專利名稱：：通過埃希氏菌屬細菌生產(chǎn)l-氨基酸的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物技術，具體地涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法且更具體的涉及獲自大腸桿菌的基因。這些基因?qū)τ谔岣週-氨基酸生產(chǎn)能力是有用的，例如L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-精氨酸。
背景技術：
：傳統(tǒng)的L-氨基酸工業(yè)生產(chǎn)方法是發(fā)酵方法，通過利用來源于自然環(huán)境中微生物菌株或特定修飾的突變株來提高L-氨基酸生產(chǎn)能力的。已經(jīng)公開了很多提高L-氨基酸生產(chǎn)能力的技術，例如通過重組DNA轉(zhuǎn)化微生物(參見例如US4,278,765)。這些技術的基礎是提高在氨基酸生物合成中的酶活性和/或使被L-氨基酸產(chǎn)物反饋抑制的酶脫敏(參見例如，日本專利申請No56-18596(1981),W095/16042或美國專利No.5，661,012和6,040,160)。在另一方面，提高的氨基酸分泌可以增強L-氨基酸生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)能力，擁有增強表達L-賴氨酸分泌基因(lysE基因)的埃希氏菌屬細菌菌株已被公開(WO9723597A2)。另外，編碼適合于L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸或四氫噻唑衍生物的分泌蛋白的編碼基因也已經(jīng)公開(美國專利No.5，972，663)。現(xiàn)在，一些編碼能提高L-氨基酸生產(chǎn)的推定的膜蛋白的大腸桿菌基因被公開。A岀基因的額外的拷貝使細菌具有優(yōu)選的對L-高絲氨酸的抗性并提高L-高絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸的生產(chǎn)(歐洲專利申請EP994190A2)。此外，出C基因的額外的拷貝使細菌具有{^的對L-高絲氨酸和L-蘇氨酸的抗性并提高L-高絲氨酸、L-蘇氨酸和L-亮氨酸的生產(chǎn)(歐洲專利申請EP1013765A1)。此外，戸/2A^mSj^K和少怨^基因的額外的拷貝提高L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-丙氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸的生產(chǎn)(歐洲專利申請EP1016710A2)。盡管，大腸桿菌K-12菌株的全長基因組序列已經(jīng)描述(BlattnerRR.,PkmkettG，BlochCA.etal.,Science,227,1453-1474,1997;ftp.genetics.wisc.edu/pub/sequence/ecolim52.so}.gz)，但其中的很多ORFs，它們的功能尚不清楚。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提高L-氨基酸生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)能力并提供一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，例如通過菌株生產(chǎn)L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸或L-甲硫氮酸或L-精氨酸。此目的是通過識別編碼蛋白質(zhì)的基因而達到的，這些基因并不參預目標L-氨基酸的生物合成途徑中但能提高其產(chǎn)量。一個例子是這種蛋白質(zhì)是一種具有L-氨基酸分泌活性的膜蛋白。在大腸桿菌全長基因組序列分析的基礎上，擁有4或更多個推定的跨膜片段(TMS)的蛋白質(zhì)被選擇。努力篩選的結(jié)果，本發(fā)明人從中識別了幾個基因，它們是b2682,b2683,bl242和b3434，并進行了全面的研究。基因b2682和b2683已被認為是被推定的CDS，它可以編碼功能未知的蛋白質(zhì)(分別為GENEBANK登記號AE000353U00096序列的核苷酸數(shù)92到829和819到1154)。基因b2683也認為是;^a//?；騜l242已被認為是推定的CDS,它可以編碼功能未知的蛋白質(zhì)(GENEBANK登記號AE000222U00096序列的核苷酸數(shù)8432到9079)?；騜1242也認為是yc/LE?；騜3434已被認為是推定的CDS,它可以編碼功能未知的蛋白質(zhì)(GENEBANK登記號AE000420U00096序列的核苷酸數(shù)1463到2056)?；騜3434也認為是y/《W。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)通過提高b2682,b2683，b242或b3434基因編碼的蛋白質(zhì)的活性，菌株的L-氨基酸生產(chǎn)能力也被提高，因此，本發(fā)明已經(jīng)完成。本發(fā)明如下1)一種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于±矣希氏菌屬(Escherichia),該細菌經(jīng)過修^P以致于該細菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高以下A)或B)，和C)或D)定義的蛋白質(zhì)在細菌細胞中的活性來提高B)—種包含序列表中SEQK)NO:3所示氨基^T冽的蛋白質(zhì)；C)-一種包含在序列表中SEQIDNO:3所示氨基鵬爭列上缺失、置換、插入、添加一個或多個氨基酸而形成的氨基駒亨列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和域其類似物的抗性的活性；D)—種包含序列表中SEQIDNO:5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；E)—禾中包含在序列表中SEQIDNO:5所示氨基Mi^列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氮基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氮基酸和域其類似物的抗性的話性;。(在下文中，如上述A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)被稱為"本發(fā)明第一實施方案的的蛋白質(zhì)"，能提高上述蛋白質(zhì)活性的埃希氏菌屬細菌被稱為"本發(fā)明第一實施方案的細菌")2)根據(jù)上述的細菌，A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)的活性可以通過將編碼A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)^i4細菌，或通過改變細菌染色體DNA上的表達調(diào)控序列而提高。3)根據(jù)上述的細菌，其中的轉(zhuǎn)化是使用多拷貝載體進行的。4)一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。5)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-蘇氨酸。6)根據(jù)上述方法，所述的細菌己經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高蘇氨酸操縱子的表達。7)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-llfi酸。8)根據(jù)上述方法，所述的細菌己經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高//v操縱子的表達。9)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-腩氨酸。10)根據(jù)上述方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高脯氨酸生物合成基因的表達。11)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-亮氨酸。12)根據(jù)上述方法，所述的細菌己經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高細操縱子的表達。13)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-甲硫氨酸。14)根據(jù)上述方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高mer調(diào)節(jié)子的表達。15)—種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于埃希氏菌屬，該細菌經(jīng)過修飾以致于該細菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高以下E)或F)定義的蛋白質(zhì)在細菌細胞中的活性來提高F)—種包含序列表中SEQIDNO:11所^基酸序列的蛋白質(zhì)；G)—種包含在序列表中SEQIDNO:ll所示氨基,列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的MS酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；(在下文中，如上述E)或F)定義的蛋白質(zhì)有時被稱做"本發(fā)明第二實施方案的蛋白質(zhì)"，能提高上述蛋白質(zhì)活性的埃希氏菌屬細菌是指"本發(fā)明第二實施方案的細菌")16)根據(jù)上述的細菌，E)或F)定義的蛋白質(zhì)的活性可以通過將編碼E)或F)定義的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化進細菌，或通過改變細菌染色體DNA上的表達調(diào)控序列而提高。17)根據(jù)上述的細菌，轉(zhuǎn)化是使用多拷貝載體進行的。18)—種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。19)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-蘇氨酸。20)根據(jù)上述方法，所述的細菌己經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高蘇氨酸操縱子的表達。21)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-纈氨酸。22)根據(jù)上述方法，所述的細菌已經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以提高操縱子的表達。23)—種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于埃希氏菌屬，該細菌經(jīng)過修飾以致于該細菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高以下G)或H)定義的蛋白質(zhì)在細菌細胞中的活性來提高H)—種包含序列表中SEQIDNO:15所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；I)一種包含在序列表中SEQIDNO:15所示氨基HJ^列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸禾B/或其類似物的抗性的活性，例如；DL-O-甲基絲氨酸，6-重氮基_5—氧七_正亮氨酸和DL-p-羥基-正纈氨酸，對S-(2-氨乙基)半胱氨酸敏感性增加；(在下文中，如上述G)或H)定義的蛋白質(zhì)有時被稱做"本發(fā)明第三實施方案的蛋白質(zhì)"，能提高E)或F)蛋白質(zhì)活性的埃希氏菌屬細菌是指"本發(fā)明第三實施方案的細菌")24)根據(jù)上述的細菌，G)或H)定義的蛋白質(zhì)的活性可以通過將編碼(G)或(H)定義的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化進細菌，或通過改變細菌染色體DNA上的表達調(diào)控序列來提高。25)根據(jù)上述的細菌，其中的轉(zhuǎn)化是使用多拷貝載體進行的。26)—種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。27)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-精氨酸。28)根據(jù)上述方法，所述的細菌己經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以增強精氨酸調(diào)節(jié)子的表達。29)根據(jù)上述方法，所述的L-氨基酸是L-脯氨酸。30)根據(jù)上述方法，所述的細菌己經(jīng)經(jīng)過修飾以至于該細菌可以增強脯氮酸生物合成基因的表達。生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高了的蛋白質(zhì)活性的L-蘇氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-蘇氨酸。一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-纈氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-纈氨酸。此外，生產(chǎn)L-氮基酸的方汰,括使用含有SEQIDNO:3禾卩SEQIDNO:5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-脯氨酸生產(chǎn)細菌來生產(chǎn)L-脯氨酸。此夕卜，生產(chǎn)L-氨基酸的方》跑括4頓含有SEQIDNO:3禾PSEQIDNO:5所7，氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-亮氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-亮氨酸。生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-甲硫氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-甲硫氨酸。進一步的，生產(chǎn)L-氨基酸的方、)跑括使用含有SEQIDNO:ll所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-蘇氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-蘇氨酸。一種生產(chǎn)L-氨基酸的方、/i^括使用含有SEQIDNO:11所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-纈氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-纈氨酸。更進一步的，生產(chǎn)L-氨基酸的方法包括使用含有SEQIDNO:15所示氨基酸序列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-精氨酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-精氨酸。此夕卜，生產(chǎn)L-氨基酸的方^^括使用含有SEQIDNO:15所示氨基,列的本發(fā)明提高的蛋白質(zhì)活性的L-脯氮酸生產(chǎn)細菌生產(chǎn)L-S甫氨酸。下面將詳細解釋本發(fā)明本發(fā)明的細菌是一種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于埃希氏菌屬，該細菌經(jīng)過修飾以致于該細菌的L-氨基酸生產(chǎn)可以通過提高本發(fā)明的蛋白質(zhì)在細菌細胞中的活性來提高。來本發(fā)明中"L-氨基酸生產(chǎn)細菌"是指細菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)時有能力在培養(yǎng)基中積累L-氨基酸的細菌，這種L-氨基酸生產(chǎn)能力可以是細菌的野生菌株具有的牛爭性也可以是通過培育而獲得或提高的。本發(fā)明的細菌是一種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于埃希氏菌屬，該細菌具有提高的蛋白質(zhì)話性，它可以提高目標L-氨基酸的生產(chǎn)能力，具體的，本發(fā)明的細菌是一種L-氨基酸生產(chǎn)細菌，該細菌屬于埃希氏菌屬，該細菌具有提高的至少一種或兩禾中的蛋白質(zhì)活性。術語"提高的蛋白質(zhì)活性"，是指每個細胞的活性要高于未經(jīng)修飾的菌株，例如，一種野生型埃希氏菌屬細菌。例如，將提到一個每個細胞的蛋白質(zhì)分子數(shù)增加的例子，每個蛋白質(zhì)分子特定活性增加的一個例子等等。進一步，一種野生型埃希氏菌屬細菌被用佔M照，例如，野生型大腸桿菌菌株將被提到。具體的，本發(fā)明第一實施方案的細菌載有在細菌的染色體DNA或質(zhì)粒上至少有b2682和b2683兩個基因優(yōu)選二者超表達的DNA，且具有增強的生產(chǎn)L-氨基酸的能力，例如，L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸和L-甲硫氨酸。本發(fā)明的第二實施方案的細菌在細菌的染色體DNA或質(zhì)粒上載有DNA，該DNA上有bl242基因過量表達，并提高生產(chǎn)L-氨基酸的能力，例如，L-蘇氨酸和/或L-纈氨酸。本發(fā)明的第三實施方案的細菌停泊在細菌的染色體DNA或質(zhì)粒上超表達b3434基因的DNA，并具有增強的生產(chǎn)L-氨基酸的能力，例如，L-精氨酸和/或L-脯氨酸。本發(fā)明第一實施方案的蛋白質(zhì)包括以下A)或B)和C)或D)定義的蛋白質(zhì)中的任一個J)一種包含序列表中SEQIDNO:3所示氨基列的蛋白質(zhì)；K)一種包含在序列表中SEQIDNO:3所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其對以物的抗性的活性；L)—種包含序列表中SEQEDNO:5所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；M)—種包含在序列表中SEQIDNO:5所示氨基列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基,列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性;。"幾個"氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結(jié)構中氨基酸殘基的類型而不同。分別來講，對蛋白質(zhì)(A)來講是可以是2-24，優(yōu)選是2-12，更優(yōu)選是2-5，對蛋白質(zhì)(C)來講是可以2-11，雌是2-7，更P戰(zhàn)為2-5。本發(fā)明第二實施方案的蛋白質(zhì)包括以下E)或F)定義的蛋白質(zhì)中的任一個N)—種包含序列表中SEQIDNO:ll所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；O)—種包含在序列表中SEQIDNO:ll所g基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性；"幾個"氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結(jié)構中氨基酸殘基的類型而不同。對蛋白質(zhì)(E)來講是可以是2-22，優(yōu)選是2-11，更優(yōu)選是2-5。本發(fā)明第三實施方案的蛋白質(zhì)包括以下G)或H)定義的蛋白質(zhì)中的任一個P)—種包含序列表中SEQIDNO:15所7^氨基,列的蛋白質(zhì)；Q)—種包含在序列表中SEQE)NO:15.所示氨基酸序列上缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，它有使細菌增加對L-氨基酸和/或其類似物的抗性的活性，例如；DL-o-甲基絲氨酸，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸和DL-b-羥基去甲纈氨酸，對S-(2-氨乙基)半胱氨酸敏感性增加；"幾個"氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結(jié)構中氨基酸殘基的類型而不同。對蛋白質(zhì)(G)來講是可以是2-20，優(yōu)選是2-10，更優(yōu)選是2-5。增加的對L-氨基酸和/或其類似物的抗性意味著具有在未修飾的菌株，或野生菌株，或本細菌的親本菌株不能生長的，含有L-氨基酸和/或其類似物最低濃度的培養(yǎng)基上生長的能力?；蛘咭馕吨斜任葱揎椀木?，或野生菌株，或本細菌的親本菌株在含有L-氨基酸和/或其類似物的培養(yǎng)基上生長更快的能力。更具體的，大爿^t干菌菌株在37"C含有合適條件的L-氨基酸和/或其類似物瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，如果大腸桿菌菌株形成了一個比37X:，大腸桿菌菌株在固體Adams培養(yǎng)基上經(jīng)過2-4天i咅養(yǎng)后形成的未修飾菌株或野生型菌株大的菌落，貝何以說大腸桿菌菌株己經(jīng)增加了對L-氨基酸和減其對以物的抗性。術語"合適的條件"是指溫度、pH、供氣或基本營養(yǎng)或其它的選擇。L-氨基酸類似物通過3，4-二氫脯氨酸，DL-硫代異亮氮酸，DL-o-甲基絲氨酸，4-氮雜亮氮酸，正亮氨酸，L-o-氟代苯丙氨酸和DL-o-氟代苯丙氨酸，高絲氨酸，6-重氮基-5-氧-L-正亮氮酸和DL-P-羥基-正纈氨酸來例證。上面提及到L-氨基酸或它們的類似物存在的條陣下，未修飾的菌株或野生型菌株不能生長時的濃度，依據(jù)使用的化合物的結(jié)構不同進行變化是值得注意的(從DL-硫代異亮氨酸的0.5pg/ml到DL-o-甲基絲氨酸的9600|ag/mJ)。例如，假設是3，4-二氫脯氨酸，一船農(nóng)度是7-7(^g/ml，優(yōu)選是20-25^ig/ml;假設是DL-硫代異亮氨酸，一般濃度是0.5-5pg/ml，優(yōu)選是0.9-Upg/ml;假設是DL-o-甲基絲氨酸，一般濃度是1100-9600idg/ml，優(yōu)選是3000-3500)ig/ml;假設是4-氮雜亮氮酸，一般濃度是15-150^ig/ml，優(yōu)選是40-50iig/ml;假設是正亮氨酸，一般濃度是150-1500|Lig/ml，優(yōu)選是450-550)ig/m];假設是L-o-氟代苯丙氨酸，一般濃度是0.6-6pg/ml，優(yōu)選是1.5-2ng/ml;假設是DL-o-氟代苯丙氨酸，一般濃度是2-20(ig/ml，優(yōu)選是5-7|Lig/ml;假設是高絲氨酸，一般濃度是330-3300pg/ml，優(yōu)選是900-1100p^ml;假設是6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸，一般濃度是5-50pg/ml，P琉是12-i8|:ig/ml;假設是DL-(3-羥基-正纈氨酸，一般濃度是25-250)Lig/ml，優(yōu)選是70-90)Ug/ml。對L-氨基酸或它們的類似物敏感意味著細菌有比它的未經(jīng)修飾菌株或野生菌株在含有最低濃度的L-氨基酸或它們的類似物的培養(yǎng)基上擁有更長增殖期的能力?；蛘呤?，對L-氨基酸或它們的類似物敏感意味著細菌在它的未經(jīng)修飾菌株或野生菌株能生長的，含有最低濃度的L-氨基酸或它們的類似物的培養(yǎng)基上不能生長。這種L-氨基酸類似物是通過S-(2-氨乙基)半胱氨酸來例證的。上面提及的濃度假設是對于S-(2-氨乙基)半胱氨酸，一船農(nóng)度是0.2-2.0^ml，優(yōu)選是0.5-1.Ojag/ml。本發(fā)明的細菌也包括通過將編碼A)或B)，和C)或D)，或E)或F)，或G)或H)蛋白的DNA轉(zhuǎn)入細菌或通過改變細菌染色體DNA上的表達調(diào)控序列而將本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)的活性提高的菌株。所述的在本發(fā)明中對細菌進行修飾的DNA編碼推定的膜蛋白質(zhì)。進一步，該DNA編碼具有4個或更多個跨膜節(jié)段的蛋白質(zhì)。這樣的DNA可以編碼具有L-氨基酸分泌活性的蛋白質(zhì)。更進一步，該DNA通過b2683，b2683，b1242和b3434基因表示。必須要注意的是b2682基因的編碼區(qū)728-738和b2683基因的編碼區(qū)1-11是部分重疊的。這兩個基因可以通過例如i頓SEQIDNO:l禾卩SEQIDNO:2公開的核苷酸作為引物進行PCR而獲得，為一個PCR產(chǎn)物?；騜l242可以通過例如^(頓SEQIDNO:9禾BSEQIDNO:10公開的核苷酸作為引物進行PCR而獲得?；騜3434可以通過例如使用SEQIDNO:13和SEQIDNO:14公開的核苷酸作為弓卿進行PCR而獲得。對大腸桿菌全基因組序列分析可以篩選出編碼具有4個或更多個推定的TMS蛋白質(zhì)的基因。已知功能的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)運蛋白在PaulsenI.T.,SliwinskiM.I.,SaierM.H.的文章中描述(J,Mol.Biol.,1998,227,537)LintonKJ禾nHigginsC.F.(MolecularMicrobiology,1998,28(1),5)也對它進行了排除篩選，在其余的基因篩選的結(jié)果中，幾個編碼推定膜輸出蛋白的基因關閉了。發(fā)現(xiàn)b2682和b2682基因超表達，或b1242或b3434基因超表達提高了L-氨基酸生產(chǎn)菌的L-氨基酸生成。本發(fā)明的DNA包括編碼在蛋白質(zhì)A)或C)的序列上的一個或更多個位置上的缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，只要它們沒有失去蛋白質(zhì)的活性。"幾個"氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結(jié)構中氨基酸殘基的-類型而不同。分別來講，對蛋白質(zhì)(A)來講是可以是2-24，優(yōu)選的是2-12，更"隨是2-5，對蛋白質(zhì)(C)來講是可以2-11，優(yōu)選的是2-7，更tt^是2-5。進一步，本發(fā)明的DNA包括編碼在蛋白質(zhì)A)的序列上的一個或更多個位置上的缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸而形成的氨基^)f冽的蛋白質(zhì)，只要它們沒有失去蛋白質(zhì)的活性。"幾個"氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結(jié)構中氨基酸殘基的類型而不同。對蛋白質(zhì)(E)來講是可以是2-22，優(yōu)選的是2-11，更優(yōu)選是2-5。，一步，本發(fā)明的DNA包括編碼在蛋白質(zhì)E)的序列上的一個或更多個位置上的缺失、置換、插入、增加一個或多個氨基酸li而形成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，只要它們沒有失去蛋白質(zhì)的活性。"幾個"氨基酸的數(shù)目根據(jù)位點或蛋白質(zhì)三級結(jié)構中氨基酸殘基的類型而不同。對蛋白質(zhì)(G)來講是可以是2-20，優(yōu)選的是2-10，更優(yōu)選是2-5。編碼與A)，C)，E)或G)定義的蛋白質(zhì)在實質(zhì)上相同的蛋白質(zhì)的DNA可以通過例如對編碼A)，C)，E)或G)定義的蛋白質(zhì)核苷酸序列進行定向位點誘變而獲得，所以一個或更多氨基酸殘基會被缺失、置換、插入、增加。這種修飾的DNA可以通過常規(guī)的試劑處理和條件生成突變的方法獲得。這種處理包括使用羥胺處理編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA或用紫外線輻射或例如N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍或亞硝酸處理細菌含的DNA。本發(fā)明的DNA包括在不同菌株中和在埃希氏菌屬細菌天然多樣的菌株中分離的突變體。編碼這些突變體的DNA可以通過分離DNA而獲得，它們可以與基因b2862，b2863，b1242或b3434雜交，或在嚴謹條件下部分雜交，并且它們編碼的蛋白質(zhì)可以提高L-氨基酸的生產(chǎn)，術語"嚴謹條件"是指可以形成所謂的特異的雜交時，而非特異的雜交沒有形成時的剝牛。例如，嚴謹條件包括DNA有高度同源性時的雜交條件，例如DNAs相互之間擁有70%同源性吋。或者，嚴謹條件可以通過構成Southern雜交清洗時的普通條件來例證，例如，60°C，XSSC，0.1%SDS，優(yōu)選的是0.1XSSC，0.1%SDS。使用編碼突變體的，并能與基因b2862，b2863，b1242或b3434雜交的DNA作為探針，含有部分SEQIDNO:3或SEQIDNO:5的核苷酸序列的DNA也可以作為探針。這樣的探針可以通過使用基于SEQIDNO:3、5、11、15而生產(chǎn)的寡聚核苷酸作為引物，使用含有SEQIDNO:3、5、11、15的核苷酸的DNA片段作為模板進行PCR而制備。當長度約為300bp的DNA片段被用做探針時，雜交的沖洗條件為，例如，50°C，2XSSC和0.1。/。SDS。用編碼蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化細菌意味著將DNA傳入細菌細胞，例如通過傳統(tǒng)的方法來提高本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達并提高細菌細胞中該蛋白質(zhì)的活性。提高基因表達的技術包括增加基因拷貝數(shù)。在埃希氏菌屬細菌中傳入一個含有基因的載體能起到增加該基因拷貝數(shù)的功能。為此目的，最好使用多拷貝載體。多拷貝載體是通過pBr322，pMW119，pUC19，pET22b或其它相似的載體來例證的。此外，也可以通過例如同源重組或相似方法來在細菌染色體上弓l入基因的多拷貝，而達到提高基因表達的目的。為了提高了兩個或多個基因的表達，基因可以一起位于同一個質(zhì)粒上，也可以位于不同的質(zhì)粒上。一個基因位于染色體上，而另一^t位于質(zhì)粒上也是可以的。在另一方面，可以通過改變基因的表達調(diào)控序列而提高基因表達。改變基因的表達調(diào)控序列包括在基因原有的表達調(diào)控序列例如啟動子中引入突變，而使基因表達提高(WO00/18935),也可以將本發(fā)明的DNA置于強啟動子的控制下。例如/flc啟動子，印啟動子，加啟動子，入噬菌體中被認為是強啟動子的PL啟動子，強啟動子可以與多拷貝基因耳^使用。本發(fā)明所述的細菌可以通過向本身能產(chǎn)生L-氨基酸的細菌中引入上述DNA而獲得。也可以通過賦予已經(jīng)含有DNA的細菌這種產(chǎn)生L-氨基酸能力而獲得所述的細菌。已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-蘇氨酸產(chǎn)生菌株屬于埃希氏菌屬，例如，菌株VL2054(VKPMB-8067),VNIIGenetika472T23(美國專利N05,631,157)，VKPMB-3996(美國專利NO5,175，107和NO5,976,843)，KCCM-10132(WO009660A1)，KCCM-10133(WO009661A1)或類似的菌株可以使用。已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-纈氨酸產(chǎn)生菌株屬于埃希氏菌屬，例如，菌株H-81(VKPMB-8066)，NRRLB-12287和NRRLB-12288(美國專利NO4,391，907)，VKPMB—4411(美國專利N05,658,766)，VKPMB-7707(歐洲專利申請EP1016710A2)或類似的菌株可以使用。此外，已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-脯氨酸產(chǎn)生菌株屬于i矣希氏菌屬，例如，菌株NRRLB-12403和NRRLB-12404(GB2075056)，VKPMB-8012(俄羅斯專利申請NO2000124295),專利DE3127361中描述的突變質(zhì)粒，BloomF.R.etal描述的突變質(zhì)粒(The15thMiamiwintersymposium,1983，p.34)或類似的菌株可以使用。已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-亮氨酸產(chǎn)生菌株屬于埃希氏菌屬，例如，菌株H-9070(FERMBP-4704)禾卩H-9072(FERMBP-4706)(US5744331)，VKPMB-7368禾卩VKPMB-7388(RU2140450)，W1485atpA401/pMWdAR6，W14851ip2/pMWdAR6禾卩AJ12631/pMWdAR6(EP0872547)或類似的菌株可以使用。已經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-甲硫氨酸產(chǎn)生菌株屬于埃希氏菌屬，例如，菌株AJ11539(NRRLB-12399)，AJ11540(NRRLB-12400),AJ11541(NRRLB-12401)AJ11542(NRRLB-12402)(GB2075055)，或類似的菌株可以4OT。進一步，己經(jīng)被提高了本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活性的親本菌株，L-精氨酸產(chǎn)生菌株屬于埃希氏菌屬，例如，菌株AJ11531和AJ11538(JP56106598A2)，AJ11593(FERMP-5616)和AJ11594(FERMP-5617)(日本專利公開N0575693)或類似的菌株可以使用。本發(fā)明所述的細菌可以進一步提高包括在L-氨基酸生物合成中一個或更多個基因的表達。對于L-蘇氨酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過蘇氨酸操縱子來例證的，它最好包含一個編碼被L-蘇氨酸反饋抑制的門冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶基因(日本專利公開N0.1-29559)。對于L-纈氨酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過//v操縱子，不很好表達蘇氨酸脫氨基氫酶，其弱化作用被抑制的WG^ffiD^操縱子來例證的(日本專利公開N0.8-47397)。對于L-脯氨酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過L-脯氨酸生物合成基因來例證的，它"選用被L-脯氨酸反饋抑制的谷氨酸激酶基因pt^表示(DE3127361)。對于L-亮氨酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過亮氨酸操縱子，也就是/w操縱子來例證的，它最好包含一個編碼被L-亮氨酸反饋抑制的異丙基蘋果酸合成酶基因(俄羅斯專利公開99114325)。對于L-甲硫氮酸產(chǎn)生菌株，這種基因是通過甲硫氨酸調(diào)節(jié)子來例證的。甲硫氨酸調(diào)節(jié)子含有編碼抑制氨基酸生物合成的活性減低的蛋白質(zhì)的突變基因。這種基因是通過編碼從大腸桿菌中得到的L-甲硫氨酸生物合成相關抑制蛋白，在抑制甲硫氨酸生物合成的活性上減低的變異型基因met/來例證的(JP2000-157267A2)。進一步，這一基因為精氨酸調(diào)節(jié)子例證，其優(yōu)選包含其L-精氨酸反饋抑制被脫敏的N-乙?；劝彼岷铣擅富?RajagopalB.S.等Apple.Environ.MicrobioU998,U.64.No.5,Pl805-1811)。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明第一實施方案的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-蘇氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-纈氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-纈氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-纈氨酸的步驟。此外，本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-脯氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-脯氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-脯氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-亮氨酸的方法^括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-亮氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-亮氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L"甲硫氨酸的方t跑括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-甲硫氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-甲硫氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明第二實施方案的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-蘇氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-纈氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-纈氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-纈氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-精氨酸的方法包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明第三實施方案的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-精氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-精氨酸的步驟。本發(fā)明所述的生產(chǎn)L-脯氨酸的方^括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明所述的細菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-脯氨酸，從培養(yǎng)基中收集L-脯氨酸的步驟。本發(fā)明所述的在培養(yǎng)基及相似物中培養(yǎng)、分離純化L-錢酸，在使用微生物進行氨基酸生產(chǎn)時，可以使用與傳統(tǒng)發(fā)酵方法中相同的方法進行。用來培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以吋合成培養(yǎng)基也可以是天然培養(yǎng)基，只要培養(yǎng)基包舌碳源、氮源和礦物質(zhì)，如果必要，還可以包括微生物生長需要的合適數(shù)目的營養(yǎng)物質(zhì)。碳源可以包括各種碳水化合物，例如葡萄糖和蔗糖，和各種有機酸。取決于所用微生物的同化方式，包括乙S享和甘油的醇也可以使用。至于氮源，各科胺鹽，例如氨和硫酸胺，包括例如胺的其他氮，天然氮源例如蛋白胨，大豆水解物和微生物發(fā)酵的消化物都可以使用。培養(yǎng)最好在例如振蕩培養(yǎng)，有氧攪拌培養(yǎng)等有氧條件下進行，溫度在20-40。C，最好在30-38。C。培養(yǎng)時的pH值一般在5-9，最好在6.5-7,2。pH值可以用氨水，碳酸鈣，各種酸，各種堿和緩沖液進行調(diào)節(jié)。通常，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-5天導致目的氨基酸在培養(yǎng)基中積累。在培養(yǎng)后，可以通過離心或膜過濾的方法將培養(yǎng)基中的固體出去，例如細胞。然后可以通過離子交換，濃縮和結(jié)晶的方法收集和純化目的氨基酸。附圖的簡要說明圖1顯示了質(zhì)粒pAlacZ的結(jié)構本發(fā)明最佳實施方式下面將通過實施例更具體的解釋本發(fā)明，在下例中如未說明，氨基酸是L-構型。15實施例l:將b2682,b2683,b1242和b3434基因克隆至p△lacZ上為了克隆b2682，b2683，bl242和b3434基因使用了pAlacZ質(zhì)粒。質(zhì)粒pAlacZ衍生自質(zhì)粒pET-22b(+)(Novagen，Madison。WI,USA)。用酶Bgl1I和Xbal處理pET-22b(+)質(zhì)粒，將其與質(zhì)粒pMB9-lac(FullerF.，Gene,19，43-54，1982)用相同內(nèi)切酶處理帶有P^UV5啟動子的PCR產(chǎn)物的片段連接。對于擴增PlacUV5啟動子片段可以使用SEQIDNO:7和SEQK)NO:8描述的PCR引物。通過克隆質(zhì)粒pJEL250的SalI-BamHI的片段(DymakovaE.etal.，Gene,19,43-54,1982)，最后的質(zhì)粒增加了/acZ基因的部分結(jié)構(237bp，沒有啟動子)。獲得的質(zhì)粒pAlacZ的圖譜在附圖1中表示?？寺〈竽c桿菌b2682和b2683推定閱讀框(b2682和b2683基因)的起始物質(zhì)是PCR片段，該片段是通過使用大腸桿菌菌株TG1的DNA作為模板而得到的，擴增片段用到的兩個引物在SEQIDNO:l和2中已經(jīng)描述。PCR反應在PE-2400上，以40sec.95。C,40sec.47。C40sec.72。C,30循環(huán)的條件下進行。如此，1158bp的包含了b2682和b2683基因的線形DNA片段就獲得了。將該片段用XbaI和BamHI內(nèi)切酶處理并插入到已經(jīng)用相同的酶處理了的多拷貝載體質(zhì)粒pAlac.Z上。得到的含有PCR片段的質(zhì)粒被稱為pYGAZH，攜帶的b2682和b2683兩個基因處于乳糖啟動子(PlacUV5)的控制下。類似的，克隆大腸桿菌b1242推定閱讀框(b1242基因)的起始物質(zhì)是PCR片段，該片段是通過使用大腸桿菌菌株TG1的DNA作為模板而得到的，擴增片段用到的兩個引物在SEQIDNO:9和10中己經(jīng)描述。得到的含有PCR片段的質(zhì)粒被稱為pYCHE，攜帶的bl242基因處于乳糖啟動子(PlacUV5)的控制下?？寺〈竽c桿菌b3434推定閱讀框(b3434基因)的起始物質(zhì)是PCR片段，該片段是通過使用大腸桿菌菌株TG1的DNA作為模板而得到的，擴增片段用到的兩個弓l物在SEQIDNO:13和14中已經(jīng)描述。得到的含有PCR片段的質(zhì)粒被稱為pYHGN，攜帶的b1242基因處于乳糖啟動子(PlacUV5)的控制下。實施例2:擴增的b2862，b2683基因?qū)Υ竽c桿菌菌株TG1自基,其類似物抗性的影響。大腸桿菌菌株TG1(pYGAZH)TG1(pYCHE)，TG1(pYHGN)和含有未插入片段質(zhì)粒的TG1菌株(對照菌株)在附加100tig/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。所有菌株的過夜后的培養(yǎng)物用附加100U^ml氨節(jié)青霉素和IPTG0.5mM的新鮮LB培養(yǎng)釋25倍，在37。C有氧培養(yǎng)2小時。對數(shù)生長期的培養(yǎng)物用0.9%的NaCl溶液稀釋使在附加100ug/ml氨芐青霉素和DPTG0.5mM和氨基酸或其^i以物的Adams固體培養(yǎng)基平纟反上大約有1000個細胞接種。在37。C培養(yǎng)2-4天后，記錄擁有雜種質(zhì)粒的TG1菌株和對照TG1菌株之間在形成菌落的數(shù)目和菌落大小上的不同。實驗結(jié)果如表1。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>No-與對照菌株沒有不同R-有更多的菌落或菌落更大S-與對照菌株相比具有更少的菌落或菌落更小實施例3:用含有質(zhì)粒pYGAZH的菌株生產(chǎn)蘇氨酸蘇氨酸生產(chǎn)菌株VL2054是通過將含有處于P^UV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。獲得的菌株被命名為VL2054(pYGAZH)。菌株VL2054是菌株VKPMB-3996的衍生物，在染色體上a)目標蘇氨酸操縱子位于PR啟動子的控制下。b)野生型A"基因c)染色體上沉默的編碼轉(zhuǎn)氫酶的基因(威基因)和Tn5(tdh::Tn5，Kans)上沉默的編碼卡那霉素抗性基因(/ca")d)突變體Z7V^442菌株VL2054已經(jīng)于2001年1月30日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏(Russia113545,Moscow,1Dorozhnyproezd，1)，f私藏號為VKPMB-8067，并于2002年根據(jù)布達佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。將作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株VL2054(pAlacZ)和菌株VL2054(pYGAZH)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S04-llg/l;NaCl-0.4g/l;MgS04~0.4g/l;K2HPOrlg/l;FeSO4-10mg/l;MnSO4-10mg/l;硫胺-0.1mg/l;酵母提取物-0.5g/l;蔗糖-40g/l;如果必要的話氨芐青霉素-300mg/D，在32"C通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32。C轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)48或72小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2SOr22gA;NaCl-0.8g/l;MgSO4"0.8g/l;K2HPOr2g/l;FeSO4-20mg/l;MnSO4-20mg/l;硫胺-0.2mg/l;酵母提取物-lg/l;CaCOr30g/l;蔗糖-80g/l;氨芐青霉素-300mg/1,如果必要的話；IPTG-0.5mM,如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中蘇氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-50ml，丙酮-50ml，NH4OH(30%)-12ml，水-8ml。結(jié)果見表2。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了蘇氨酸產(chǎn)生菌株VL2054的蘇氨酸積累量。表2:有質(zhì)粒的IPTG48小時72小時VL2054OD540Thr,g/1Thr/ODOD540Thr/ODNO-195.20.27269.10.35+214.10.20297.80.27pAlacZ—206.40.32249.10.40+153.50.23247.20.30pYGAZH-175.70.34249.70.40+219.80.472315.50.67實施例4:用含有質(zhì)粒pYGAZH的菌株生產(chǎn)纈氨酸纈氨酸生產(chǎn)菌株H-81是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。獲得的菌株已經(jīng)于2001年1月1930日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏(Russia113545，Moscow,1Dorozhnyproezd，1)，保藏號為VKPMB-8066,并于2002年根據(jù)布達佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。將作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株H-81(pAlacZ)和菌株H-81(pYGAZH)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S04-18g/l;K2HP04-1.8g/l;MgS04—1.2g/l;硫胺-0.1mg/l;酵母提取物-0.5^1;蔗糖-60g/l;如果必要的話氨節(jié)青霉素-300mg/1)，在通風條件下i音養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32。C轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)48或72小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-18g/l;K2HP04-1.8g/l;MgS04—1.2g/l;CaCOr20g/l;硫胺-0.1mg/l;蔗糖-60g/l;氨節(jié)青霉素-300mg/1，如果必要的話；IPTG-0.5mM,如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定。可以通過薄層色譜法領啶培養(yǎng)基中纈氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，乙酸乙酉旨-80ml，NH4OH(30%)-15rnl，水-45ml。結(jié)果見表3。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了纈氨酸產(chǎn)生菌株H-81的纈氨酸積累量。表3:有質(zhì)粒的1PTG48小時72小時H-81OD540Val,g/1Val/ODOD540Val,g/1Val/ODNO-3411.60.343210.30.32+3411.70.343010.10.34pAlacZ-3410.50.313010.00.33+207.80.39259.00.36pYGAZH-2910.50.363112.80.41+2210.80.492312.30.53參考實施1:通過avA缺陷型L"脯氨酸菌株生產(chǎn)L-脯氨酸野生型大腸桿菌K12菌株(VKPMB-7)細胞，在37"C經(jīng)過誘變劑N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(0.1mg/ml)處理后20分鐘，清洗后涂布在附加1.25mg/ml蛋白胨，10mg/mlL-脯氨酸，0.05mg/l2,3,5-氯化三苯基四唑的低瓊脂M9培養(yǎng)基上。在37。C經(jīng)過3天培養(yǎng)后大多數(shù)生長出的菌落是紅色。少數(shù)不能氧化L-脯氨酸的菌落為白色。其中的一個菌落被用親本來獲得對(3,4-二氫脯氨酸和氮雜環(huán)丁烷-2-羧化物)有抗性的突變體，氨基酸類似物被以2mg/ml的濃度加入到M9瓊脂培養(yǎng)基中。生成的突變體中的一些菌株能生產(chǎn)L-脯氨酸。最好的L-脯氨酸產(chǎn)生菌株702是用在ilvA基因被插入的氯霉素(Cm)抗性基因(CmO打斷的菌株TG1上生長的噬菌體P1處理的。獲得的Cm抗性轉(zhuǎn)導體，702ilvA，變成了L-異亮氨酸缺陷型，比L-異亮氨酸營養(yǎng)型的親本702具有更高的L-脯氨酸生產(chǎn)能力(見表4)。發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括60g/l蔗糖，硫酸胺,2g/lK2HP04,MgSO4，0.1mg/l硫胺，50mg/L1-異亮氨酸和25g/l白堊(pH7.2)，蔗糖和白堊單獨滅菌。在試管內(nèi)放入2ml培養(yǎng)基，接種一環(huán)被測試的微生物，在37。C振蕩培養(yǎng)2天。21表4:菌株表型脯氨酸積累量-K12野牛型<0.1702(VKPMB-薩)L掘氨酸P絲早缺陷型，脯氨麟似物抗性0.5702ilvA(VKPMB-8012)L-脯氨酸,缺陷型，脯氨酸類似物抗性，L"異亮氨酸營IN5央陷型，Cn/8.0菌株702和菌株702ilvA己經(jīng)分別于2000年6月25日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏(Russia113545,Moscow,1Dorozhnyproezd,1)，保藏號為VKPMB-8011和VKPMB-8012。實施例5:用含有質(zhì)粒pYGAZH的菌株生產(chǎn)脯氨酸月甫氨酸生產(chǎn)菌株702ilvA是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。將菌株702ilvA,作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株702ilvA(p△lacZ)和菌株702ilvA(pYGAZH)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S04-18g/l;K2HP03-1.8g/l;MgS04—l,2g/l;硫胺-O.lmg/1;酵母提取物-0.5g/l;蔗糖-60g/l;異亮氨酸-50mg/l;如果必要的話氨芐青霉素-300mg/1)，在32X:通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32"轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)40小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-18g/l;K2HP04-1.8g/l;MgS04-1.2g/l;CaCO3-20mg/l;硫胺-0.1mg/l;蔗糖-60g/l;異亮氨酸-50mg/l;22氨節(jié)青霉素-300mg/1,如果必要的話；IPTG-0.5mM,如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中脯氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，NH4OH(30%)-5ml，7jC-25ml。結(jié)果見表5。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了脯氨酸產(chǎn)生菌株702ilvA的脯氨酸積累量。有質(zhì)粒的702ilvAIPTG40小時OD540Pro,g/1Pro/ODNO-254.00.16+234.10.18pAlacZ-245.30.22+225.00.23pYGAZH-215.00.24+2310.60.46參考實施2:通過ilvE缺陷型L-亮氨酸菌株生產(chǎn)L-亮氨酸野生型大腸桿菌K12菌株(VKPMB-7)細胞，在37i:經(jīng)過誘變劑N-甲基-N—硝基—N一亞硝基狐(0.05mg/ml)處理后2。5H中，用生理溶液清1先4次后后涂布在附加4.0DL-氮雜亮氨酸的低瓊脂M9培養(yǎng)基上。在37。C經(jīng)過5天培養(yǎng)后，挑出生長出的藤客在L-瓊脂平歡劃線純化。獲得的能抵抗DL-氮雜亮氨酸的突變體中的一個11P皮用來誘導L-異亮氨酸和L-纈氨酸的雙營養(yǎng)缺陷型。獲得的菌株大多數(shù)需要L-異亮氨酸和L-纈氨酸才能生長，這表明，雙營養(yǎng)缺陷型菌株是依賴與ilvE基因的突變才形成的。在獲得的雙營養(yǎng)缺陷型菌株中，選出了最好L-亮氨酸生產(chǎn)菌株505，產(chǎn)量為1.8g/Ll-亮氨酸。發(fā)酵培養(yǎng)基成分包括:60g/l蔗糖，25g/i硫翻安，2g/lK2HPO4,lg/lMgSO4,0.1mg/l硫胺，100mg/Ll-異亮氨酸，100mg/Ll-纈氨酸和25g/1白堊(pH7.2)，蔗糖和白堊-^4蟲滅菌。在試管內(nèi)方j(A2ml培養(yǎng)基，接禾中一環(huán)被測試的微生物，在37。C振蕩培養(yǎng)2天。大腸桿菌菌株505已經(jīng)分別于2001年5月14日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏，(Russia113545,Moscow,1Dorozhnyproezd,1)，保藏號為VKPMB-8011和VKPMB-8124，并于2002年根據(jù)布達佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。實施例6:用含有質(zhì)粒pYGAZH的菌株生產(chǎn)亮氨酸亮氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌505是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。將菌株505，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株505(pAlacZ)和菌株505(pYGAZH)各取20個菌落接種一環(huán)于加有附加或未附加氨芐青霉素的L-肉湯培養(yǎng)的20-ml的試管中，在32'C通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.1ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中(內(nèi)徑22mm)，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32"C轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)72小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NHt)2S04-15g/l;K2HP04-1.5g/l;MgS04X7H2O1.0g/l;CaCO3-20g/l;(單獨滅菌)硫胺-OJmg/l;蔗糖-60g/l;(單獨滅菌)異亮氨酸-03g/l;纈氨酸-0.3g/l;氨芐青霉素-150mg/1，如果必要的話；IPTG-0.5mM,如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540腿處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中亮氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，乙酸乙酉旨-80ml，NH4OH(30%)-25ml，7K-50ml。結(jié)果見表6。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了亮氨酸產(chǎn)生菌株505的亮氨酸禾只累量。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>進一步，通過整合來源于枯草芽孢桿菌屬的pycA基因(俄羅斯專利申請99121636)將噬菌體Pl介導的ppc基因缺失引入到菌株28，結(jié)果菌株218pycA失去了對正亮氮酸的抗性。所以，可以用上述方法重新給予菌株對正亮氨酸的抗性。在獲得的菌株中，最好L-甲硫氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌菌株73，在上述條件下，產(chǎn)量約為1.0g/lL-甲硫氨酸。大腸桿菌菌株73已經(jīng)于2001年5月14日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏，保藏號為VKPMB-8126，并于2002年根據(jù)布達佩斯條約由最初的保藏轉(zhuǎn)為國際保藏。實施例7:用含有質(zhì)粒pYGAZH的菌株生產(chǎn)甲硫氨酸甲硫氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌73是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b2682和b2683基因的質(zhì)粒pYGAZH轉(zhuǎn)入而得到的。將菌株73，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株73(pAlacZ)和菌株73(pYGAZH)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((Nil)2S04-18g/l;K2HPOr1.8g/l;MgS04—1.2g/l;硫胺-0.1mg/l;酵母提取物-10g/l;蔗糖-60g/i;蘇氨酸-400mg/l;如果必要的話氨-節(jié)青霉素-300mg/1)，在32。C通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32t:轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)48小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-1%1;K2HP04-1.8g/l;MgS04-l，；CaCOr20mg/l;硫胺-0.1mg/l;蔗糖-60g/l;蘇氨酸-400mg/l;酵母提取物-10g/l;氣節(jié)青霧素-300mg/1,如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法湖,菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中甲硫氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80rnl，乙酸乙酯-80ml，NH4OH(30%)-15ml，水-45ml。結(jié)果見表7。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYGAZH提高了甲硫氨酸產(chǎn)生菌株73的甲硫氨酸積累量。表7:有質(zhì)粒的73LPTG48小時OD540Met,g/1Met/ODNO-450.70.016+42U0.026p△lacZ-451.00.022pYGAZH-480.90.019+461.30.028實施例8:用含有質(zhì)粒pYCHE的菌株生產(chǎn)蘇氨酸蘇氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌VL2054是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b1242基因的質(zhì)粒pYCHE轉(zhuǎn)入而得到的。得到的菌株被命名為VL2054pYCHE。將菌株VL2054，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株VL2054(pAlacZ)和菌株VL2054(pYCHE)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S04-llg/l;NaCl-0.4g/l;MgS04』.4g/l;K2HPOrl^l;FeS〇4-10mg/l;MnSO4-10mg/l;硫胺-0.1mg/l;酵母提取物-0.5g/l;蔗糖-40g/l;如果必要的話氨芐青霉素-300mg/1)，在32'C通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32T:轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)45小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-22g/l;NaCl-0.8g/l;MgSO4~0,8g/l;K2HPOr2g/l;FeSO4-20mg/l;MnSO4-20mg/l;硫胺畫0.2mg/l;酵母提取物-lg/l;CaCO3-30g/l;蔗糖-80g/l;氨節(jié)青霉素-300mg/1,如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中蘇氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-50ml，丙酮-50ml，NH4OH(30%)-12ml，水-8ml。結(jié)果見表8。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYCHE提高了蘇氨酸產(chǎn)生菌株VL2054的蘇氮酸積累表8:<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實施例9:用含有質(zhì)粒pYCHE的菌株生產(chǎn)纈氨酸纈氨酸生產(chǎn)菌株H-81過將含有處于POJV5啟動子控制下的b1242基因的質(zhì)粒pYCHE轉(zhuǎn)入而得到的。將作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株H-81(pAlacZ)和菌株H-81(pYCHE)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S〇4-18g/l;K2HP04-1.8g/l;MgS04—1.2g/l;硫胺-0.1mg/l;酵母提取物-0.5g/l;蔗糖-60W;如果必要的話氨芐青霉素-300mg/1)，在通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32"C轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)45小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-18g/l;K2HP04-1.8g/l;MgS04—1.2g/l;CaCOr20g/l;硫胺-0.1mg/l;蔗糖誦60g/l;氨節(jié)青霉素-300mg/1，如果必要的話；IPTG-0.5mM，如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nrn處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中纈氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，乙酸乙酯-80ml，NH4OH(30%)-15ml，水-45ml。結(jié)果見表9。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYCHE提高了纈氨酸產(chǎn)生菌株H-81的纈氨酸積累量。表9:有質(zhì)粒的H-81IPTGOD540Val,g/1Va]/ODNO-3411.60.34+3411.70.34pAlacZ-3410.50.31+207.80.39pYCHE-3214.00.44+3013.90.46實施例10:用含有質(zhì)粒pYHGN的菌株生產(chǎn)精氨酸精氨酸生產(chǎn)菌株382是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b3434基因的質(zhì)粒pYHGN轉(zhuǎn)入而得到的。獲得的菌株382已經(jīng)于2000年4月10日在俄羅斯國家工業(yè)微生物收集中心(VKPM)保藏，(Russia113545，Moscow,1Dorozhnyproezd,1)，保藏號為VKPMB-7962。將菌株382，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株382(pAlacZ)和29菌株382(pYHGN)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S04-25^1;K2HP04-2.0g/l;MgS047H2O1.0g/l;硫胺-0.2mg/l;酵母提取物-5g/l;蔗糖-60g/l;如果必要的話氨芐青霉素-300mg/1)，在通風^[牛下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.21111菌液轉(zhuǎn)移到三個201111的試管中，加入2ml加或不加EPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32"C轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)72小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-K2HPO4-2.0g/l;MgS047H2O1.0g/l;硫胺-(X2mg/l;酵母提取物-5g/l;蔗糖-60g/l;CaCO3-20g/l;氨芐青霉素-100mg/1,如果必要的話；IPTG-0.5mM,如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nrn處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中精氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，乙酸乙酉旨-40ml，，NH4OH(30%)-25ml，水-50ml。結(jié)果見表10。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYHGN提高了纈氨酸產(chǎn)生菌株382的纈氨酸積表10:<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實施例ll:用含有質(zhì)粒pYHGN的菌株生產(chǎn)脯氨酸脯氨酸生產(chǎn)菌株702ilvA是通過將含有處于PlacUV5啟動子控制下的b3434基因的質(zhì)粒pYHGN轉(zhuǎn)入而得到的。將菌株702ilvA，作為對照的含有未插入部分的質(zhì)粒的菌株702ilvA(p△lacZ)和菌株702ilvA(pYHGN)各取5個菌落，在20-ml的試管中懸浮于2ml最小培養(yǎng)基上((NH4)2S04-18g/l;K2HP03-1.8g/l;MgS04—1.2g/l;硫B安-0.1mg/l;酵母提取物-0.5g/l;蔗糖-60g/l;異亮氨酸-50mg/l;如果必要的話氨芐青霉素-300mg/1)，在32。C通風條件下培養(yǎng)過夜。每個培養(yǎng)物的0.2ml菌液轉(zhuǎn)移到三個20ml的試管中，加入2ml加或不加IPTG的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，在32。C轉(zhuǎn)動振蕩培養(yǎng)40小時。發(fā)酵培養(yǎng)基成分(NH4)2S04-18g/l;K2HP04-1.8g/l;MgS04-1.2g/l;CaCO3-20mg/l;硫胺-0.1mg/l;蔗糖-60g/l;異亮氨酸-50mg/l;氛節(jié)青霉素-300mg/1,如果必要的話；IPTG-0.5mM,如果必要的話；在培養(yǎng)后，通過傳統(tǒng)的方法測得菌液在540nm處光吸收值確定質(zhì)粒的穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^薄層色譜法測定培養(yǎng)基中脯氨酸的積累量。薄層色譜法的液相如下異丙醇-80ml，NH4OH(30%)-5ml，7K-25ml。結(jié)果見表ll。正如看見的，雜合質(zhì)粒pYHGN提高了脯氨酸產(chǎn)生菌株702ilvA的脯氨酸積累量。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>序列表<110〉味之素株式會社〈120〉通過大腸桿菌屬細菌生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130〉P-8206F<140〉<141>2002--<150>RU2001103865<151〉2001-02-13<150〉RU2001104998〈151〉2001-02-26<150>RU2001104999<151〉2001-02-26<150〉RU2001117632〈151〉2001-06-28<150>RU2001117633<151>2001-06-28<160〉16〈170〉PatentlnVer.2.0<210>1〈211〉26<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列描述引物〈400>1ggtctagacaatcgttaagcgtacac26〈210>2〈211〉26<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>人工序列描述引物<400>2ccggatccgatatagtaacgacagtg26<210>3<211〉738<212〉DNA<213〉大腸桿菌(Escherichiacoli)<220〉〈221〉CDS〈222〉(1)..(735)3atggaaMetGlu1g肌ggaGluGlygcctttAlaPhega_3ageGluSer50gtcattVallie65ctgaccLeuThrctgcgtLeuArgtgggcgTrpAlaagecctSerProtgcCysgcgAla35gttValageSertttPheLys20ttcPhetttPheaccgcgThrAlagtcatgValMetcgtArg100ggcGlyactThr5g￡icAspggtGlyttcPheatgMetgcaAla85attliecceiPro￡lgtSerctgLeutecSerctgLeu70atgMetattliecagcctgetGinProAlattaLeuaatAsntgcCys55gcaAlaccgattProlie25gcgaccAlaThr40ateattlieliegccgggAlaGlygatgttcgcAspValArgctgacgLeuThrCElgGingatAspcgtctgArgLeu105gsggttGluValcctggtProGly10gttattValliecgtctgArgLeutatgcaTyrAla站tagtSerSer75catgtgHisVal90GinLystttgccPheAlateggcgaccSerAlaThragttatattSerTyrlie30ggattctctGlyPheSer45ggcgcgageGlyAlaSer60ttgtggattLeuTrpliettgtatggcLeuTyrGlytegaaaaccSerLysThr110gccgcaaccAlaAlaThrttcatgPheMet15ccggtgProValcctetcProteucagttcGinPhegetgcaAlaAla80ccgteaProSer95gccctgAlaLeugesaa_aAlaLys489614419224028833638434115ctggtacgcaatLeuValArgAsn130gccttcagtteaAlaPheSerSer145ttctecggcagePheSerGlySerttaggttttatgLeuGlyPheMet180ttccagcgcaaaPheGinArgLys195cttgcaggcgtaLeuAlaGlyVal210attgtctgtggclieValCysGly225gcgcccgatgagAlaProAspGlu120aatcgccgctggAsnArgArgTrp135tggteategtggTrpSerSerTrp150ggcttgctgcaaGlyLeuLeuGin165cttccggcaetcLeuProAlaLeucaatctctttgcGinSerLeuCys200acgetattttctThrLeuPheSer215tgcetcactgcgCysLeuThrAla230etatgaLeu245125agegagaactggatgSerGluAsnTrpMet140gtatttggtacggtaValPheGlyThrVal155ggttatcccgccgttGlyTyrProAlaVal170tttatgagtttcctgPheMetSerPheLeu185gttaccgcagcgttaValThrAlaAlaLeu205attcccgtcgccattlieProValAlalie220ttaatecaggcattcLeulieGinAlaPhe235ateggcatt432lieGlylieataggggca480lieGlyAla160gaagetgca528GluAlaAla175etcgcctct576LeuAlsSer190gttggtgcc624ValGlyAlactggcaggc672LeuAlaGlytggcaagga720TrpGinGly240738<210>4<211>245<212>PRT〈213〉大腸桿菌(Escherichiacoli)<400>4MetGluSerProThrProGinProAlaProGlySerAlaThrPheMet151015GluGlyCysLysAspSerLeuProlieVallieSerTyrlieProVal202530AlaPheAlaPheGlyLeuAsnAlaThrArgLeuGlyPheSerProLeu354045GluSerValPhePheSerCyslielieTyrAlaGlyAlaSerGinPhe505560VallieThrAlaMetLeuAlaAlaGlySerSerLeuTrplieAlaAla65707580LeuThrValMetAlaMetAspValArgHisValLeuTyrGlyProSerLeuArgTrpAlaLeuVal130AlaPhe145PheSerLeuGlyPheGinLeuAla210lieVal225AlaProSerPhe115ArgSerGlyPheArg195GlyCysAsp85Arglie100GlyLeuAsnAsnSerTrpSerGly165MetLeu180LysGinValThrGlyCysGluLeu245lieThrArgSer150LeuProSerLeuLeu230GinAspArg135SerLeuAlaLeuPhe215ThrArgGlu120TrpTrpGinLeuCys200SerAlaLeu105ValSerValGlyPhe185VallieLeu90GinPheGluPheTyr170MetThrProlieLysSerAlaAlaAsnTrp140GlyThr155ProAlaSerPheAlaAlaValAla220GinAla235LysAla125MetThr110Thrlie95AlaAlaGlyLeuLyslieVallieGlyAla160ValGluAlaAla175LeuLeuAlaSer190ValGlyAla205lieLeuAlaGlyPheTrpGinGly240〈210〉5〈211〉336〈212〉腿〈213〉大腸桿菌(Escherichiacoli)<220〉〈221〉CDS〈222>(1)..(333)<400〉5atgagetatgagMetSerTyrGlu1tattgcttccgcTyrCysPheArg20ccaaccsaacgtProThrLysArg35gcctcgatatgcAlaSerlieCysgttctgctgcttValLeuLeuLeu5tatttgccgctgTyrLeuProLeuggcgcggtaggtGlyAlaValGly40getctgctggttAlaLeuLeuValgggUaetagttggcGlyLeuLeuValGly10cgcctgcgtgtgggtArgLeuArgValGly25attttgetcgacacclieLeuLeuAspThr45gtctctaccgcaccaValSerThrAl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eLeu160ctgatgggaLeuMetGly175ggcattcgaGlylieArg190384432480528576594〈210〉16〈211〉197<212>PRT<213〉大腸桿菌(Escherichiacoli)<■〉16MetAsnGlu1ProProLeuLeu65PheSerProLeuLysVal50SerLeuGlyLeuGlyArg35MetLeulieLeuVal115lieAsn20ArgLeuArgAlaPro100Alalie5LeuArgValAlalie85AlaGlySerProAlaPheGlu70LysGlyProlielieLeu55Thr■MetGluThrAlaPheMet40PheVallieGlulie120ValLeuLeu10MetSerVal25ValArgGluAlaGlyGluSerlieSer75PheProSer90ProPhelie105LeuAlaThrlieLeuLeuLysLeuLeu45Lyslie60GlyGlyAlaSerValProLeuMet125lieMetAsp15HisThrGlu30lieAlaLeuLeuAlaPhelielieLeu80GlyAsnSer95LeuAlalie110LeuLeuSerHisGinTyrProAsnGinMetGlyHisLeuVallieAlaLeuLeuLeu130135140AlaTrpGlyGlyThrPheVallieLeuLeuGinSerSerLeuPheLeu145150155160ArgLeuLeuGlyGluLysGlyValAsnAlaLeuGluArgLeuMetGly165170175LeulieLeuValMetMetAlaThrGinMetPheLeuAspGlylieArg180185190MetTrpMetLysGly19權利要求1.一種屬于埃希氏菌屬的L-氨基酸生產(chǎn)細菌，其中該細菌經(jīng)過修飾以致于該細菌的L-氨基酸生產(chǎn)通過提高以下A)定義的蛋白質(zhì)在所述細菌細胞中的活性來提高A)包含序列表中SEQIDNO11所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。2.根據(jù)權利要求1的細菌，其中A)定義的蛋白質(zhì)的活性ffi31將編碼A)定義的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)4Wt細菌，或M改變細菌染色體上戶，DNA的，調(diào)，，列來提高。3.根據(jù)權利要求2的細菌，其中其中的轉(zhuǎn)化是通過多拷貝載體進行的。4.一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求1-3中任一項的細菌并從培養(yǎng)基中收集產(chǎn)生并積累的L-氨基酸。5.根據(jù)權禾腰求4的方法，其中戶腿的L-氨基酸是L-蘇氨酸。6.根據(jù)權利要求5的方法，其中通過增加蘇氨酸操縱子的拷貝數(shù)或改變蘇氨酸操縱子的表達調(diào)控序列對所述細菌進行了修飾，以致于該細菌提高了蘇氨酸操縱子的。7.根據(jù)權利要求4方法，所述的L-氨基酸是L-纈氨酸。8.根據(jù)權利要求7方法，其中M31增加//v操縱子的拷貝數(shù)或改變//v操縱子的表達調(diào)控序列對戶，細菌進行了1針布，以致于該細菌提高了//v操縱子的表達。全文摘要本發(fā)明提供了一種使用埃希氏菌屬細菌生產(chǎn)L-蘇氨酸，L-纈氨酸，L-脯氨酸，L-亮氨酸，L-甲硫氨酸和L-精氨酸的生產(chǎn)方法。所述細菌的L-氨基酸生產(chǎn)能力通過提高b2682和b2683基因，或b1242基因，或b3434基因編碼的蛋白質(zhì)的活性被提高。文檔編號C12P13/04GK101597588SQ200910159448公開日2009年12月9日申請日期2002年2月13日優(yōu)先權日2001年2月13日發(fā)明者E·A·塔波利納,E·B·沃羅施洛瓦,E·M·霍爾格斯,K·V·賴巴克,M·M·古斯亞蒂納申請人:味之素株式會社