專(zhuān)利名稱(chēng)：：熱穩(wěn)定的高溫酸性α-淀粉酶基因、工程菌、重組酶及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。涉及一種熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶及其某因和歪組酶，包括熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶基因的表達(dá)載體；本發(fā)明還涉及其基因T程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157(已f2007年9月06日保藏在中國(guó)微牛物菌種保藏管理委員會(huì)普通微牛物中心，保藏編號(hào)為CG:M:CCNo.2i57);本發(fā)明還涉及該齒株產(chǎn)重組熱穩(wěn)定卨溫酸性u(píng)-淀粉酶方法與產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
：a—淀粉酶為a-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(a-1，4-glucan-4-gluca加hydrolaseEC.3.2丄1),是最軍:要的工業(yè)酶制劑之一，已被廣泛應(yīng)用在食品、發(fā)酵、紡織、造紙和制藥等諸多行業(yè)。目前工業(yè)用a—淀粉酶主要來(lái)自嗜熱脂肪地芽孢桿菌(GeobacillusstearothermopMus)和地衣芽孢樸菌(Bacilluslicheniformis),這些酶的最適作用條件為90。C和pH6，存在的主要問(wèn)題是熱穩(wěn)定性差，高于i00。C和pH低于6.0時(shí)易失活，熱穩(wěn)定性依賴(lài)cf。超嗜熱微生物由于能產(chǎn)生在a溫下活性a，且具有很好熱穩(wěn)定性的超卨溫酶，而成為研究的熱點(diǎn)。超嗜熱微生物處于特殊的物理、化學(xué)和生態(tài)環(huán)境，使它們形成了極為特殊的生物結(jié)構(gòu)、代謝機(jī)制，導(dǎo)致來(lái)fi超嗜熱微生物的超高溫酶具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，顯示了其獨(dú)特的特性具有極高的熱穩(wěn)定性，通常能抵抗化學(xué)變性劑如表面活性劑、有機(jī)溶劑和高酸高堿環(huán)境，其催化功能優(yōu)于g前在各種工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的酶。因此，超高溫酶己作為研究酶的進(jìn)化、酶的穩(wěn)定性和酶的活性機(jī)制、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系以及生物催化性的模型。目前國(guó)外研究的超高溫酶在分子牛物學(xué)、淀粉加工、纖維素的降解、乙醇的生產(chǎn)及化學(xué)合成工業(yè)已有廣泛的應(yīng)用(Vieilleetal.，2()()1)，已有卨溫聚合酶、糖酶、淀粉酶、蛋白酶等兒種極端酶開(kāi)始工業(yè)化生產(chǎn)，并且已經(jīng)創(chuàng)造了數(shù)十億美元的經(jīng)濟(jì)效益(肖湘等，2006)?？梢栽?0-nox:范圍內(nèi)生長(zhǎng)的超高溫菌，是a-淀粉酶最重要的潛在來(lái)源，國(guó)外已報(bào)道產(chǎn)高溫a—淀粉酶的超嗜熱微生物主要為烏茲熾熱球菌(Pyrococcuswoesei)，強(qiáng)烈'識(shí)!冉J求菌(P,furiosus)，!冉7JC高i顯I求菌(ThermococcushydrothermaHs)、Thermococcusprofundus、Desulfurococcusmucosus、Pyrodictiumabyssi、海生葡萄狀嗜熱菌(Staphylothermusmarinus)、嗜熱網(wǎng)絡(luò)球桿菌(:Dictyoglomusthermop'hilum)，海棲熱袍菌(Thermotogamaritime),其中來(lái)源于Pyi'ococcuswoesei、Pyi'ococcusfuriosus、Thermococcushydrothe皿alis、Thermococcusprofundus禾口Thermotogamaritime等中a-淀粉酶基岡已被克隆和表達(dá)到常溫宿主細(xì)胞巾。國(guó)內(nèi)近幾年開(kāi)展了從超嗜熱微生物中克隆a-淀粉酶基因的研究，如將強(qiáng)烈熾熱球菌的a-淀粉酶基因在不同常溫宿主中表達(dá)，以及海棲熱袍菌的a-淀粉酶基因在大腸桿菌屮的表達(dá)的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是從嗜熱古菌中克隆-一種熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶的基因。本發(fā)明的熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶基因來(lái)自超嗜熱古菌嗜熱球菌ThermococcussicuirH:j2i菌株。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是根據(jù)NC:Bi中已報(bào)道的超嗜熱古菌a-淀粉酶的基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法獲得了超嗜熱古齒嗜熱球菌ThermococcussiculiHJ21a—淀粉酶基因的保守序列，采用SiteFinding-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得超嗜熱古茼嗜熱球茼ThermococcussiculiHJ21.a—淀粉酶基岡兩端的序列。通過(guò)序列分析和拼接獲得了1374bp完整的超嗜熱古菌嗜熱球菌ThermococcussiculiHJ21a-淀粉酶基因。測(cè)定了其堿棊序列，如序列表SEQIDNO.l.所示本發(fā)明的另一目的是提供包括上述熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶基因堿基序列的表達(dá)載體。其是用常規(guī)方法將本發(fā)明的熱穩(wěn)定高溫酸性a—淀粉酶基因的堿基序列連接f各種載休上構(gòu)建而成，該載休可以是市售的質(zhì)粒、粘粒、噬菌休或病毒載休等。較佳的是將PCR技術(shù)擴(kuò)增到的熱穩(wěn)定卨溫酸性a—淀粉酶基因產(chǎn)物和克隆載體pM::D18-T連接，形成克隆載體pMD18-T-amy,p:MD18-T-amy和表達(dá)載體p:Et-28a-His6分別用限制性?xún)?nèi)切酶消化，形成互補(bǔ)的粘性末端，經(jīng)T4連接酶連接，形成熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶基因表達(dá)載體pEt-28a-ffis6-amy。本發(fā)明的再一目的是提供一種某因工程菌株，其是將包含本發(fā)明熱穩(wěn)定高溫酸性a—淀粉酶基因堿基序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中得到的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157，如將表達(dá)載休pEt-28a-His6-amy轉(zhuǎn)化其中得到含有表達(dá)載休pEt-28a-ffis6-amy的大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pEt-28a扭s6-amyo本發(fā)明的乂-'目的是提供-'種制備重組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶的方法，其包括用k述木發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得重組的熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)歪組表達(dá)載體，在一優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案本發(fā)明使用BL21(DE3)。以上技術(shù)方案中所有基本分了生物操作均參照"分了克隆實(shí)驗(yàn)指南"(第三版，科學(xué)出版社，2002年)本發(fā)明的^溫a-淀粉酶不僅可以水解淀粉，對(duì)于由葡萄糖以a-1,4糖苷鍵聚合的多糖都有.'定的催化能力。嗜熱古菌來(lái)源于太平洋深海熱液口，最適生長(zhǎng)溫度為88"C。由于嗜熱古茼生長(zhǎng)條件苛刻，人工培養(yǎng)困難，同時(shí)所含高溫a—淀粉酶的產(chǎn)量比較低，因此不能直接利用古生菌來(lái)生產(chǎn)a-淀粉酶。解決上述問(wèn)題的有效方法就是利用棊因工程的方法將該基因轉(zhuǎn)入一種容易培養(yǎng)的宿主里面，進(jìn)行表達(dá)。基f這一理論我們將高溫a-淀粉酶的基因?qū)氪竽c樸菌，進(jìn)行表達(dá)。對(duì)來(lái)源于太平洋深?；馃嵋嚎诘氖葻峁啪?通過(guò)培養(yǎng)、目的基因釣取，得到本發(fā)明所述高溫a-淀粉酶基因，基因測(cè)序工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。序列如SEQIDNO.l所示。我們將高溫a-淀粉酶基因重組到T系統(tǒng)載體上，然后轉(zhuǎn)入到大腸桿菌宿主巾，得到一株基岡工程茼株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157，已于2007年9月06日保藏在l卜:l微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物屮心，保藏編號(hào)為CGMCCNo.2157，保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路?；蚬こ叹磉_(dá)產(chǎn)物是細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白，通過(guò)超聲波破碎、加熱失活大腸樸菌雜蛋白，即nj進(jìn)行分離純化得到重組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶。本發(fā)明還具體公開(kāi)了一種用以上技術(shù)方案中所述的基因工程菌株大腸埃希氏齒EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157產(chǎn)重組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶的制備方法，其步驟如F，(l)將基因工程菌株以1X的接種量接入裝有50m:L:LB(蛋白胨，1%;酵母粉，0.5%;NaCl，1%;pH7.0)培養(yǎng)基的250mL三角瓶屮，在37°C，180轉(zhuǎn)/分———F搖床培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)菌液的OD,達(dá)到l.O時(shí)，再加入濃度為lmmol■L—'誘導(dǎo)劑IPTG，誘導(dǎo)4h,得發(fā)酵液；(2)將發(fā)酵液i3000Xg離心5min后去掉上淸，用3m:L牛理鹽水懸浮細(xì)胞，l:醫(yī)Xg離心5min去掉....匕清，重復(fù)此操作一次；用3mL蒸餾水充分懸浮細(xì)胞，()。C水浴中經(jīng)超聲波破碎5min,13000Xg離心10min取上淸液即得重組熱穩(wěn)定高溫酸性a—淀粉酶的粗酶液；(3)將制取的粗酶液用80。C水浴中處理30min，13000Xg離心10min取上清液，再用DEAE離子交換層析和Ni親和JS析的方法對(duì)至組酶進(jìn)行純化，即得。以上技術(shù)方案所述的方法得到的重組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶的性質(zhì)為該酶的分了量為約50KD;最適作用溫度9(rC，在95。C和l()(rC分別有90%和7()%的酶活力；該酶熱穩(wěn)定性不依賴(lài)于Ca2、酶液分別在80、90、iO(TC保溫5'h后，其殘余酶活分別為82%、77%和69%;該酶的作用pH范圍為pH49,最適作用pH為5.05.5,在pH4.5有81%的殘余酶活；在80°C和901:下該酶在pH59和pH58的范圍內(nèi)穩(wěn)定，該酶在100tMh，pH57.5的范闈內(nèi)穩(wěn)定；金屬離子K—'—、Na+對(duì)酶有激活作用，Hg2"、:Pb2+、Al3+、Cu2+、Fe3+和Zn2+能夠抑制酶活性;lmmmol-L-1和5mmmo1七-1N-溴代丁二酰亞胺對(duì)酶的活性具有抑制作川；該酷的Km為45mg'mi;1，Vmax為9mg.ml4.min1;該酶分解馬鈴薯淀粉為麥芽'始和4T-1唐。應(yīng)用大腸桿菌工程菌EHJ21表達(dá)高溫蛋白經(jīng)活性實(shí)驗(yàn)鑒定，具有a-淀粉酶活性，該高溫蛋白即為所述的重組熱穩(wěn)定高溫酸性a—淀粉酶。重組熱穩(wěn)定卨溫酸性a-淀粉酶具有普通a-淀粉酶所不具備的特點(diǎn)，能在7()100。C高溫下催化反應(yīng)，有很強(qiáng)的抗高溫和化學(xué)物質(zhì)變性劑的作用；運(yùn)用到生產(chǎn)中，有儲(chǔ)運(yùn)成木低、加快動(dòng)力學(xué)反應(yīng)、對(duì)冷卻器系統(tǒng)要求標(biāo)準(zhǔn)低等優(yōu)點(diǎn)。重組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶可應(yīng)用于淀粉水解，催化淀粉液化，在食品工業(yè)、生物化工，醫(yī)藥業(yè)等領(lǐng)域具有軍:要的應(yīng)ltj潛力。圖l為本發(fā)明熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶基因的PCR擴(kuò)增圖譜，其中，M:DNAMarker,i，2:為a—淀粉酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2為pMD18-T-amy的構(gòu)建圖。圖3為本發(fā)明克隆質(zhì)粒p:M:D18-T-amy的EcoRI和SalI:雙酶切分析圖譜，其中，M，DNAMarker,1，pMD18-T-amydigestedbyEcoRI/SalI。圖4為軍:組表達(dá)載體pEt-28a-His6-amy的構(gòu)建圖。圖5為本發(fā)明表達(dá)質(zhì)粒pEt-28a-His6-amy經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切分析圖譜，其中，Ml，M2，DMAMarker;1，a-淀粉酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2,EcoRI&Sall;3，pEt-28a-His6-amy/EcoRI:。圖6為本發(fā)明基因工程菌株表達(dá)產(chǎn)物重組熱穩(wěn)定^溫酸性a-淀粉酶的SDS-PAGE電泳圖，其中，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1,2，純酶；3，Ni親和^析；4，D:EAE離子夂換層析；5:加熱處理；6，粗酶液；7，活性帶。圖7為溫度對(duì)重組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶酶活力的影響圖。圖8為pH溫度對(duì)繭組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶酶活力的影響圖。圖9為重組熱穩(wěn)定高溫酸性a—淀粉酶的溫度穩(wěn)定性圖。圖10為重組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶的pH穩(wěn)定性圖。圖ii為重組a—淀粉酶水解可溶性淀粉的Lineweaver-Burk圖。圖12為重組熱穩(wěn)定卨溫酸性a-淀粉酶水解'纟鈴薯淀粉產(chǎn)物薄層層析圖，1-4為1、6、16、24h;Gl，葡萄糖；G2，麥芽糖；G3，左芽三糖；G4,麥芽四糖；G5，麥芽五糖；G6，麥芽六糖；G7，麥芽七糖。具體實(shí)施例方式以下參照附圖，進(jìn)一歩描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步地理解本發(fā)明，rfn不構(gòu)成對(duì)其權(quán)利的限制。K列實(shí)施例中的材料與方法為所采用的分子克隆技術(shù)參見(jiàn)J.莎畝布魯克等編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。所使用的工具酶購(gòu)自大連寶生物公司和....匕海生工生物工程公司，具體的反應(yīng)條件和使用方法均參考商品說(shuō)明書(shū)。所使用的膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，使用方法均參考商品說(shuō)明書(shū)。實(shí)施例1。從ThermococcussiculiHJ21克隆熱穩(wěn)定高溫酸性a—淀粉酶基因。根據(jù)NCBI屮已報(bào)道的超嗜熱古菌a-淀粉酶的雄閑序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法獲得了ThermococcussiculiHJ21a—淀粉酶基因的保守序列，采用SiteFinding-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得ThermococcussiculiHJ21a—淀粉酶基因兩端的序列。通過(guò)序列分析和拼接獲得了i374bp完整的ThermococcussiculiHJ2ia-淀粉酶基因(見(jiàn)圖丄)，其堿基序列如SEQIDNo.l所示，編碼成熟肽的DNA的大小1374bp。實(shí)施例2。克隆質(zhì)粒pM:D18-T-amy的構(gòu)建。根據(jù)實(shí)施例l.得到的a-淀粉酶的基岡序列，設(shè)計(jì)正向引物1和反向引物2。在引物1加上EcoRI酶切位點(diǎn)，在引物2加上Sail酶切位點(diǎn)。引物l.序列5，GCGCGAATTCATGAACAGGGGTATAT-3'，劃線部分為EcoRI位點(diǎn)。引物2序列5，-TAGTCGACTCAGCCCACCCCACAG-3,劃線部分為SalI位點(diǎn)。以ThermococcussiculiHJ21基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1，擴(kuò)增出的片段約1400'bp，與預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。PCR產(chǎn)物電泳，利用TaKaRa公司GelExtractionKit試劑盒割膠回收純化。與pMD18-T載體連接，構(gòu)建了克隆質(zhì)粒pMD18-Lamy(見(jiàn)圖2)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白菌落初步篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)一歩將重組質(zhì)粒用EcoRI和SalI同時(shí)進(jìn)行雙酶切后電泳檢領(lǐng)U，在1.4kb處"-條特異性亮帶(見(jiàn)圖3)，證明所選重組了為陽(yáng)性克隆，與已經(jīng)獲得的淀粉酶基因序列對(duì)比表明序列完全正確。實(shí)施例3。表達(dá)載體pEt-28a-His6-amy的構(gòu)建。重組T-載體(pMD18-T-amy)和pEt-28a-:ffis6分別進(jìn)行EcoRI和SalI雙酶切，其酶切反應(yīng)體系(20PL)如下10XbufferH2uLEcoRI(或SalI)(l()U.u1uLpEt-28a-His6(或PCR產(chǎn)物)14uL將pMD18-T-amy進(jìn)行EcoRI和SalI雙酶切，膠回收1/lkb條帶，對(duì)pEt-28a質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和SalI雙酶切，膠回收5.6kb的條帶；將前后兩次膠回收產(chǎn)物混合，i6°C連接18h(如圖4)，構(gòu)建了N端含有A個(gè)組氨酸標(biāo)簽的表達(dá)載體pEt-28a-His6-amy。外源基因在E.coli表達(dá)吋，為'/簡(jiǎn)化表達(dá)產(chǎn)物的純化步驟，通常添加His、M:BP等標(biāo)簽，使表達(dá)產(chǎn)物可以通過(guò)M-NTA層析柱純化(Schliebenetal.，2004)。岡此在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)在N端添加了:ffis。標(biāo)簽。重組質(zhì)粒pEt-28a-扭s。-amy經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切，電泳驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)在1,4kb左右處出現(xiàn)一條亮帶，證明軍:組i—F.確，見(jiàn)圖5。實(shí)施例4。一種用于表達(dá)實(shí)施例1所述的熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157,它是將實(shí)施例3所述的表達(dá)載休pEt-28a-His6-amy轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliB:L2i(:DE3)中得到的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMC:CNo2157。實(shí)施例5。-'種用實(shí)施例4所述的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo21.57產(chǎn)重組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶的制備方法，其步驟如卜.，(1.)將棊因工程菌株以1%的接種量接入裝有50mLLB培養(yǎng)某的25()mL三角瓶中，在37。C，180轉(zhuǎn)/分下?lián)u床培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)菌液的ODe。。達(dá)到1.0時(shí)，再加入濃度為lmmolL-1誘導(dǎo)齊IJIPTG，誘導(dǎo)4h，得發(fā)酵液;(2)將發(fā)酵液i3000Xg離心5min后去掉上淸，用3m:L牛理鹽水懸浮細(xì)胞，l:醫(yī)Xg離心5min去掉....匕清，重復(fù)此操作一次；用3mL蒸餾水充分懸浮細(xì)胞，()。C水浴中經(jīng)超聲波破碎5min,13000Xg離心10min取上淸液即得重組熱穩(wěn)定高溫酸性a—淀粉酶的粗酶液；(3)將制取的粗酶液用80。C水浴中處理30min，13000Xg離心10min取上清液，再用DEAE離子交換層析和Ni親和JS析的方法對(duì)至組酶進(jìn)行純化，即得。上述歩驟(3)采用加熱處理、DEAE離子交換層析、Ni親和層析的方法對(duì)重組酶的粗酶液進(jìn)行了純化(見(jiàn)表l)，在SDS-PAGE上a-淀粉酶的活性染色帶與考馬斯亮藍(lán)染色帶一致，其分子量為50KDa(見(jiàn)圖6)。表1粗酶液的純化<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例6。實(shí)施例5所制得的重組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究。[ooeo](1—)溫度對(duì)酶活力的影響。將酶分別在50、60、70、80、85、90，95和IO(TC水浴中進(jìn)行酶活測(cè)定。用pH5.0的乙酸鈉溶液配置的1%(w，"淀粉溶液作為作用底物。至組a-淀粉酶的最適作用溫度9CTC時(shí)，在95。C和100。C分別:"90%和70%的酶活力(見(jiàn)圖7)。(2)pH對(duì)酶活力的影響。將酶液與在不同pH的i%(wv1)的可溶性淀粉溶液中在95T下進(jìn)行酶活力測(cè)定。采用兩種方法配制不同pH的lX(wv,的可溶性淀粉溶液，第一種方法為不同pH值的緩沖液為50mmol.L—1檸檬酸鈉緩沖液(pH3.04.0);50mmo1L—1乙酸鈉緩沖液(pH4.06.0);5()mmo1L-1磷酸鈉緩沖液(pH6.07.5);5()腿01'L-'Tris-鹽酸緩沖液(pH7,59,0)。第二種方法用各種不同pH的Britton-Robinson緩沖液(pH41l)(Rauenetal.，1964)。ig組a—淀粉酶的作j-tjpH范圍為pH49，最適作用pH為5.5,在pH4.5和pH5.0分別閂、-f/81%和93%的相對(duì)酶活(見(jiàn)圖8)。(3)溫度對(duì)酶熱穩(wěn)定性的影響。將酶分別在80、90和iOO。C的水浴中保溫進(jìn)行溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)，同時(shí)在每個(gè)溫度下增加一組含有5mmo1L—1Ca21的酶液，用以驗(yàn)證該酶的熱穩(wěn)定性是否依賴(lài)Ca2+，每個(gè)溫度保溫5h,每隔l'h取出.'組樣品，迅速置T冰水中，待保溫結(jié)束后統(tǒng).-進(jìn)行酶活力測(cè)定，以未處理酶液作為對(duì)照。重組a-淀粉酶熱穩(wěn)定性好，酶液分別在80、90、100。C分別保溫5h后，其殘余活性分別為82%、77%和69%(見(jiàn)圖9)。(4)pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。將酶液與不同pH的伯瑞坦-羅賓森(Britton-Robinson)緩沖液pH4.59混合，分別在8()、9()和l()()t:的水浴中保溫lh后取測(cè)定殘余酶活，以未處理的酶液的酶活設(shè)為丄00%。在不同pH的伯瑞坦-羅賓森緩沖液中分別在80、90和iOO。C處理丄'h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在8()"C和9()'C下該酶在pH59和pH58的范圍內(nèi)均有較好的穩(wěn)定性，該酶在10(TC下pH穩(wěn)定范圍變窄，只在pH57.5范圍內(nèi)M示較好的穩(wěn)定性。在三個(gè)溫度下pH5.5穩(wěn)定，pH5.0和pH6.0的穩(wěn)定性也很好，相對(duì)酶活均在80%以l:，見(jiàn)圖10。(5)金屬離子或化學(xué)試劑對(duì)酶活性的影響。將各種金屬離子與酶液混合，使其最終濃度分別達(dá)到1..()mmol■L—1和5.0mmo卜L入然后在9(TC下測(cè)酶活。將各種常用化學(xué)試劑與酶液混合，使其最終濃度分別為lmmol.U1和5mmo1.L—1測(cè)酶活，均以未處理的酶液的酶活設(shè)為100%。金屬離了K+、Nai對(duì)酶有激活作用，Kg,Pb2+、Afi、Cu2+、Fe3+和Zi^等能夠強(qiáng)烈的抑制酶活性(見(jiàn)表2)。lmmmol■L—1的尿素、碘乙酸、EDTA和DTT溶液對(duì)酶的抑制作用較弱，而lmmmol.:L"和5mmmo1.:L"NBS對(duì)酶的活性具有較強(qiáng)抑制作用(見(jiàn)表3)。表2金屬離子對(duì)歪組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶影響金屬離子1mmolLT15mmolLT1MetalionCa2+97.5±3.481.2±3.6Co2+81.8±0.153.0±2.1Ba2+111.6±6.298.4±0.8Hg2+32.7±2.80.0±0.0IT116.2±0.497.1±2.1Pb2+0.0±0.00.0±0.0Mn2+46,6±0.68.1±0.0Ni+57,4±0.121.3±3.0Mg2+100.2±3.526.0±0.9Si>111.3±0.845.5±2.1Li+103.8±0.362.7±0.6Ag+Al3+112.0±0.2106.9±3.00±0.01.1±0.0Cu2+O士O.OO士O.ONa+102.6±0.3109.5±1.6Fe3+0.0±0.00.0±0.0Zn2+3.3±9.71.1±0.0表3化學(xué)試劑對(duì)重組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶影響變性劑degenaration1mmolLT15mmol.LT尿素ureau95.0±0.17104.8±0.56SDS101.2±2.0374.9±1.83三氯乙酸TCA0.8±0.490碘乙酸Iodoaceticacid85.0±4.350EDTA67.9±2.8422.1±1.03N-溴代丁二酰亞胺O土O.O0±0.0(NBS)N-Bromosuccinimide二硫蘇糖醇112.1±0.49106.1±5.26Drthiothreitol_(6)酶動(dòng)力學(xué)研究。選擇適當(dāng)?shù)膎j溶性淀粉濃度梯度進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)研究，梯度為2、3、'1、5、8、丄0、15、20、30和40g.:L—'，反應(yīng)休系為取i90uL不同濃度的淀粉溶液加入淀粉酶1()PL，于9()。C下準(zhǔn)確反應(yīng)1()min,取出If^迅速加入2()()uLDNS沸水浴5min，加入3mL蒸餾水，在520nm下測(cè)定吸光值。以fH濃度的可溶性淀粉作為底物，對(duì)重組的純化淀粉酶進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定，根據(jù)Lineweaver-Burk理論，由方程V1=Km'Vmax1'S—i+Vmax1求得該酶的Km為45mg.m:L—1，Vmax為9.0mg.ml—1mn—:l(見(jiàn)圖11)。(7)虛組熱穩(wěn)定高溫酸性ci—淀粉酶水解產(chǎn)物特異性研究。以1%(w.v。的馬鈴薯淀粉作為底物，襯-ii升底物溶液中加入100UL稀釋的酶液，置f9(rC水浴中，分別反應(yīng)l、6、16和2他，取不同反應(yīng)時(shí)間的產(chǎn)物進(jìn)行高效薄層層析，展劑使用正丁醇、乙酸和水的混合物，顯色劑為5%濃硫酸和乙醇溶液，使用噴霧器將顯色劑均勻噴撒到千燥后的薄層板上，置于1()5。C下顯色2()3()min。該重組超卨溫a-淀粉酶可以很好的水解馬鈴薯淀粉，在作用lh后既已將馬鈴薯淀粉糊精化，繼續(xù)反應(yīng)后形成含麥芽糖在內(nèi)的一系列寡糖，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)糊精逐漸減少，麥芽寡糖含量逐漸升高，連續(xù)作用24h后層析圖中未發(fā)現(xiàn)葡萄糖生成(見(jiàn)圖12)，表明該重組a-淀粉酶分解馬鈴薯淀粉，其主要產(chǎn)物是麥芽糖和麥芽三糖。SEQIDNO.l<11()>淮海工學(xué)院<120>熱穩(wěn)定的高溫酸性a-淀粉酶基因、工程菌、重組酶及應(yīng)用<15()>2()()81()()21753.5<151>2008-08-12<160>1<170>:Patentnversion3,3<210>1<211>1862<212>DNA<2L3>ThermococcussiculiHJ2丄<4()()>1:0091]cgcgaaagctgcgagctgtgcgagaaggcaaagcgcgtcaagaatctcatcgaactctaa60:0092]cttttttcccactattgaaacacgacgttccattttcaacacttaatcccatgttctttt120:0093]acgtcctttoatg腺catto站g她Mgctto組站ttcaccgc伊gtg站站Mtot180:0094]gggcacgtgcccaaatagatacgtgggggattgccatgaacaggggtatattggcggcac24-0:0095]tggtgatagccctggttgtcttaagcgtctctgctgtccctgcaaaggccgagacccttg300:0096]aaaacggcggagtgataatgcaggccttctactgggacgtccccggtgggggaatctggt360:0097]gggacaccatagcccagaagataccagactgggcgagcgcaggaatttcggcaatatgga420:0098]ttccccccgcgagc牆gggc噸agcggcggctectccatgggctocgatccctocgact4-80:0099]acttcgacctcggcgagtactaccagaagggaaccgttgagacccgcttcggctccaagg540:0100]ccgagctggtgaacatgataaacaccgcccacgcctacaacatgaaggtcatagccgaca600:0101]tagtcatcaaccaccgcgccggcggagacctcgagtggaaccccttc魄aacgactaca660:0102]cctggaccgacttctccaaggttgcctccggcaagtocaccgccaactocctcgacttcc720:0103]acccgaacgagcttcacgcgggcgattccggaacctttggcggctatccggacatatgcc780:0104]acgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctacgccgcctacc840:0105]tcaggagcatcggcgttgatgcctggcgcttcgactacgtgaagggctacggcgcttggg900:0106]tggtcaaggactggctcagctggtggggcggctgggcggtaggagagtactgggacacca960:0107]acgtcg噸ccctcctg堪ctgggcctocgac紹cggtgccaaggtcttcgacttcccgc1020:0108]tctactacaagatggacgaggccttcgataacaacaacattcccgcgctggtagatgccc1080<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求一種熱穩(wěn)定高溫酸性α-淀粉酶基因，其特征在于，它具有序列表中的SEQIDNO.1所示的堿基序列。2.-浙熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶，其特征在T，它具有序列表中S:EQI::DNO.l所示的堿基序列編碼的蛋白序列。3.--種堿基序列的表達(dá)載體，其特征在于，它是包括權(quán)利要求l所述的熱穩(wěn)定高溫酸性a—淀粉酶基因的堿基序列的表達(dá)載體pEt-28a-His6-amy。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，它由下列方法制得將權(quán)利要求l所述的熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶基因的堿基序列擴(kuò)增，與質(zhì)粒pMD18-T載體連接，得到克隆載休pMDi8-T-amy,再將克隆載休pM:Di8-T-amy和表達(dá)載休pEt-28a-His6分別經(jīng)EcoRI和Sail雙酶切后連接得到表達(dá)載體pEt-28a-ffis6-amy。5.-f巾用T表達(dá)權(quán)利耍求2所述的熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶的基因工程菌株大腸埃希氏茼EHJ21.(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.21.57，其特征在于，它是將權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)載體pEt-28a-Hivamy轉(zhuǎn)化到人腸桿菌E.coHBL21(DE3)中得到的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMC:CNo.2157。6.-—種用權(quán)利要求5所述的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EschericWacoliEHJ21)CGMCCNo.2157產(chǎn)重組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶的制備方法，其特征在f,其步驟如(1)將基因工程齒株以1%的ft種一接入裝有5()mLLB培養(yǎng)基的25()mL二角瓶中，在3rC，180轉(zhuǎn)/分下?lián)u床培養(yǎng)，當(dāng)仏;'「茵液的CO,達(dá)到1.0時(shí)，再加入濃度為lmmol'L-1誘導(dǎo)劑IPTG，誘導(dǎo)4h，得發(fā)酵液；(2)將發(fā)酵液13000Xg離心5mfn后去掉上清，用3mL生理鹽水懸浮細(xì)胞，13000Xg離心5min去掉上清，歪復(fù)此操作一次；用3mL蒸餾水充分懸浮細(xì)胞，()。C水浴屮經(jīng)超聲波破碎5min，13000Xg離心10min取上清液即得重組熱穩(wěn)定高溫酸性a—淀粉酶的粗酶液；(3)將制取的粗酶液用80。C水浴中處理30min，i3000Xg離心i0min取上淸液，再用DEAE離子交換層析和Ni親和層析的方法對(duì)重組酶進(jìn)行純化，即得。7.-'種如權(quán)利耍求6所述方法得到的重組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶，其特征在丁-:該酶的分子量為50KD;適合作用溫度9(rC，在95。C和l()(rC分別有9()%和70%的酶活力；該酶熱穩(wěn)定性不依賴(lài)于Ca2—，酶液分別在80、90、100"C保溫5h后，其殘余酶活分別為82%、77%和69%;該酶的作J1:jpH范圍為pH4.9，適合作用pH為5.05.5，在pH4.5:"81X的殘余酶活；在80。C和90i:下該酶在pH59和pH58的范圍內(nèi)穩(wěn)定，該酶在10()lMh，pH57.5的范圍內(nèi)穩(wěn)定；金屬離了K—'—、Na+對(duì)酶有激活作用，Hg2+、Pb2+、Af丄、Cu2+、:Fe3+和Zn2丄能夠抑制酶活性;丄mmmol-L-1和5mmmo1.L—'N-溴代丁二酰亞胺對(duì)酶的活性具有抑制作用；該酶的Km為45mg'mL—、Vmax為9mg'ml—1,in1;該酶分解馬鈴薯淀粉為麥芽糖和麥芽三糖。8.—種如權(quán)利要求7所述重組熱穩(wěn)定高溫酸性a-淀粉酶在淀粉水解中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種來(lái)自超嗜熱古菌嗜熱球菌(ThermococcussiculiHJ21)編碼熱穩(wěn)定高溫酸性α-淀粉酶基因，提供了該基因序列；提供了含有該基因序列的表達(dá)載體pEt-28a-His6-amy和表達(dá)該熱穩(wěn)定的高溫酸性α-淀粉酶的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(EscherichiacoliEHJ21)CGMCCNo.2157；本發(fā)明還提供了利用該基因工程菌株表達(dá)的重組熱穩(wěn)定高溫酸性α-淀粉酶的制備方法及酶性質(zhì)與應(yīng)用。文檔編號(hào)C12R1/01GK101691576SQ20091016337公開(kāi)日2010年4月7日申請(qǐng)日期2009年8月13日優(yōu)先權(quán)日2009年8月13日發(fā)明者劉姝,劉紅飛,呂明生,房耀維,王淑軍,秦松,陸兆新申請(qǐng)人:淮海工學(xué)院