專利名稱：一種用酶比色反應測定β-羥丁酸的方法及其配用的試劑盒和其用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗測定技術(shù)領域，具體涉及一種用酶比色反應測定P-羥丁酸
的方法及其配用的試劑盒和其用途。
背景技術(shù)：
目前血清|3 -羥丁酸的測定目前檢測的方法是酶動力學法，在輔酶I (NAD+)存在
的條件下，P-羥丁酸在P-羥丁酸脫氫酶的作用下生成乙酰乙酸、還原型輔酶I(NADH)及
氫離子，反應生成的還原型輔酶I (NADH)在340nm吸光度的變化可以間接反映病人血清中
的P-羥丁酸的濃度。其反應過程如下
e -羥丁酸脫氫酶
e -羥丁酸+輔酶i--^乙酰乙酸+還原型輔酶i +氫離子 但是此方法易受外源性的干擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，而提供一種在酶動力學法反 應測定P-羥丁酸的基礎上偶聯(lián)了一步酶反應，從而保證精確度高及其配速度快、操作簡 單的用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法。 本發(fā)明的另一個目的是提供用以實現(xiàn)用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用 的試劑盒。 本發(fā)明的第三個目的是一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒 的用途，用來判斷人體酮癥酸中毒程度。 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種用酶比色反應測定P-羥丁 酸的方法，所采取的措施為P-羥丁酸與輔酶I在P-羥丁酸脫氫酶的催化下脫氫生成乙 酰乙酸和還原型輔酶I，生成的還原型輔酶I和碘硝基四氮唑紫在黃遞酶的催化下反應生 成最高吸光率在505nm處的紅色物質(zhì)甲月替(formazane)，并在505nm波長處測定紅色物質(zhì) 甲月替(formazane)吸光度的變化來定量生物樣本中P _羥丁酸的含量，其反應方程式如
下
0 -羥丁酸脫氫酶
e-羥丁酸+輔酶i---------^乙酰乙酸+還原型輔酶i+氫離子
黃遞酶
還原型輔酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +輔酶I。 采取的措施還包括 在上述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法中，上述的反應過程具體為在0. 225ml的試劑I中加入6 ii L的0 4. 5mmol/L的P -羥丁酸，并置于37。C水浴5分鐘，并 讀取吸光度AO，加入0. 075ml的試劑11，37"水浴5分鐘后，讀取吸光度Al， AA = Al-AO。
在上述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法中，所述的試劑I包括 lOOmmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/ L的黃遞酶以及l(fā)mmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括1KU/L的P -羥丁酸脫氫 酶。 在上述的一種用酶比色反應測定13 -羥丁酸的方法中，其特征是13 -羥丁酸的含 量計算按以下公式進行計算 P -羥丁酸濃度(mmol/L) = ECX AAX/AAC ; 其中AX =樣本吸光率A5。5 Ac =標準品吸光率A5。5Ec = P -羥丁酸標準品濃度(mmol/L)。 —種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒，所述的試劑盒由以下成 分組成包括試劑I，試劑II、 P-羥丁酸標準品、P-羥丁酸異常血清對照以及266測試/ 盒，所述的試劑I包括100mmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及l(fā)mmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括 1KU/L的13 -羥丁酸脫氫酶，所述的試劑I為120ml ，試劑II為40ml 。 在上述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒中，所述的每個 試劑盒包含試劑I 一瓶60ml 、試劑II 一瓶20ml 、 P -羥丁酸標準品一瓶1ml 、 P -羥丁酸異 常血清對照一瓶1ml 。 —種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒的用途，該測定用于判斷 人體酮癥酸中毒診斷。 在上述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒的用途中，所依
據(jù)的原理反應方程式如下
0 -羥丁酸脫氫酶
e-羥丁酸+輔酶I---------^乙酰乙酸+還原型輔酶I +氫離子
黃遞酶
還原型輔酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +輔酶1。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于可線性測定生物樣本中P-羥丁酸濃度范 圍，并應用液體雙試齊U，測定P _羥丁酸所需樣本量少，僅需6 P L血清即可，此夕卜，測定時反 應時間短，操作簡單，適用于大量檢測，同時也方便通過測定血中P-羥丁酸的含量可作為 糖尿病患者病情變化的指標，為防止并發(fā)癥的產(chǎn)生和酮癥酸中毒形成提供了及時可靠的防 治依據(jù)。
具體實施例方式
以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的描述，但本發(fā)明并 不限于這些實施例。 本發(fā)明酶比色法反應測定13 -羥丁酸是在酶動力學法反應測定13 -羥丁酸的基礎上偶聯(lián)了一步酶反應，反應過程當中，首先P-羥丁酸在P-羥丁酸脫氫酶的作用下生成乙 酰乙酸、還原型輔酶I及氫離子，生成的還原型輔酶I和碘硝基四氮唑紫在黃遞酶的催化下 反應生成紅色物質(zhì)甲月替(formazane)在505nm處有最高吸光度，其反應方程式如下
e -羥丁酸脫氫酶
e-羥丁酸+輔酶i---------^乙酰乙酸+還原型輔酶i+氫離子
黃遞酶
還原型輔酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(formazane) +輔酶I 1.試劑組成試劑I包括100mmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及l(fā)mmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括 1KU/L的13 -羥丁酸脫氫酶
2. P -羥丁酸測定
1)反應過程在0. 225ml的試劑I {100,1/LTris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20,1/L的草 酸、2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及l(fā)mmol/L的碘硝基四氮唑紫}中加入L的 0 4. 5mmol/L的P -羥丁酸，并置于37。C水浴5分鐘，并讀取吸光度A0，加入0. 075ml的 試劑II (1KU/LP -羥丁酸脫氫酶)，37t:水浴5分鐘后，讀取吸光度Al， AA = Al-AO。
2)計算及結(jié)果 |3 -羥丁酸的含量計算按以下公式進行計算 P -羥丁酸濃度(mmol/L) = ECX A Ax/ A Ac ; 其中AX =樣本吸光率A5。5 Ac =標準品吸光率A5。5 Ec = |3 -羥丁酸標準品濃度(mmol/L)， 結(jié)果13 -羥丁酸線性范圍0 4. 5mmol/L。 —種用酶比色反應測定13 -羥丁酸的方法配用的試劑盒，所述的試劑盒由以下成 分組成包括試劑I，試劑II、 P-羥丁酸標準品、P-羥丁酸異常血清對照以及266測試/ 盒，所述的試劑I包括lOOmmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、 2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及l(fā)mmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括 1KU/L的13 -羥丁酸脫氫酶，所述的試劑I為120ml，試劑II為40ml，所述的每個試劑盒包 含試劑I 一瓶60ml、試劑II 一瓶20ml、 P -羥丁酸標準品一瓶lml、 P -羥丁酸異常血清對 照一瓶lml，檢測介質(zhì)血清，主要適用于體外診斷。
試劑配置 本試劑盒為液體雙試劑，可直接上機使用。如果受限于分析儀比色杯容積限制，可 以依比例(詳見試驗參數(shù))調(diào)整試劑試劑1、樣本/標準品/血清對照及試劑試劑II使用 試劑的穩(wěn)定與貯存期試劑及標準品避光保存2 8t:—年，嚴禁冷凍，P-羥丁酸
質(zhì)控血清2 8t:或冷凍保存一年。
5














倍數(shù)。


樣本處理
1) 空腹采血并盡快分離血清；
2) 血清標本2 8t:保存穩(wěn)定一周，_201:冷凍保存可穩(wěn)定3個月。 試驗參數(shù)與操作步驟
溫度 37 °C
測試方法 終點法
啟動反應 6 ii L樣本/標準品/血清對照+225 ii L試劑I (或依比例混勻) 孵育時間 5min
終止反應力B 75 ii L試劑11 (或依比例混勻) 延遲時間 10min 測試儀 日立710Q
1. 試劑和樣品用量可因儀器不同，按比例增減。
2. 測試中P-羥丁酸正?；蛏哐鍖φ諔鳛殛幮曰蜿栃詤⒄铡?br> 3. 若樣品P-羥丁酸濃度大于4. 5mmol/L，須用生理鹽水稀釋樣品，結(jié)果乘以稀釋
4. 如保存不當，試劑發(fā)現(xiàn)有渾濁時，應棄用。
5. 溶血對測定有干擾，操作過程中要盡量避免溶血。
參考值正常參考范圍0 0. 28mmol/L，各實驗室需要根據(jù)自身實驗條件自行制 定正常人血清e-羥丁酸范圍。 —種用酶比色反應測定13 -羥丁酸的方法配用的試劑盒的用途，用于測定血清標 本中的13 _羥丁酸含量，從而用來判斷人體酮癥酸中毒的危險性，這里酮體是脂肪酸的代 謝產(chǎn)物，包括乙酰乙酸、P-羥丁酸、丙酮，其中絕大部分為P-羥丁酸，血清中P-羥丁酸 的含量可以反映酮體的含量。糖尿病患者病情與葡萄糖的利用密切相關(guān)，與脂類的代謝密 切相關(guān)。目前用于糖尿病病情監(jiān)測的指標主要有血糖、糖化血紅蛋白，二者是血中糖在不同 時期的反映，不能充分說明體內(nèi)脂類代謝情況和病情發(fā)展趨勢，而體內(nèi)酮體的含量可反映 脂肪的代謝的狀況，血清中P-羥丁酸的測定可作為脂肪毒性作用的觀察指標。長鏈脂肪 酸長期作用胰島將損害葡萄糖氧化代謝和葡萄糖引起的胰島素分泌，加速了糖尿病患者病 情的發(fā)展，有研究表明，高脂肪酸使平滑肌細胞排列無序化，失去特征結(jié)構(gòu)，變?yōu)榕菽毎?對血中酮體的檢測，可及時有效地控制血脂水平，有助于預防和推遲動脈粥樣硬化的發(fā)生 和發(fā)展。因此，血中P-羥丁酸的測定可作為糖尿病患者病情變化的指標，為防止并發(fā)癥的 產(chǎn)生和酮癥酸中毒形成提供了及時可靠的防治依據(jù)。
原理 在ra為8. 5的Tris-HCL緩沖液體系下血清P-羥丁酸與輔酶I在P-羥丁 酸脫氫酶的催化下脫氫生成乙酰乙酸和還原型輔酶I。生成的還原型輔酶I和碘硝基四 氮唑紫(INT)在黃遞酶的催化下反應生成最高吸光率在50511111處的紅色產(chǎn)物-甲月替 (formazane)，據(jù)此可在505nm波長處測定紅色產(chǎn)物吸光度的變化來定量生物樣本中P _羥
丁酸的含量，所依據(jù)的原理其反應過程為
6e -羥丁酸脫氫酶
e -羥丁酸+輔酶i--^乙酰乙酸+還原性輔酶i+氫離子
黃遞酶
還原性輔酶I+碘硝基四氮唑紫--^甲月替(forraazane)(紅色)+輔
酶I (AMax = 505nm) 本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領 域的技術(shù)人員可以對所描術(shù)的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替 代，但并不會偏離本發(fā)明的精神所定義的范圍。
權(quán)利要求
一種用酶比色反應測定β-羥丁酸的方法，其特征是β-羥丁酸與輔酶I在β-羥丁酸脫氫酶的催化下脫氫生成乙酰乙酸和還原型輔酶I，生成的還原型輔酶I和碘硝基四氮唑紫在黃遞酶的催化下反應生成最高吸光率在505nm處的紅色物質(zhì)甲月替(formazane)，并在505nm波長處測定紅色物質(zhì)甲月替(formazane)吸光度的變化來定量生物樣本中β-羥丁酸的含量，其反應方程式如下F2009101556381C00011.tif
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法，其特征是上述的反應過程具體為在0. 225ml的試劑I中加入6 ii L的0 4. 5mmol/L的P -羥丁酸，并置 于37t:水浴5分鐘，并讀取吸光度AO，加入0. 075ml的試劑11，37t:水浴5分鐘后，讀取吸 光度Al， AA = Al-AO。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法，其特征是所述 的試劑I包括100mmol/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20mmol/L的草酸、2. 5mmo1/ L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及l(fā)mmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑II包括1KU/L的 P-羥丁酸脫氫酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法，其特征是P-羥 丁酸的含量計算按以下公式進行計算P -羥丁酸濃度(mmol/L) = ECX AAX/AAC ;其中^=樣本吸光率~。5Ac二標準品吸光率A^Ec = 13 -羥丁酸標準品濃度(mmol/L)。
5. —種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒，其特征是所述的試劑盒 由以下成分組成包括試劑I，試劑II、 P-羥丁酸標準品、P-羥丁酸異常血清對照以及 266測試/盒，所述的試劑I包括100,1/L的Tris-HCL緩沖液、pH值為8. 5的20,1/L 的草酸、2. 5mmol/L的輔酶I、1KU/L的黃遞酶以及l(fā)mmol/L的碘硝基四氮唑紫，所述的試劑 II包括1KU/L的13 -羥丁酸脫氫酶，所述的試劑I為120ml ，試劑II為40ml 。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒，其 特征是所述的每個試劑盒包含試劑I 一瓶60ml 、試劑II 一瓶20ml 、 P -羥丁酸標準品一 瓶lml、 13 -羥丁酸異常血清對照一瓶1ml 。
7. —種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒的用途，其特征是該測定 用于判斷人體酮癥酸中毒診斷。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種用酶比色反應測定P-羥丁酸的方法配用的試劑盒的用途，其特征是所依據(jù)的原理反應方程式如下 <formula>formula see original document page 2</formula>
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用酶比色反應測定β-羥丁酸的方法及其配用的試劑盒和其用途。在Tris-HCL緩沖液體系下血清β-羥丁酸與輔酶I在β-羥丁酸脫氫酶的催化下脫氫生成乙酰乙酸和還原型輔酶I，生成的還原型輔酶I和碘硝基四氮唑紫在黃遞酶的催化下反應生成最高吸光率在505nm處的紅色物質(zhì)甲月替(formazane)，據(jù)此可在505nm波長處測定紅色產(chǎn)物吸光度的變化來定量生物樣本中β-羥丁酸的含量。本法可線性測定生物樣本中β-羥丁酸濃度范圍(0～4.5mmol/L)，該測定用于判斷人體酮癥酸中毒診斷，本發(fā)明所用試劑應用液體雙試劑，測定β-羥丁酸所需樣本量少，此外，測定時反應時間短，操作簡單，適用于大量檢測。
文檔編號C12Q1/32GK101726463SQ200910155638
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者張聞 申請人:張聞