專利名稱：一種新的納豆激酶制備方法
技術領域：
本發(fā)明提供了一種新的納豆激酶制備方法，涉及微生物發(fā)酵法產納豆激酶。
背景技術：
1987年，日本的Sumi等首先在日本傳統(tǒng)食品納豆中發(fā)現(xiàn)并且提取出具有溶解血 栓功能的活性物質——納豆激酶(nattokinase，NK)。它是目前發(fā)現(xiàn)的近200種具有口服 溶纖作用物質中最具潛力的溶纖蛋白酶。近年來，國內外掀起了納豆激酶的研究和開發(fā)熱 潮。日本、韓國、朝鮮等多個國家已開始積極開發(fā)納豆激酶產品。根據(jù)WHO公布的統(tǒng)計數(shù)字，全世界現(xiàn)在患有各種血栓性疾病的患者有1500萬之 多，其中每年約有300萬患者死亡，同時，這種狀況向低齡化發(fā)展。所需的溶栓劑的潛在市 場約20億美元。目前臨床注射的抗血栓藥物普遍存在著穩(wěn)定性差、藥效短、副作用大和成 本高等缺點，因此，國內外在治療血栓病方面正趨向于低價高效、易吸收、體內半衰期長以 及可以口服的藥物或保健食品的研究。納豆激酶來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，生產工藝簡單，無副 作用，安全性高，完全符合治療血栓病的藥品或食品基料的要求，因此有著很好的應用前景 和廣闊的市場。目前大多數(shù)公司所生產的納豆激酶產品既可作為單一制劑又可與其他成分如 S0D、DHA、維生素E、卵磷脂、銀杏提取物、蜂蠟等復合制成粉劑、片劑、軟硬膠囊或口服液，作 為功能性食品或保健品來食用，具有調節(jié)體內免疫系統(tǒng)、促進和改善血液循環(huán)以及預防心 腦血管性疾病的作用。但是目前還沒有關于臨床注射用納豆激酶產品的報道，因此在提高 納豆激酶產量以及其分離純化的生產方面還有待進一步研究。我國對于納豆激酶的研究開 展的比較晚，相關產品的開發(fā)也比較少。因此，研究適宜于規(guī)模化的液體或固體發(fā)酵工藝條 件，提高納豆激酶的產量和活性，改進分離純化工藝，降低其生產成本，是目前國內迫切需 要解決的問題。本發(fā)明在傳統(tǒng)高產菌株基礎上對菌株進行了誘變篩選，得到了一株最優(yōu)菌 株。對產酶條件進行了優(yōu)化，確定了一組最優(yōu)產酶條件，該工藝從工業(yè)化角度出發(fā)，使生產 成本大大降低，工藝可操作性強，適合規(guī)模化生產。

發(fā)明內容
1. 一種新的納豆激酶制備方法，其特征包括以下幾個步驟(1)出發(fā)菌株的選擇和分離首先，從納豆中挑取表面黏液分離純化菌株，選擇固體黃豆培養(yǎng)基上產生拉絲較 長的菌落，然后通過液體發(fā)酵實驗培育后用傳統(tǒng)的纖維蛋白平板法比較發(fā)酵液的產酶能 力，挑選出一株在纖維蛋白平板上產生溶菌圈最大的一株作為出發(fā)菌株。(2)菌懸液制備將出發(fā)菌株接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，轉接入液體種子培養(yǎng)基，于 37°C,200r/min振蕩培養(yǎng)12h，離心收集菌體，然后用高溫滅菌的生理鹽水洗滌3_4次后，轉 入三角瓶內振蕩，制成菌懸液。
斜面培養(yǎng)基大豆蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0. 5%，瓊脂1. 5%，pH7. 2。液體種子培養(yǎng)基大豆蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，葡萄糖1%，NaCl 0. 75%, pH 7. 2，裝液量為30mL/100mL三角瓶。(3) LiCl-紫外光照復合誘變納豆菌對紫外線非常敏感，照射1 致死率就可以達到80%，而根據(jù)育種工作者 長期的研究和時間經驗，認為較低的殺菌率更有利于正突變產生，所以將紫外線輻照時間 確定為12s。菌懸液在紫外線下輻照1 后，涂布接種于濃度為0.3%的LiCl的分離平板 上。經過初篩和復篩得到一株高產菌株。(4)液體發(fā)酵培養(yǎng)復合誘變得到的菌株經過擴大培養(yǎng)后按的接種量轉接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于 34PH 7條件下放于200r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。發(fā)酵培養(yǎng)基2%麥芽糖，4%酵母膏，0.03% CaCl,0. 02% K2HPO4,0. 02% ΚΗ2Ρ04。(5)集成化分離納豆激酶納豆激酶發(fā)酵液中雜質很多，其中對提取影響最大的是高價無機離子和雜蛋白 等。采用傳統(tǒng)的分離方法需要對發(fā)酵液進行預處理，需要經過很多步驟包括離心去除菌體、 有機溶劑沉淀、離心收集沉淀、溶解沉淀、離心收集上清液和離子交換層析等，工作量巨大， 設備占用多，藥品消耗大。本發(fā)明采用離子交換型擴張床吸附劑對發(fā)酵液中的納豆激酶進 行分離純化，最后進一步用分子篩凝膠提純獲得純品納豆激酶。大大簡化了操作步驟，將低 了生產成本，同時又大大減少了環(huán)境污染。該法生產納豆激酶工藝操作比較簡單，原材料易得，菌株產酶效率高，生產過程中 無污染，適于工業(yè)化生產。
權利要求
1.一種新的納豆激酶制備方法，其特征包括以下幾個步驟(1)出發(fā)菌株的選擇和分離首先，從納豆中挑取表面黏液分離純化菌株，選擇固體培養(yǎng)基上產生拉絲較長的菌落， 然后通過液體發(fā)酵實驗培育后用傳統(tǒng)的纖維蛋白平板法比較發(fā)酵液的產酶能力，挑選出一 株在纖維蛋白平板上產生溶菌圈最大的一株作為出發(fā)菌株。(2)菌懸液制備將出發(fā)菌株接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，轉接入液體種子培養(yǎng)基，于37°C、 200r/min振蕩培養(yǎng)12h，離心收集菌體，然后用高溫滅菌的生理鹽水洗滌3_4次后，轉入三 角瓶內振蕩，制成菌懸液。(3)LiCl-紫外光照復合誘變納豆菌對紫外線非常敏感，照射1 致死率就可以達到80%，而根據(jù)育種工作者長期 的研究和時間經驗，認為較低的殺菌率更有利于正突變產生，所以將紫外線輻照時間確定 為12s。菌懸液在紫外線下輻照1 后，涂布接種于濃度為0.3%的LiCl的分離平板上。經 過初篩和復篩得到一株高產菌株。(4)液體發(fā)酵培養(yǎng)復合誘變得到的菌株經過擴大培養(yǎng)后按的接種量轉接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于 34PH 7條件下放于200r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。(5)集成化分離納豆激酶納豆激酶發(fā)酵液中雜質很多，其中對提取影響最大的是高價無機離子和雜蛋白等。采 用傳統(tǒng)的分離方法需要對發(fā)酵液進行預處理，需要經過很多步驟包括離心去除菌體、有機 溶劑沉淀、離心收集沉淀、溶解沉淀、離心收集上清液和離子交換層析等，工作量巨大，設備 占用多，藥品消耗大。本發(fā)明采用離子交換型擴張床吸附劑對發(fā)酵液中的納豆激酶進行分 離純化，最后進一步用分子篩凝膠提純獲得純品納豆激酶。大大簡化了操作步驟，將低了生 產成本，同時又大大減少了環(huán)境污染。
2.如權利要求(1)所訴，其特征在于所選擇的固體培養(yǎng)基為黃豆培養(yǎng)基。
3.如權利要求(2)所訴，其特征在于斜面培養(yǎng)基為蛋白胨-牛肉膏培養(yǎng)基，其配比為大 豆蛋白胨 1%，牛肉膏 0. 5%, NaCl 0. 5%，瓊脂 1. 5%, pH7. 2。
4.如權利要求(2)所訴，其特征在于液體種子培養(yǎng)基為大豆蛋白胨1%，牛肉膏 0. 5%，葡萄糖 1%，NaCl 0. 75%, pH 7. 2，裝液量為 30mL/100mL 三角瓶。
5.如權利要求(3)所訴，其特征在于采用LiCl-紫外光照復合誘變法處理菌懸懸液。
6.如權利要求(4)所訴，其特征在于使用麥芽糖-酵母膏培養(yǎng)基，其配方為2%麥芽 糖，4%酵母膏，0. 03% CaCl,0. 02% K2HPO4,0. 02% KH2PO4。
7.如權利要求(5)所訴，其特征在于采用離子交換型擴張床吸附劑分離純化納豆激 酶，減少了發(fā)酵液預處理過程，簡化了生產工藝。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的納豆激酶的生產方法，其步驟包括選擇和分離出發(fā)菌株后將出發(fā)菌株接種于斜面培養(yǎng)基，然后制備菌懸液。菌懸液經過LiCl-紫外光照復合誘變，初篩和復篩后選育得到一株產納豆激酶優(yōu)良菌株。該菌株經過放大培養(yǎng)后接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件接種量1％于2％麥芽糖，4％酵母膏，0.03％CaCl，0.02％K2HPO4，0.02％KH2PO4培養(yǎng)基，然后在34℃，pH7條件下放于200r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。最后，通過離子交換型擴張床吸附劑對發(fā)酵液中的納豆激酶進行分離純化，進一步用分子篩凝膠提純獲得純品納豆激酶。該法生產納豆激酶工藝操作比較簡單，原材料易得，菌株產酶效率高，生產過程中無污染，適于工業(yè)化生產。
文檔編號C12N9/54GK102071182SQ20091015463
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月23日 優(yōu)先權日2009年11月23日
發(fā)明者史利斌, 吳菁 申請人:湖州來色生物基因工程有限公司