浴30 s(3) 冰浴加入5 x Reaction Buffer 4 uLRNA酶抑制劑(20U/ uL) 1 uL dNTP(10mM) 2 uL(4) 混勻離心，37。C5min，加入1 uLM-MLV RT(20 U/uL)，混勻。(5) 37°C 60min;最后70。C保溫10min。 2.3 PCR擴(kuò)增基因cDNA編碼區(qū)全長根據(jù)在GenBank上登錄的基因核苷酸和氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物，引物序列如下K，d F1: AAC AAT ggC麗T NA A gNT C A A Rl: TgC ACT NAN AgC TNC ACT TCT其中N為A、 T、 C、 G為四堿基兼并。以2.2合成的cDNA為模板，以KradFl、 Rl為引物，PCR擴(kuò)增千年桐S^D基因cDNA編碼區(qū)。擴(kuò)增條件為94'C預(yù)變性4 min， 94'C30S、 58。C30S、 72。Clmin， 30個循環(huán)，72。C延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。 結(jié)果如圖1。2.4博來霉素(Zeocin)抗性基因SA 6fe的克隆根據(jù)pCAM2300酶切位點(diǎn)特征，即含有HindIII，設(shè)計(jì)包含幼6/e基因、TEF1、EM7雙啟 動子引物Zl: gCgAATTCACgCACTCAAgCTZ2: ggT CTA gAT TAC AgC TgC ACT TCT CTT T以畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ B為模板，以Z1、 Z2為引物，擴(kuò)增幼6/e基因。擴(kuò)增條件 為98。C預(yù)變性5min， 98。C10S、 57。C15S、 72。Clminl0s， 30個循環(huán)，72。C延伸7min。擴(kuò)增 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。2.5擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和測序 2.5.1 PCR產(chǎn)物的回收
將cDNA和幼We基因用B型小量DNA片斷快速膠回收試劑盒(博大泰克)進(jìn)行特 異性擴(kuò)增產(chǎn)物的回收純化，操作步驟如下
(1) 在1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，使擴(kuò)增產(chǎn)物分離形成特異帶；
(2) 切下目的條帶置離心管中；
(3) 加700uL溶膠液，55。C溶膠，其間偶爾搖動；裝柱，12000 rpm，離心30 s;去掉廢
液；
(4) 加入500uL漂洗液(wash buffer)漂洗，12000 rpm離心30 s。重復(fù)漂洗一次。倒掉 廢液后再于12000 rpm離心2 min;
(5) 加入45uL的洗脫緩沖液(Elutionbuffer)或水，室溫放置2min， 12000rpm離心。 管底溶液即為回收的目的片斷。
2.5.2回收產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化
回收產(chǎn)物連接到pGEM T-Easy載體上，按照Promega公司pGEM-T Easy連接試劑盒說 明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)化按照寶生物￡ co// DH 5a感受態(tài)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行。
(1) 將回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-TEasy載體上，在離心管中分別加入下列成分 回收產(chǎn)物4uL; T載體luL; 2xT4 Buffer 5 uL; T4 DNA連接酶(3 U/uL) 1 uL;輕輕混勻后 離心收集到管底，16'C過夜連接。
(2) 從一80。C冰箱中取100uL感受態(tài)細(xì)胞，室溫下解凍后立即置冰上；
(3) 加入5 uL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30 min;
(4) 42。C水浴熱擊90 s，迅速置于冰上冷卻3 5 min;
(5) 向管中加入lmLLB液體培養(yǎng)基(不含Amp)，混勻后37'C振蕩培養(yǎng)1 h,使菌恢復(fù) 正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Amp');
(6) 將上述菌液搖勻后取200 uL加入40 uL X-gal及4 uL IPTG混合均勻，涂布于含Amp 的篩選平板上。37'C倒置過夜培養(yǎng)。
(7) 白色菌落為重組子。 2.5.3質(zhì)粒DNA提取
將5 mL含Amp (50 mg/L) LB液體培養(yǎng)基加入到50mL小三角瓶中，挑取白色單菌落 37^振蕩過夜。質(zhì)粒提取按照博大泰克公司試劑盒描述的方法進(jìn)行。
(1)取l-3mL在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的菌液，12000 rpm離心30 s，棄盡上清。
8(2) 用250 uL己加入RNaseA的溶液I均勻懸浮細(xì)菌沉淀，室溫放置5 min;
(3) 加入250uL溶液I1，溫和上下翻轉(zhuǎn)4-6次混勻，使菌體充分裂解；
(4) 加入350 uL溶液III，上下翻轉(zhuǎn)6-8次混勻，12000 rpm離心10 min;
(5) 吸取離心上清并轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，12000 rpm離心1 min;
(6) 將制備管放回離心管，加入500 uL的Buffer Wl ， 12000 rpm離心1 min;棄濾液；
(7) 將制備管放回離心管，加入700 uL的Buffer W2, 12000 rpm離心1 min;棄濾液； 重復(fù)洗滌一次。
(8) 將制備管移入新的離心管中，在膜正中央加40-60uL水，室溫靜置lmin; 12000rpm 離心1 min。將收獲的重組質(zhì)粒于-20'C保存。
2.5.4質(zhì)粒的酶切鑒定及測序
根據(jù)pGEMT-Easy載體的圖譜，選用￡coR I限制性內(nèi)切酶對提取的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。將酶 切鑒定的陽性克隆對應(yīng)的菌液，送往上海聯(lián)合基因集團(tuán)公司聯(lián)眾基因科技研究院測序部進(jìn)行 測序。命名該載體為pGEM-T-Vesad，全長4206bp，其特征在于所含SAD基因可作為構(gòu)建其 它表達(dá)載體的供體，在添加Amp的液體LB培養(yǎng)基中繁殖含該載體的大腸桿菌②/f DH 5a 然后提取質(zhì)粒就能大量生產(chǎn)該載體。 2.6含5L4Z)基因的表達(dá)載體構(gòu)建
根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，結(jié)合表達(dá)載體pCAMBIA2300的限制性酶切位點(diǎn)圖譜， 選用Sal I、 Kpn I兩個位置來作為插入目的片段的酶切位點(diǎn)。
設(shè)計(jì)帶Sa/1、尺/wI酶切位點(diǎn)的引物
r證d F2: gAT gTC gAC ATg NCN NTC AAg NT
船ac R2: gAC ggT ACC TNA NAg CTN CAN TT
以克隆載體質(zhì)粒pGEM-T-Vesad為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。將擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pCAM2300 一起均用Sal I和Kpn I雙酶切。分別回收相應(yīng)的片段，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化 co//DH 5a感受態(tài)細(xì)胞。將菌液涂布在含Kan的LB平板上，37'C倒置培養(yǎng)過夜。堿法提取 質(zhì)粒DNA，雙酶切質(zhì)粒來驗(yàn)證目的片段插入是否正確，結(jié)果如圖2。表達(dá)載體命名為 pCAM2300-sad，全長9933bp，其特征在于所含基因能在植物、真菌中表達(dá)，在添加Kan 的液體LB培養(yǎng)基中繁殖含該載體的大腸桿菌DH 5a然后提取質(zhì)粒就能大量生產(chǎn)該載 體。
2.7含&4D、幼6fe雙基因的酵母表達(dá)載體構(gòu)建
根據(jù)pCAM2300-sad上的限制性酶切位點(diǎn)圖譜，選用HindIII作為插入片段的酶切位點(diǎn)。以pPICZ B為模板擴(kuò)增的幼We基因兩端已包含HindIII酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增產(chǎn)物與 pCAM2300-sad—起用HindIII酶切，分別回收相應(yīng)的片段，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn) 化￡ co/i DH 5a感受態(tài)細(xì)胞。將菌液涂布在含相應(yīng)抗生素的LB平板上，37'C倒置培養(yǎng)過夜。 提取質(zhì)粒，由于幼We基因自帶TEFl、 EM7雙啟動子及CYC1終止子，因此不用驗(yàn)證其插 入方向，直接用HindIII酶切，結(jié)果如圖3。表達(dá)載體命名為pCAM2300-sad-z。該載體全長 11122bp，其特征在于所含&4￡>基因能在植物、真菌中表達(dá)，在添加Zeodn的液體LB培養(yǎng) 基中繁殖含該載體的大腸桿菌co// DH 5(x然后提取質(zhì)粒就能大量生產(chǎn)該載體。
除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技 術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種用Zeocin篩選千年桐SAD基因的產(chǎn)油酵母表達(dá)載體，其特征在于該載體以pCAMBIA2300為基本骨架，產(chǎn)油酵母表達(dá)載體含有千年桐SAD基因。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的用Zeocin篩選千年桐&4D基因的產(chǎn)油酵母表達(dá)載體，其特征 在于所述產(chǎn)油酵母表達(dá)載體同時含有幼We基因。
3、 一種構(gòu)建如權(quán)利要求1所一種用Zeocin篩選千年桐5L4"基因的產(chǎn)油酵母表達(dá)載體的方法，其特征在于該方法包括步驟如下(1) 千年桐基因cDNA編碼區(qū)全長序列獲得根據(jù)在GenBank上登錄的基因核苷酸和氨基酸序列設(shè)計(jì)兼并引物，以千年桐種子總 RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，獲得&4D全長cDNA,電泳回收目的片段，克隆到pGEM T-Easy 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，測序，命名該載體為pGEM-T-Vesad;(2) S4I)正義表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，結(jié)合表達(dá)載體pCAMBIA2300的限制性酶切位點(diǎn)圖譜， 選用SalI、 Kpnl兩個位置來作為插入目的片段的酶切位點(diǎn)；設(shè)計(jì)帶& /1、《p"I酶切位點(diǎn)的 引物，以克隆載體質(zhì)粒pGEM-T-Vesad為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；將擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體 pCAM2300 —起均用Sal I和Kpn I雙酶切；分別回收相應(yīng)的片段，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連 接，轉(zhuǎn)化co/i DH 5a感受態(tài)細(xì)胞；提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，表達(dá)載體命名為pCAM2300-sad;(3) 博來霉素(Zeocin)抗性標(biāo)記基因幼We的克隆根據(jù)pCAM2300-sad酶切位點(diǎn)特征，選擇作為S/ We基因的插入位點(diǎn)，設(shè)計(jì)包含幼We基 因TEF1、 EM7雙啟動子引物，兩端含HindIII酶切位點(diǎn)，以畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ B為模板， 用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳回收目的片段，克隆到pGEMT-Easy載體上，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌五.co"DH5a，測序，命名該克隆載體為pGEM-T-Z;(4) 酵母表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化用HindIII分別酶切pCAM2300-sad和pGEM-T-Z，回收相應(yīng)的片段，用T4 DNA連接酶 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH 5 a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，表達(dá)載體命名為 pCAM2300-sad-z。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及一種用Zeocin篩選千年桐SAD基因的產(chǎn)油酵母表達(dá)載體，該載體以pCAMBIA2300為基本骨架，產(chǎn)油酵母表達(dá)載體含有千年桐SAD基因，或同時含有Sh ble基因；其構(gòu)建方法步驟如下1.千年桐SAD基因cDNA編碼區(qū)全長序列獲得；2.SAD正義表達(dá)載體構(gòu)建；3.Zeocin抗性標(biāo)記基因Sh ble的克隆；4、酵母表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。本發(fā)明有益的效果本發(fā)明將從千年桐種子總RNA中分離的SAD基因構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pCAMBIA2300上，為產(chǎn)油酵母油酸含量的提高提供基因轉(zhuǎn)移供體。本發(fā)明根據(jù)畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ B設(shè)計(jì)引物分離了Zeocin抗性基因Sh ble，與上述重組載體連接組成新載體，大大簡化了產(chǎn)油酵母遺傳轉(zhuǎn)化過程，對于篩選具有Zeocin抗性的轉(zhuǎn)SAD基因的產(chǎn)油酵母具有重要作用。
文檔編號C12N15/81GK101665802SQ20091015286
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者李紀(jì)元, 李辛雷, 敏 田, 范妙華, 范正琪, 陳東亮 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所