專利名稱：：多重pcr鑒定不產(chǎn)黃曲霉毒素黃曲霉的引物序列及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及多重PCR鑒定不產(chǎn)黃曲霉毒素(AFT)的黃曲霉的引物序列及方法。
背景技術(shù)：
：黃曲霉毒素(AFT)是迄今發(fā)現(xiàn)的污染農(nóng)產(chǎn)品毒性最強的一類生物毒素。黃曲霉毒素Bl毒性最強、危害最大，其毒性為氰化鉀的10倍、秕霜的68倍，被列入嚴(yán)管的特劇毒物質(zhì)。農(nóng)產(chǎn)品AFT污染嚴(yán)重影響食品安全、危害人體健康，且阻礙了食品貿(mào)易，引起慘重的經(jīng)濟損失。良好的田間管理、蟲害控制、抗性育種等策略和措施都不能從根本上解決問題。近來美國研究發(fā)現(xiàn)，利用不產(chǎn)AFT的黃曲霉(Aspergillusflavus)能有效控制農(nóng)產(chǎn)品AFT的污染問題。將高競爭力的不產(chǎn)AFT的黃曲霉菌株大面積施用于田間后，使其在自然種群的競爭中以強勁的生長優(yōu)勢來抑制產(chǎn)AFT菌株，進而可顯著降低AFT污染農(nóng)產(chǎn)品的風(fēng)險。利用薄層層析、高效液相色譜和酶聯(lián)免疫吸附等常規(guī)毒素檢測方法，都需黃曲霉菌株的長時間培養(yǎng)和毒素提取的步驟，費時費力，試驗過程為有毒操作。目前尚未見不產(chǎn)AFT的黃曲霉的PCR快速檢測方法的報道。已有研究發(fā)現(xiàn)，至少有30個基因參與或調(diào)控AFT的生物合成，這些基因中某個基因的部分片段缺失可使病菌不合成黃曲霉毒素。根據(jù)幾個毒素合成相關(guān)基因建立不產(chǎn)AFT的黃曲霉的PCR鑒定方法，為篩選高競爭力的不產(chǎn)AFT的黃曲霉生菌株提供關(guān)鍵技術(shù)，對有效防治農(nóng)產(chǎn)品AFT污染具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了多重PCR鑒定不產(chǎn)AFT的黃曲霉菌的引物序列，該4組引物特異性強，可快速檢測黃曲霉菌是否產(chǎn)生黃曲霉毒素。多重PCR鑒定不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌的引物序列，包括4組引物，第一組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO:l所述的堿基序列，第一組引物的反向引物具有序列表中SEQIDN0:2所述的堿基序列；第二組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO:3所述的堿基序列，第二組引物的反向引物具有序列表中SEQIDN0:4所述的堿基序列；第三組引物的正向引物具有序列表中SEQIDN0:5所述的堿基序列，第三組引物的反向引物具有序列表中SEQIDN0:6所述的堿基序列；第四組引物的正向引物具有序列表中SEQIDN0:7所述的堿基序列，第四組引物的反向引物具有序列表中SEQIDN0:8所述的堿基序列。黃曲霉可產(chǎn)生B1和B2兩類黃曲霉毒素，產(chǎn)毒機制非常復(fù)雜，至少有30個基因參與或調(diào)控AFT的生物合成。已有研究表明，不產(chǎn)AFT的菌株常常是由于部分AFT合成相關(guān)基因缺失所致。根據(jù)毒素合成相關(guān)基因在整個毒素合成基因簇中的位置，選擇了4個覆蓋面較全的毒素合成相關(guān)基因C3、aflT、norA和hypA(如圖l所示)。根據(jù)這4個基因的道序列，本發(fā)明設(shè)計了上述4組PCR引物，分別為C3-F/C3-R(擴增C3基因部分片段，大小為544bp)，aflT-f/aflT-R(擴增aflT基因部分片段，大小為750bp)，norA-F/norA-R(擴增norA基因部分片段，大小為399bp)和hypA-F/hypA-R(擴增hypA基因部分，片段大小為654bp)。本發(fā)明還提供了一種多重PCR鑒定不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌的方法，包括以下步驟(1)提取待測菌的DNA;(2)以待測菌的DNA為模板，使用上述四組引物進行PCR擴增；(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后用EB進行顯色；當(dāng)DNA條帶數(shù)量為0-3時，判定待測菌為不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌；當(dāng)DNA條帶數(shù)量為4時，判定待測菌可能為產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌。本發(fā)明通過在一次PCR中同時檢測這4個毒素合成相關(guān)基因的缺失情況來篩選不產(chǎn)AFT的黃曲霉菌株。本發(fā)明提供了用于鑒定不產(chǎn)AFT的黃曲霉的方法，可快速地檢測出不產(chǎn)AFT的黃曲霉，為進一步篩選高競爭力的不產(chǎn)AFT的黃曲霉生防菌株提供關(guān)鍵技術(shù)和必要前提，對有效防治農(nóng)產(chǎn)品AFT污染具有重要意義。圖1為本發(fā)明擴增的4個毒素合成相關(guān)基因在產(chǎn)毒基因簇上的位置圖譜；圖2為鑒定不產(chǎn)AFT的黃曲霉的PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜。具體實施方式所選菌株通過選擇性培養(yǎng)基YES從浙江、山東、陜西和甘肅花生田塊采集的土壤中分離得到90個黃曲霉菌株。每升YES培養(yǎng)基成分酵母提取物lg，蔗糖10g，NaCl60g，瓊脂20g，滅菌后加入CuS04ZnS04lml，O.4%氯硝胺5ml，鏈霉素100ppm。采用傳統(tǒng)的生物測定和薄層層析方法對分離到的黃曲霉菌株進行產(chǎn)AFT能力測定。根據(jù)測定結(jié)果，隨機選取6個產(chǎn)AFT的黃曲霉菌株(SDl-4、SD4-3、SD5-7、SX6-2、GS9-3和ZJ11-2)和6個不產(chǎn)AFT的黃曲霉菌株(SDl-2、SDl-3、SD2-1、SD2-5、SD3-4和SD4-4)進行多重PCR試驗。生物測定方法將分離到的黃曲霉菌株接種在含0.3%環(huán)狀糊精的YES培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)7天后，將菌落用25%氨水熏蒸3分鐘，如果菌落背面呈粉紅色，該菌株為產(chǎn)毒菌株；如果菌落背面不變色，該菌株可能是不產(chǎn)毒素菌株，需進行下一步的薄層層析檢測。薄層層析測定方法將分離到的黃曲霉菌株接種在含0.3%環(huán)狀糊精的YES培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)7天后，收集100毫克菌絲和孢子，置于1.5毫升的離心管中，并向其中加入200微升的80%甲醇；室溫下震蕩30分鐘后10，OOOg離心5分鐘，取50微升上清液點到硅膠層析板上，吹干后將薄層層析板置于展布槽內(nèi)用無水乙醚預(yù)展12厘米，取出涼干后在經(jīng)過丙酮-三氯甲烷(8:92)展開10-12厘米，然后取出層析板，365nm紫外燈下觀測，有淡藍(lán)色銀光斑點的菌株為產(chǎn)毒菌株；如果沒有淡藍(lán)色銀光斑點，說明該菌株為不產(chǎn)毒菌株。提取DNA用接種針從PDA平板上刮取菌絲(100mg)，置于l.5_mLE卯endorf管中，加500yLDNA提取裂解液(2Q0mMTris-HCl，50mMEDTA，20mMNaCl，1%SDS，pH8.0)，用電鉆充分4研磨，振蕩混勻，室溫靜止10min;13200r/min4。C，離心5min;取上清液約400yL于新的1.5-mLEppendorf管中，加750iiL無水乙醇，混和混勻，13200r/min4°C，離心5min，棄上清；沉淀用70%乙醇洗滌，室溫放置干燥5-10min，溶于30yLTE(pH8.0)，-2(TC保存?zhèn)溆?。上?株產(chǎn)AFT的黃曲霉和6株不產(chǎn)AFT的黃曲霉的DNA均采用上述方法提取。引物合成根據(jù)毒素合成相關(guān)基因C3、aflT、norA和hypA的序列，設(shè)計4組PCR引物，分別為C3-F/C3-R，af1T-f/af1T-R，norA-F/norA-R和hypA_F/hypA-R。上述引物的具體序列與序列表中序列對應(yīng)關(guān)系如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述序列的引物由上海博彩合成，也可通過常規(guī)的引物合成方法合成。黃曲霉(Aspergillusflavus)菌株鑒定以上述所有菌株的DNA為模板，同時用4組PCR引物C3_F/C3-R、aflT-F/af1T_R、norA-F/norA-R和hypA-F/hypA-R進行PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)均包含一個陰性對照(用無菌水代替DNA模板)。PCR反應(yīng)體系:1iiLDNA模板(約0.4ng)，引物各0.12iimol1—1，dNTP0.2iimol"，MgC122mmo1"，1X緩沖液(北京東勝公司生產(chǎn))，聚合酶1.5U個單位，雙蒸水補足至25iiL。PCR反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性3min，94。C變性40s，55。C退火40s，72。C延伸lmin，進行35個循環(huán)，最后72t:延伸5min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖在1XTAE緩沖液中電泳分離后，用EB顯色拍照。根據(jù)凝膠上的DNA條帶數(shù)量，判斷待測菌的類型。從電泳照片上看(如圖2所示)，菌株SDl-2給出399-bp(norA)和654-bp(hypA)兩條帶，說明毒素合成相關(guān)基因C3和afIT缺失；菌株SD2-l、SD2-5、SD3-4和SD4-4只給出一條654-bp(hypA)條帶，說明毒素合成相關(guān)基因C3、aflT和norA缺失；菌株SDl-3不能給出條帶，說明4個毒素合成相關(guān)基因都缺失；判斷菌株SDl-2、SD2-1、SD2-5、SD3_4、SD4-4和SD1-3為不產(chǎn)AFT的黃曲霉；菌株SDl-4、SD4-3、SD5_7、SX6-2、GS9-3和ZJ11-2都給出4條DNA帶，判斷為可能產(chǎn)AFT的黃曲霉。SEQUENCELISTING〈110>浙江大學(xué)〈120〉多重PCR鑒定不產(chǎn)黃曲霉毒素黃曲霉的引物序列及方法〈130〉〈160>8〈170>PatentInversion3.3<210>1〈211>21〈212>DNA〈213〉黃曲霉(Aspergillusflavus)〈400>1tctggagtcggaggttaggtt〈210>2〈211〉20〈212>DNA〈213〉黃曲霉(Aspergillusflavus)〈400>2gagc朋c3cgatcattgcat〈210>3<211>20〈212>DNA〈213〉黃曲霉(Aspergillusflavus)〈400>3tgcggacatctaacgaccat〈210>4〈211>21〈212>DNA〈213〉黃曲霉(Aspergillusflavus)〈400>4aggtcacttcgttcgtgaagg〈210>5〈211>19〈212>DNA〈213>黃曲霉(Aspergillusflavus)〈400>5ccttatgcctgggaacgat19〈210>6〈211>20〈212>DNA〈213>黃曲霉(Aspergillusflavus)〈400>6ttcgcatcacttcctccaca20<210>7〈211>20〈212>DNA〈213>黃曲霉(Aspergillusflavus)〈400>7gcatgtccgtcgtcctgata20〈210>8<211>20〈212>DNA〈213>黃曲霉(Aspergillusflavus)〈400>8cccattgatcaatctcggat權(quán)利要求多重PCR鑒定不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌的引物序列，其特征在于包括4組引物，第一組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO1所述的堿基序列，第一組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO2所述的堿基序列；第二組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO3所述的堿基序列，第二組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO4所述的堿基序列；第三組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO5所述的堿基序列，第三組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO6所述的堿基序列；第四組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO7所述的堿基序列，第四組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO8所述的堿基序列。2.—種多重PCR鑒定不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌的方法，包括以下步驟(1)提取待測菌的DNA;(2)以待測菌的DNA為模板，使用四組引物進行PCR擴增；(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后用EB進行顯色；當(dāng)DNA條帶數(shù)量為0-3時，判定待測菌為不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR擴增的反應(yīng)條件為95t:預(yù)變性3min，94。C變性40s，55。C退火40s，72。C延伸lmin，進行35個循環(huán)，最后72。C延伸5min。全文摘要本發(fā)明公開了一種多重PCR鑒定不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌的引物序列，包括四組引物，本發(fā)明還公開了一種利用四組引物進行多重PCR鑒定不產(chǎn)黃曲霉毒素的黃曲霉菌的方法，該方法通過將PCR產(chǎn)物在凝膠電泳分離后顯色，根據(jù)凝膠上條帶數(shù)目判斷黃曲霉菌是否產(chǎn)生黃曲霉毒素，為高競爭力的不產(chǎn)AFT的黃曲霉生防菌株的開發(fā)提供關(guān)鍵技術(shù)，對有效防治農(nóng)產(chǎn)品AFT污染具有重要意義。文檔編號C12Q1/68GK101701250SQ200910154898公開日2010年5月5日申請日期2009年11月26日優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日發(fā)明者嚴(yán)蕾燕,劉馨,尹燕妮,馬忠華申請人:馬忠華