專利名稱：一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種新的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的制備方法，涉及微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨 酰胺轉(zhuǎn)氨酶。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminas縮寫TG)是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶， 它可使酪蛋白、肌球蛋白和乳球蛋白等蛋白質(zhì)分子之間產(chǎn)生交聯(lián)，從而改變食品蛋白質(zhì)的 功能性質(zhì)，因此在食品加工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。各氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的生產(chǎn)通常采用從豚鼠 肝臟或組織中提取，由于豚鼠肝臟或組織來(lái)豫稀少，替氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的分離純化過(guò)程復(fù)雜， 因而價(jià)格昂貴。1989年日本味之素公司從土壤中篩選到1株命名為Mi^ptoverticillium S-1182的菌株，它可產(chǎn)生胞外谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，并投放市場(chǎng)，其產(chǎn)值迅速增加，成為單一酶 種類中利潤(rùn)最高的商品酶，獲得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶由于其卓越的交聯(lián)特 性，被譽(yù)為“21世紀(jì)超級(jí)粘合劑”，在食品、醫(yī)藥、紡織、化妝品等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛前景。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶有多種來(lái)源，它廣泛存在于自然界中生物中，自1957年克拉克等 人在豚鼠肝臟中首次發(fā)現(xiàn)TGase以來(lái)，研究者陸續(xù)在魚、鳥等動(dòng)物以及微生物和植物生物 中發(fā)現(xiàn)了 TGase。迄今為止.研究最為深入的是來(lái)自動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物中的TGase，它 幾乎存在于哺乳動(dòng)物的所有的組織和器官中。1987年Icekson和Apelbaum在豌豆中發(fā)現(xiàn) 了 TGase的活性。隨后研究者存菊芋、馬鈴薯、玉米等多種植物不同組織(細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞壁、 葉綠體和線粒體)中發(fā)現(xiàn)了該酶的存存。但是目前制取提取TGase分離純化工藝復(fù)雜，酶 的得率較低，尚未有植物來(lái)源TCase用于商業(yè)化生產(chǎn)。1989年，Ando等從茂原鏈輪絲菌Sti^ptomyces mobaraerhsis中首次分離得到 了微生物來(lái)源的TCase該酶分子量為37. 9kD，由331個(gè)氨基酸組成，活性中心含有一個(gè)半 胱氨酸殘基，活性不依賴鈣離子。隨后，研究者在多種微生物中發(fā)現(xiàn)了 TCase的存在，并且 進(jìn)行了發(fā)酵工藝優(yōu)化、酶純化、基因丁程表達(dá)等大量相關(guān)研究，取得了可喜的進(jìn)展。目前，國(guó) 內(nèi)對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的研究主要在發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶的應(yīng)用方面，尚處于起步階段；而 對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的補(bǔ)料發(fā)酵研究更是不多。補(bǔ)料分批發(fā)酵作為一種發(fā)酵控制手段，對(duì)于 發(fā)酵產(chǎn)物的獲得具有十分重要的意義。本發(fā)明采用分批補(bǔ)料發(fā)酵同時(shí)分階段控制溫度的方 式，分批補(bǔ)料發(fā)酵相比于分批發(fā)酵可降低發(fā)酵液中底物濃度，發(fā)酵液粘度，提高菌體對(duì)氧和 營(yíng)養(yǎng)濃度的利用率，可以解除底物的抑制、產(chǎn)物反饋抑制和分解阻遏效應(yīng)，從而更有利于目 的產(chǎn)物的生成，達(dá)到較大幅度提高產(chǎn)量的目的。同時(shí)采用變溫法，可以大大縮短發(fā)酵前期細(xì) 胞生長(zhǎng)延滯期，加快生長(zhǎng)速率，酶活力最高可以提高14%，發(fā)酵周期縮短他。

發(fā)明內(nèi)容
一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶制備方法，其特征包括以下幾個(gè)步驟(1)菌種選擇選擇了一株產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)基因菌株，該菌株是通過(guò)將來(lái)自茂原鏈霉菌產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因克隆分離后，構(gòu)成該基因原核表達(dá)載體，并通過(guò)輪枝鏈霉菌表達(dá)。利用該 菌株產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可顯著提高產(chǎn)酶活力，酶活力可比原始菌株提高1. 3倍左右。(2)菌種培育將斜面培養(yǎng)基上的菌種以4%的接種量接入種子培養(yǎng)基，于30°C，210r/min培養(yǎng) 24h。斜面培養(yǎng)基高氏培養(yǎng)基(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)以8%的接種量，將種子培養(yǎng)基菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于32°C，210r/min培養(yǎng)18h， 降低溫度至^°C，培養(yǎng)Mh。發(fā)酵培養(yǎng)基甘油20g/L，蛋白胨 g/L，酵母膏 5g/L，MgS042g/L，K2HP042g/L，PH7. 0。該過(guò)程采用分段控制溫度法，在發(fā)酵前期采用較高溫度，可以縮短細(xì)胞生長(zhǎng)的延 滯期，減少總的發(fā)酵時(shí)間，并且可以提高細(xì)胞產(chǎn)率，提高糖的利用率。在發(fā)酵中后期采用較 低的溫度)，可以使酶的比合成速率保持相對(duì)較高的值，提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵 水平，獲得較高的生產(chǎn)強(qiáng)度。⑷補(bǔ)料發(fā)酵發(fā)酵液發(fā)酵Mh時(shí)，補(bǔ)加1. 5%甘油作為碳源，同時(shí)添加1. 5%蛋白胨作為氮源培 養(yǎng) 18h。添加1. 5%的甘油作為碳源可使酶活力提高最大，繼續(xù)提高甘油濃度反而會(huì)使酶 活力降低，因?yàn)樵诎l(fā)酵后期，甘油作為碳源只促使了菌體的生長(zhǎng)，對(duì)產(chǎn)酶影響不大。后期， 一些蛋白質(zhì)由于交聯(lián)作用使氮濃度降低，此時(shí)，適當(dāng)添加氮源可顯著提高產(chǎn)酶率，研究發(fā)現(xiàn) 24h時(shí)補(bǔ)料1. 5%蛋白胨最佳，酶活力比不補(bǔ)料提高近40%。(5)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶提取將發(fā)酵液以3000r/min離心15min，上清液為粗酶液，粗酶液經(jīng)微濾膜微濾處理，
進(jìn)一步除去細(xì)菌等雜質(zhì)，濾液再經(jīng)超濾膜處理，截留得到的產(chǎn)物再經(jīng)真空濃縮后，噴霧干燥 得到純的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。該法生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶工藝操作比較簡(jiǎn)單，原材料易得，菌株產(chǎn)酶效率高，生產(chǎn) 過(guò)程中無(wú)污染，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶制備方法，其特征包括以下幾個(gè)步驟(1)菌種選擇選擇了一株產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)基因菌株，該菌株是通過(guò)將來(lái)自茂原鏈霉菌產(chǎn)谷氨酰 胺轉(zhuǎn)氨酶基因克隆分離后，構(gòu)成該基因原核表達(dá)載體，并通過(guò)輪枝鏈霉菌表達(dá)。(2)菌種培育將斜面培養(yǎng)基上的菌種以4%的接種量接入種子培養(yǎng)基，于30°C，210r/min培養(yǎng)Mh。(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)以8%的接種量，將種子培養(yǎng)基菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于32°C，210r/min培養(yǎng)18h，降低 溫度至^°C，培養(yǎng)Mh。(4)補(bǔ)料發(fā)酵發(fā)酵液發(fā)酵Mh時(shí)，補(bǔ)加1. 5%甘油作為碳源，同時(shí)添加1. 5%蛋白胨作為氮源培養(yǎng)18h。(5)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶提取將發(fā)酵液以4000r/min離心20min，上清液為粗酶液，粗酶液經(jīng)微濾膜微濾處理，進(jìn)一 步除去細(xì)菌等雜質(zhì)，濾液再經(jīng)超濾膜處理，截留得到的產(chǎn)物再經(jīng)真空濃縮后，噴霧干燥得到 純的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。
2.如權(quán)利要求(1)所訴，其特征在于菌株采用產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因重組菌株，酶活 力可比原始菌株提高1. 3倍左右。
3.如權(quán)利要求(2)所訴，其特征在于斜面培養(yǎng)基為高氏培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求(3)所訴，其特征在于其種子培養(yǎng)基為甘油-蛋白胨培養(yǎng)基，其配方為 甘油 20g/L，蛋白胨 g/L，酵母膏 5g/L，MgSO4 2g/L, K2HPO4 2g/L，PH7.0。如權(quán)利要求(3)所 訴，其特征在于采用分段控制溫度法，在發(fā)酵前期采用較高溫度，可以縮短細(xì)胞生長(zhǎng)的延滯 期，減少總的發(fā)酵時(shí)間，并且可以提高細(xì)胞產(chǎn)率，提高糖的利用率。在發(fā)酵中后期采用較低 的溫度)，可以使酶的比合成速率保持相對(duì)較高的值，提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵水 平，獲得較高的生產(chǎn)強(qiáng)度。
5.如權(quán)利要求(4)所訴，其特征在于補(bǔ)料時(shí)3個(gè)參量的選擇，碳源選擇1.5%的甘油， 氮源選擇1.5%的蛋白胨，補(bǔ)料時(shí)間選擇Mh，此時(shí)產(chǎn)酶活力達(dá)到最高值。
6.如權(quán)利要求( 所訴，其特征在于所用超濾膜為W1-6KD，其膜通量為400，分子截留 量6000，最低截留率達(dá)到95%，能100%截留谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，達(dá)到分離純化的目的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶制備方法，其步驟包括首先選擇一株高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)基因菌株，經(jīng)過(guò)放大培養(yǎng)后接種4％量于種子培養(yǎng)基，30℃，210r/min培養(yǎng)24h后按8％接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中采用分批補(bǔ)料發(fā)酵法培養(yǎng)，有效地解決了發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)物抑制作用和蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)等，還通過(guò)變溫法縮短細(xì)胞生長(zhǎng)延滯期，減少總發(fā)酵時(shí)間提高糖的利用率和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵水平。最后，采用超濾-真空濃縮法分離和純化谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，通過(guò)該法制得的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活力高，產(chǎn)率高，操作比較簡(jiǎn)便，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/76GK102071175SQ20091015464
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日
發(fā)明者史利斌, 吳菁 申請(qǐng)人:湖州來(lái)色生物基因工程有限公司