專利名稱：一種新型堿性脂肪酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種新型堿性脂肪酶的制備方法，屬于生物酶工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脂肪酶(Lipase，甘油酯水解酶)是一類分解和合成脂肪的酶，脂肪酶廣泛存在于 許多動植物及微生物中，它不僅可以催化酯水解反應(yīng)還可以催化酯合成反應(yīng)和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。 脂肪酶廣泛存在于許多動植物及微生物中，主要應(yīng)用于食品加工及食品風(fēng)味改良、油脂工 業(yè)、皮革絹紡原料脫脂、洗滌工業(yè)等方面，是一種應(yīng)用廣泛的工業(yè)用酶。自20世紀(jì)80年代以來，堿性脂肪酶因水解脂肪具有高效、反應(yīng)條件溫和、無毒 等優(yōu)點，引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛興趣。國外研究的堿性脂肪酶產(chǎn)生菌主要有假單胞菌、 芽孢桿菌、無色桿菌、不動桿菌、毛霉、圓弧青霉、假絲酵母等。目前，外國學(xué)者已經(jīng)搞清了 Pseudomonas fIuoreseens和Penicilllum camembeilii等菌株的堿性脂肪酶的結(jié)構(gòu)和作 用位置的特異性。成功克隆到類產(chǎn)堿假單胞菌I^seu-domonas pseudocdeligemes)、司徒芘 丘假單胞菌(Pseudomonas stutzer)、醋酸 丐不云力桿菌(Aeinetobatex ealeoaeef ieus)等 菌株的堿性脂肪酶基因，并將高產(chǎn)菌株如米赫毛霉(Mueormiehe)等菌株的堿性脂肪酶基 因克隆到適合發(fā)酵的菌株中，大大提高了脂肪酶產(chǎn)量，如今堿性脂肪酶已大量應(yīng)用于工業(yè) 化生產(chǎn)。我國于20世紀(jì)60年代才開始微生物脂肪酶的研究，起步較晚，與國外脂肪酶的研 究存在一定的差距。研究主要集中在脂肪酶的結(jié)構(gòu)鑒定、菌種篩選、酶工程及基因克隆等方 面。由于堿性脂肪酶結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的多樣性、酶的不穩(wěn)定性、底物的水不溶性、提純困難等因 素導(dǎo)致堿性脂肪酶的研究進(jìn)展比較慢，而且國內(nèi)研究的產(chǎn)堿性脂肪酶菌株的種類較少，主 要有醋酸鈣不動桿菌、類產(chǎn)堿假單胞菌、白地霉、青霉等。由于應(yīng)用的需要，菌種及酶種的選 擇也不斷擴(kuò)大，盡量獲得產(chǎn)酶能力高、容易培養(yǎng)管理、產(chǎn)酶性能穩(wěn)定、不產(chǎn)有害物質(zhì)、安全可 靠的菌株，以及能耐酸、耐堿、耐高溫的特殊酶種。因此篩選具有新特性、高活力的堿性脂肪 酶生產(chǎn)菌株對于堿性脂肪酶的深入研究和廣泛應(yīng)用有重要意義。本發(fā)明是從含油的土壤 中分離得到堿性脂肪酶菌株，經(jīng)過初篩和復(fù)篩和紫外誘變，獲得了一株高產(chǎn)脂肪酶菌株，經(jīng) 過種子培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)酵得到堿性脂肪酶液，酶液經(jīng)過硫酸銨鹽析、疏水層 析、陰離子交換層析，得到純度和酶活高的堿性脂肪酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種堿性脂肪酶的制備方法。本發(fā)明所說的堿性脂肪酶的制備方法，是從含油的土壤中分離得到堿性脂肪酶菌 株，經(jīng)過初篩和復(fù)篩和誘變，獲得了一株高產(chǎn)脂肪酶菌株，經(jīng)過種子培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基 培養(yǎng)，發(fā)酵得到堿性脂肪酶液，酶液經(jīng)過硫酸銨鹽析、疏水層析、陰離子交換層析，最后經(jīng)凝 膠過濾得到純度和酶活高的堿性脂肪酶。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下
(1)產(chǎn)酶菌株的來源、初篩和復(fù)篩將采自含油土壤中的樣品加入富集培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，然后后取少量培養(yǎng)液加 入新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，如此重復(fù)3次后，進(jìn)行平板分離.將富集培養(yǎng)液用無菌水梯度稀釋至10_3，取稀釋液0. Iml于分離平板中，用涂布器 連涂三塊板，并標(biāo)記。將涂布好的平板，在培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。挑選出較大藍(lán)色圈的單菌落， 進(jìn)行編號，接種于斜面培養(yǎng)基。從分離后的斜面上分別接菌于初篩發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床中培養(yǎng)，測酶活。再將初篩得 到的優(yōu)良菌株接于復(fù)篩培養(yǎng)基的搖瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)，測酶活。(2)誘變?nèi)?fù)篩得到的稀釋分散菌液置于無菌培養(yǎng)基中，用紫外燈誘變處理，然后將菌液 涂布于平板培養(yǎng)，挑選透明圈大的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，獲得了一株高產(chǎn)脂肪酶菌株。(3)堿性脂肪酶的生成將誘變得到的高產(chǎn)酶菌株接入平板培養(yǎng)基，得到出發(fā)菌株，再將出發(fā)菌株接入種 子培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)得到的種子菌株轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)，得到堿性脂肪酶粗酶液。(4)堿性脂肪酶的分離純化離心上清液加硫酸銨，靜置，離心收集蛋白質(zhì)沉淀，將溶于少量水中，用Tris-HCl 緩沖液透析過夜。然后將透析液上樣到已預(yù)平衡的苯基-S印har0SeCL-4B層析柱 (Dl. IcmX 30cm)上，用同一緩沖液洗滌，再用含乙醇和甘油的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行洗脫， 收集活性組分。將收集的活性組分在透析袋中濃縮后，用甘氨酸緩沖液透析，上樣到已預(yù)平 衡的DEAE Sepharose fast flow層析柱(Dl. IcmX 20cm)上，以含NaCl的同一緩沖液進(jìn)行 梯度洗脫。將經(jīng)DEAE Sepharosefast flow柱層析得到的高純度脂肪酶冷凍干燥后，即得 到堿性脂肪酶。本發(fā)明采用從含油土壤中篩選得到的產(chǎn)堿性脂肪酶菌株經(jīng)過紫外線誘變，獲得了 高產(chǎn)酶菌株，再經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)得到粗堿性脂肪酶液。粗酶液經(jīng)過硫酸銨鹽析、疏水層析、陰離 子交換層析，最后經(jīng)凝膠過濾得到純度和酶活高的堿性脂肪酶。該發(fā)明從土壤中獲得了一 種新型的產(chǎn)堿性脂肪酶菌株，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)獲得了高純度和酶活的堿性脂肪酶，為堿性脂 肪酶的進(jìn)一步研究和開發(fā)生產(chǎn)提供了新的途徑。
權(quán)利要求
1.一種堿性脂肪酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)產(chǎn)酶菌株的來源、初篩和復(fù)篩將采自含油土壤中的樣品加入富集培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，然后后取少量培養(yǎng)液加入新 鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，如此重復(fù)3次后，進(jìn)行平板分離.將富集培養(yǎng)液用無菌水梯度稀釋至10_3，取稀釋液0. Iml于分離平板中，用涂布器連涂 三塊板，并標(biāo)記。將涂布好的平板，在培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。挑選出較大藍(lán)色圈的單菌落，進(jìn)行 編號，接種于斜面培養(yǎng)基。從分離后的斜面上分別接菌于初篩發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床中培養(yǎng)，測酶活。再將初篩得到的 優(yōu)良菌株接于復(fù)篩培養(yǎng)基的搖瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)，測酶活。(2)誘變?nèi)?fù)篩得到的稀釋分散菌液置于無菌培養(yǎng)基中，用紫外燈誘變處理，然后將菌液涂布 于平板培養(yǎng)，挑選透明圈大的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，獲得了一株高產(chǎn)脂肪酶菌株。(3)堿性脂肪酶的生成將誘變得到的高產(chǎn)酶菌株接入平板培養(yǎng)基，得到出發(fā)菌株，再將出發(fā)菌株接入種子培 養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)得到的種子菌株轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)，得到堿性脂肪酶粗酶液。(4)堿性脂肪酶的分離純化離心上清液加硫酸銨，靜置，離心收集蛋白質(zhì)沉淀，將溶于少量水中，用Tris-HCl 緩沖液透析過夜。然后將透析液上樣到已預(yù)平衡的苯基-S印har0SeCL-4B層析柱(D1.IcmX 30cm)上，用同一緩沖液洗滌，再用含乙醇和甘油的Tris-HCL緩沖液進(jìn)行洗脫，收 集活性組分。將收集的活性組分在透析袋中濃縮后，用甘氨酸緩沖液透析，上樣到已預(yù)平衡 的DEAE Sepharose fast flow層析柱(Dl. IcmX 20cm)上，以含NaCl的同一緩沖液進(jìn)行梯 度洗脫。將經(jīng)DEAE Sepharosefast flow柱層析得到的高純度脂肪酶冷凍干燥后，即得到 堿性脂肪酶。
2.根據(jù)權(quán)利(1)中所述的產(chǎn)酶菌株的來源、初篩和復(fù)篩，其特征在于富集培養(yǎng)基酵 母膏 0. 02%, Na2HPO4 0. 35%, KH2PO4 0. 15%, MgSO4. 7H20 0. 05%, NaCl 0. 05%，橄欖油 1.0% ；震蕩培養(yǎng)條件為^°C，180r/min，培養(yǎng)時間為3d ；平板篩選培養(yǎng)基牛肉膏0. 5%, 蛋白胨 1.0%，NaCl 0. 5%，葡萄糖 0. 3%，瓊脂粉 1. 5%，Tween80 0.5%. PVA 1.0%，橄 欖油2. 5% ；平板培養(yǎng)溫度為25°C，時間3d ；斜面培養(yǎng)基酵母浸出粉5g/L，蛋白胨10g/L， NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，pH7. 5 ；初篩和復(fù)篩的發(fā)酵培養(yǎng)條件均為^°C，180r/min培養(yǎng)36h ； 篩選培養(yǎng)基蛋白胨 40g/L，蔗糖 20g/L，K2HP04 lg/L，MgS04. 7Hz0 0. 5g/L，大豆油 5g/L，pH 9 · 5 ο
3.根據(jù)權(quán)利O)中所述的誘變，其特征在于30W的紫外燈在距離15-30cm處照射 4-6min。
4.根據(jù)權(quán)利(3)中所述的堿性脂肪酶的生成，其特征在于種子培養(yǎng)基為葡萄糖2.0%, (NH4)2SO4 0. 5%, KH2PO4 0.1%, MgSO4. 7Η20 0. 05%，蛋白胨 2. 5%，橄欖油 1. 0% ； 種子培養(yǎng)條件為 V培養(yǎng)16-1 ；發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨2. 0 %，可溶性淀粉3. 0 %，橄欖 油 1.0%, (NH4)2SO4 0. 1%, MgSO4. 7H20 0. 075%, K2HPO4 0. 1% ；發(fā)酵培養(yǎng)條件為初始 pH 9. 0 9. 5，30°C培養(yǎng) 48h。
5.根據(jù)權(quán)利(4)中所述的堿性脂肪酶的分離純化，其特征在于硫酸銨以70%飽和度沉淀4h，以含0. 5mol/L硫酸銨的20mmol/L Tris-HCl緩沖液(PH7. 5)透析；在苯 基-S^harose CL-4B層析后，用含3 %乙醇和5 %甘油的20mmol/L iTris-HCL緩沖液 (PH7. 5)進(jìn)行洗脫；再用50mmol/L甘氨酸緩沖液(pH 8. 6)透析24h ；在DEAEkpharose fast flow層析柱上，以含NaCl的緩沖液進(jìn)行洗脫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種堿性脂肪酶的制備方法。是從含油的土壤中分離得到堿性脂肪酶菌株，經(jīng)過初篩和復(fù)篩和紫外誘變，獲得了一株高產(chǎn)脂肪酶菌株，經(jīng)過種子培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)酵得到堿性脂肪酶液，酶液經(jīng)過硫酸銨鹽析、疏水層析、陰離子交換層析后干燥得到純度和酶活高的堿性脂肪酶，為堿性脂肪酶的進(jìn)一步研究和開發(fā)生產(chǎn)提供了新的途徑。
文檔編號C12N15/01GK102071176SQ200910154648
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日
發(fā)明者吳菁 申請人:湖州來色生物基因工程有限公司