專利名稱：：與人結(jié)腸癌相關(guān)的基因和多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物科學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及癌癥研究領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及與細(xì)胞增殖機(jī)制有關(guān)的新基因"WW3，CX4Z)^L7和GCT/Z)/以及由這些基因編碼的多肽。本發(fā)明的基因和多肽可用于例如診斷細(xì)胞增殖性疾病，以及用作靶分子來開發(fā)針對所述疾病的藥物。
背景技術(shù)：
：胃癌和結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的誘因。盡管最近在診斷和治療策略方面取得了進(jìn)步，但晚期癌癥患者的預(yù)后仍然很差。盡管分子研究揭示出腫瘤抑制基因和/或癌基因的改變與癌癥發(fā)生有關(guān)，但其精確的機(jī)理仍有待闡明。cDNA微陣列技術(shù)使人們能夠獲得正常和惡性細(xì)胞中基因表達(dá)的全面分布圖，并能比較惡性和相應(yīng)正常細(xì)胞中的基因表達(dá)(Okabeetal.,CancerRes61:2129-37(2001);Linetal"Oncogene21:4120-8(2002);Hasegawaetal"CancerRes62:7012-7(2002))。該方法能披露癌癥細(xì)胞的復(fù)雜性質(zhì)，并有助于人們了解癌癥發(fā)生的機(jī)理。鑒定出腫瘤中的失控基因能夠更準(zhǔn)確地診斷個(gè)體癌癥，并可開發(fā)新的治療把(BienzandClevers,Cell103:311-20(2000))。為了從整個(gè)基因組的角度揭示腫瘤發(fā)生的機(jī)理，并且找出用于診斷和新型治療藥開發(fā)的靶分子，本發(fā)明人使用23040個(gè)基因的的cDNA微陣列來分析腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)分布圖(Okabeetal.，CancerRes61:2129-37(2001);Kitaharaetal"CancerRes61:3544-9(2001);Linetal"Oncogene21:4120-8(2002);Hasegawaetal.,CancerRes62:7012-7(2002》。被設(shè)計(jì)用于揭示癌癥發(fā)生機(jī)理的研究推動了抗-腫瘤藥劑分子靶的鑒定。例如，最初被開發(fā)用于抑制與Ras有關(guān)的生長-信號傳導(dǎo)途徑、其激活依賴于翻譯后法尼基化的法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)能在動物模型中有效治療Ras-依賴型腫瘤(Heetal.，Cell9—9:335-45(1999))。聯(lián)合使用抗癌藥物和抗-HER2單克隆抗體trastuzumab對人進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，以抵銷原癌基因受體HER2/neu的作用；在乳腺癌患者身上已獲得改善的臨床反應(yīng)和整體存活率(Linetal.,CancerRes61:6345-9(2001))。選擇性失活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制劑STI-571被開發(fā)用于治療慢性骨髓性白血病，其中bcr-abl酪氨酸激酶的組成型激活對白細(xì)胞轉(zhuǎn)化起決定性作用。這些類型的藥劑被設(shè)計(jì)用于抑制特定基因產(chǎn)物的致癌活性(Fujitaetal.,CancerRes61:7722-6(2001))。因此，通常在癌細(xì)胞中被上調(diào)的基因產(chǎn)物可用作開發(fā)新抗癌藥劑所用的潛在靶。已闡明CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)能識別MHCI類分子上呈遞的腫瘤-相關(guān)抗原(TAA)所衍生的表位肽，并能裂解腫瘤細(xì)胞。由于MAGE家族是作為第一例TAA被發(fā)現(xiàn)的，因此，使用免疫學(xué)方法已發(fā)現(xiàn)了多種其它的TAA(Boon,IntJCancer54:177-80(1993);Boonand穆derBruggen,JExpMed183:725-9(1996);vanderBruggenetal"Science254:1643-7(1991);Brichardetal.,JExpMed178:489-95(1993);Kawakamietal.,JExpMed180:347-52(1994))。目前，一些已發(fā)現(xiàn)的TAA作為免疫治療的靶正處于臨床研發(fā)階段。迄今為止已發(fā)現(xiàn)的TAA包括MAGE(vanderBruggenetal"Science254:1643-7(1991))、gp1OO(Kawakamietal"JExpMed180:347-52(1994))、SART(Shichijoetal"JExpMed187:277-88(1998))和NY-ESO-l(Chenetal.，ProcNatlAcadSciUSA94:1914-8(1997))。另一方面，已證實(shí)在肺瘤細(xì)胞中特異性過表達(dá)的基因產(chǎn)物能作為誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的靶被識別。所述基因產(chǎn)物包括p53(Umanoetal"BritJCancer84:1052-7(2001))、HER2/腿(Tanakaetal"BritJCancer84:94-9(2001))、CEA(Nukayaetal.,IntJCancer80:92-7(1999))等。盡管已在與TAA有關(guān)的基礎(chǔ)和臨床研究中取得了顯著進(jìn)步(Rosenbegetal.,NatureMed4:321-7(1998);Mukherjietal.，ProcNatlAcadSciUSA92:8078-82(1995);Huetal.,CancerRes56:2479-83(1996)),但僅有少量候選TAA可用于治療腺癌，包括結(jié)直腸癌。能在癌細(xì)胞中大量表達(dá)，同時(shí)其表達(dá)也僅局限于癌細(xì)胞的TAA是理想的免疫治療候選靶。另外，鑒定能誘導(dǎo)強(qiáng)有力的特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答的新TAA有望促進(jìn)肽免疫策略在多種類型的癌癥中的臨床使用(BoonandcanderBruggen,JExpMed183:725-9(1996);vanderBruggenetal.,Science254:1643-7(1991);Brichardetal.,JExpMed178:489-95(1993);Kawakamietal"JExpMed180:347-52(1994);Shichijoetal.,JExpMed187:277-88(1998);Chenetal.,ProcNatlAcadSciUSA94:1914-8(1997);Harris,JNatlCancerInst88:1442-5(1996);Butterfieldetal"CancerRes59:3134-42(1999);Vissersetal"CancerRes59:5554-9(1999);vanderBurgetal"JImmunol156:3308-14(1996);Tanakaetal"CancerRes57:4465-8(1997);Fujieetal,,IntJCancer80:169-72(1999);Kikuchietal.,IntJCancer81:459-66(1999);Oisoetal.,IntJCancer81:387-94(1999))。據(jù)重復(fù)報(bào)道，得自某些健康供體的經(jīng)肽刺激的外周血單核細(xì)胞(PBMC)對肽反應(yīng)產(chǎn)生顯著水平的IFN-y,但在51Cr-釋放試驗(yàn)中卻很少以HLA-A24或-A0201限制性方式發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性(Kawanoetal.,CanceRes60:3550-8(2000);Nishizakaetal"CancerRes60:4830-7(2000);Tamuraetal"JpnJCancerRes92:762-7(2001))。然而，HLA-A24和HLA-A0201是日本人以及白種人中最常見的HLA等位基因之一(Dateetal.,TissueAntigens47:93-101(1996);Kondoetal.,JImmunol155:4307-12(1995);Kuboetal.，JImmunol152:3913-24(1994);Imanishietal"ProceedingoftheeleventhInternationalHictocompatibilityWorkshopandConferenceOxfordUniversityPress,Oxford,1065(1992);Williamsetal,,TissueAntigen49:129(1997))。因此，由這些HLA呈遞的癌癥抗原肽對于治療日本人和白種人的癌癥特別有用。另外，已知低-親和性CTL的體外誘導(dǎo)通常是因?yàn)槭褂昧烁邼舛鹊碾?，在抗原呈遞細(xì)胞(APC)上產(chǎn)生了高水平的特定肽/MHC復(fù)合物，而所述復(fù)合物能有效激活這些CTL(Alexander國Milleretal.，ProcNatlAcadSciUSA93:4102-7(1996》。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供與胃癌或結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖機(jī)理有關(guān)的新蛋白質(zhì)和編碼所述蛋白質(zhì)的基因，以及所述蛋白質(zhì)和基因的制備方法和使用它們診斷和治療胃癌或結(jié)直腸癌的方法。為了揭示胃癌和結(jié)直腸癌的癌癥發(fā)生機(jī)理，并鑒定出新的診斷標(biāo)記和/或治療這些腫瘤的藥物靶，本發(fā)明人使用含有23040個(gè)基因的全-基因組cDNA微陣列分析了基因在胃和結(jié)腸癌癥發(fā)生中的表達(dá)分布圖。從藥物學(xué)的觀點(diǎn)看，在實(shí)際操作中抑制致癌信號比激活腫瘤-抑制效應(yīng)更加容易。因10此，本發(fā)明人檢索了在胃和結(jié)腸癌癥發(fā)生過程中被上調(diào)的基因。從在胃癌中一般被上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物中，將新的人基因CXlDW/(柯薩奇病毒和腺病毒受體樣1)和GCCZD"在胃癌中被上調(diào))分別定位于染色體帶3ql3和7p14。CX4Z)iZ7或GC77Z)7的基因轉(zhuǎn)移促使細(xì)胞增殖。另外，通過轉(zhuǎn)染其特異性的反義S-寡核苷酸或小的干擾RNA來降低CX4Di^/或GCtZD7表達(dá)即可抑制胃癌細(xì)胞生長。很多抗癌藥物，如DNA和/或RNA合成抑制劑、代謝抑制因子和DNA嵌入劑不僅對癌細(xì)胞有毒，對正常生長的細(xì)胞也有毒。然而，抑制CXADRL1表達(dá)的藥劑對其它器官卻沒有不利的作用，這是.因?yàn)樵摶虻恼１磉_(dá)局限于睪丸和卵巢，因此所述藥劑對治療癌癥非常重要。另外，從在結(jié)直腸癌中一般被上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物中，鑒定出定位于染色體帶17pter-pl3.1的基因iiVF43(環(huán)指蛋白43)。另外，酵母雙-雜合篩選試驗(yàn)(two-hybridscreeningassay)揭示出RNF43蛋白與NOTCH2或STRIN結(jié)合。NOTCH2是大的跨膜受體蛋白，該蛋白質(zhì)是進(jìn)化上保守的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)機(jī)制的組分。NOTCH2是Notch信號傳導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)成員，據(jù)報(bào)道，它與腎臟中的腎小球發(fā)生以及心臟和眼血管系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)(McCrightetal.:Development128:491-502(2001))。據(jù)報(bào)道，三種5/Serrate/Lag隱2(DSL)蛋白，即51、Jaggaedl和Jaggaed2是NOTCH2的功能配體(Shimizuetal.,MolCellBiol20:6913-22(2000))。通過包括受體的蛋白酶解和NOTCH蛋白胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核轉(zhuǎn)位的過程，在細(xì)胞內(nèi)傳遞由Notch信號傳導(dǎo)途徑中的配體結(jié)合誘導(dǎo)的信號(有關(guān)評述可參見Artavanis-Tsakonasetal.，AnnuRevCellBiol7:427-52(1999);Weinmaster，CurrOpinGenetDev10:363-9(2000))。另外，通過轉(zhuǎn)染與i^A^^相對應(yīng)的特異性反義S-寡核苦酸或小的干擾RNA來降低i^F43表達(dá)即可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長。如上所述，很多抗癌藥物不僅對癌細(xì)胞有毒，對正常生長的細(xì)胞也有毒。然而，能抑制RNF43表達(dá)的藥劑對其它器官卻沒有不利的影響，這是因?yàn)樵摶虻恼１磉_(dá)局限于胎兒，更具體地為胎肺和胎腎，因此所述藥劑對治療癌癥非常重要。因此，本發(fā)明提供了分離的新基因CX4D/I7，GC77D/和iWFW,這些基因是候選的癌癥診斷標(biāo)記，并且是可用于開發(fā)新診斷策略和有效抗癌劑的理想的潛在靶。另外，本發(fā)明提供了由這些基因編碼的多肽及其制備方法和用途。更具體地，本發(fā)明提供了下述內(nèi)容ii本申請?zhí)峁┝诵碌娜硕嚯腃XADRLl,GCUD1和RNF43或其功能等同物，所述多肽能促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且在如胃癌和結(jié)直腸癌的細(xì)胞增殖疾病中被上調(diào)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，CXADRL1多肽包括推定的431個(gè)氨基酸長的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)與CXADR(柯薩奇病毒和腺病毒受體)有約37%的同一性。CXADRL1由SEQIDNO:l的開放閱讀框編碼，并在密碼子29-124和158-232處含有兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，在密碼子246-268處含有跨膜結(jié)構(gòu)域。CXADRLI多肽優(yōu)選包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本申請還提供了由CX4Z)M7多核苷酸序列的至少一部分或與SEQIDNO:l所示序列至少30%、更優(yōu)選至少40%互補(bǔ)的多核苷酸序列編碼的分離的蛋白質(zhì)。另一方面，在優(yōu)選實(shí)施方案中，GCUD1多肽包括推定的414個(gè)氨基酸長的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由SEQIDNO:3的開放閱讀框編碼。GCUD1多肽優(yōu)選包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。本申請還提供了由GCW)/多核苷酸序列的至少一部分或與SEQIDNO:3所示序列至少15%、更優(yōu)選至少25%互補(bǔ)的多核苷酸序列編碼的分離的蛋白質(zhì)。另外，在優(yōu)選實(shí)施方案中，RNF43多肽包括推定的由SEQIDNO:5的開放閱讀框編碼的783個(gè)氨基酸長的蛋白質(zhì)。RKF43多肽優(yōu)選包括SEQIDNO:6所示的氨基酸序列，并且在密碼子272-312處含有環(huán)指基元。RNF43多肽與環(huán)指蛋白同系物DKFZp566H073.1(GenBank登錄號為T08729)的同源性為38%。本申請還提供了由iMW3多核苦酸序列的至少一部分或與SEQIDNO:5所示序列至少30%、更優(yōu)選至少40%互補(bǔ)的多核苷酸序列編碼的分離的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了新的人基因CX4DM/和GCt/D/,與相應(yīng)的非癌粘膜相比，在絕大多數(shù)胃癌中，所述基因的表達(dá)顯著升高。除了胃癌外，CXADRL1和GCUD1還在結(jié)直腸癌和肝癌中高表達(dá)。分離的CX4DiL7基因包括SEQIDNO:l所述的多核苷酸序列。CX4Z)處7cDNA特別地包括3423個(gè)核苷酸，其中含有1296個(gè)核苦酸長的開放閱讀框(SEQIDNO:1)。本發(fā)明還包括能與SEQIDNO:l所示多核苷酸序列雜交并與其至少30%、更優(yōu)選至少40%互補(bǔ)的多核苷酸，雜交和互補(bǔ)的程度應(yīng)使其能編碼CXADRL1蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQIDNO:l的筒并和等位突變體。另一方面，分離的GCt/D/基因包括SEQIDNO:3所述的多核苦酸序列。cDNA特別地包括4987個(gè)核香酸，其中含有1245個(gè)核苦酸長的開放閱讀框(SEQIDNO:3)。本發(fā)明還包括能與SEQIDNO:3所示多核苦酸序列雜交并與其至少15%、更優(yōu)選至少25%互補(bǔ)的多核苷酸，雜交和互補(bǔ)的程度應(yīng)使其能編碼GCUD1蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQIDNO:3的簡并和等位突變體。另外，本發(fā)明提供了新的人基因i^MW3，與相應(yīng)的非癌粘膜相比，在絕大多數(shù)結(jié)腸癌中，所述基因的表達(dá)顯著升高。除了結(jié)腸癌外，RNF43還在肺癌、胃癌和肝癌中高表達(dá)。分離的i^VFW基因包括SEQIDNO:5所述的多核苷酸序列。iA^V3cDNA特別地包括5345個(gè)核苷酸，其中含有2352個(gè)核苷酸長的開放閱讀框(SEQIDNO:5)。本發(fā)明還包括能與SEQIDNO:5所示多核普酸序列雜交并與其至少30%、更優(yōu)選至少40%互補(bǔ)的多核苷酸，雜交和互補(bǔ)的程度應(yīng)使其能編碼RNF43蛋白或其功能等同物。所述多核苷酸的例子是SEQIDNO:5的簡并和等位突變體。本文所用的分離基因是一種多核苷酸，其結(jié)構(gòu)與任何天然多核苷酸結(jié)構(gòu)或橫跨三個(gè)以上分離基因的天然基因組多核苷酸的任何片段的結(jié)構(gòu)都不相同。因此，該術(shù)語包括例如(a)具有生物體基因組中的天然基因組DNA分子的部分序列的DNA,所述DNA天然存在于所述生物體中；(b)以所得分子不同于任何天然載體或基因組DNA的方式摻入原核或真核載體或基因組DNA的多核香酸；(c)分離的分子，如cDNA、基因組片段、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段或限制性片段；和(d)重組核苷酸序列，其為雜合基因，即編碼融合多肽的基因的一部分。因此，本發(fā)明一方面提供了編碼本文所述多肽或其片段的分離的多核苷酸。優(yōu)選分離的多核苷酸包括與SEQIDNO:1，3或5所示核苷酸序列至少60%相同的核苦酸序列。更優(yōu)選分離的核酸分子與SEQIDNO:1,3或5所示核苷酸序列的同一性至少為65%,70%，75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%94%,95%，96%,97%，98%,99%或更高。當(dāng)分離的多核苦酸的長度長于或等于參照序列，如SEQIDNO:1,3或5時(shí)，與參照序列的全長進(jìn)行比較。當(dāng)分離的多核苷酸的長度短于參照序列，如短于SEQIDNO:1，3或5時(shí)，與相同長度的參照序列的區(qū)段進(jìn)行比較(排除同源性計(jì)算所需的任何環(huán))。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，所述方法是用編碼CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的多核脊酸序列轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且表達(dá)所述多核苷酸序列。另外，本發(fā)明提供了含有編碼CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的核苷酸序列的載體，和攜有編碼CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的多核苷酸的宿主細(xì)胞。所述載體和宿主細(xì)胞可用于生產(chǎn)CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白。本申請還提供了識別CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的抗體。在某種程度上還提供了CZ4Z)^L/,GCC/Z)7或^A^^基因的反義多核苦酸(如反義DNA)、核酶和siRNA(小的干擾RNA)。本發(fā)明還提供了診斷細(xì)胞增殖性疾病的方法，所述方法包括測定樣本生物樣品中基因的表達(dá)水平，將CX4Z)^L/，GC77ZX/4U^VFW基因的表達(dá)水平與正常樣品中的相比較，將樣品中CX4Z)^ZJ,GCt/D/威iWFW基因的高表達(dá)水平定義為患有細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥。適于通過CX4Z)i^7或GC[/i)7的表達(dá)水平診斷的疾病是胃癌、結(jié)直腸癌和肝癌；適于用J^7VFW的表達(dá)水平檢測的是結(jié)腸癌、肺癌、胃癌和肝癌。另外，還提供了篩選可用于治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法。所述方法包括使CXADRLl,GCUD1或RNF43多肽與受試化合物接觸，并選擇與CXADRLl,GCUD1或RNF43多肽結(jié)合的受試化合物。本發(fā)明還提供了篩選可用于治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括使CXADRLl,GCUD1或RNF43多肽與受試化合物接觸，并選擇能抑制CXADRL1,GCUD1或RNF43多肽的表達(dá)水平或生物活性的受試化合物。另外，本發(fā)明提供了篩選可用于治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括在受試化合物的存在下使CXADRL1與AIP1接觸，并選擇抑制CXADRL1與AIP1結(jié)合的受試化合物。另外，本發(fā)明提供了篩選可用于治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，其中所述方法包括在受試化合物的存在下使RNF43與NOTCH2或STRIN接觸，并選擇抑制RNF43與NOTCH2或STRIN結(jié)合的受試化合物。本申請還提供了用于治療細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥的藥物組合物。藥物組合物可以是例如抗癌劑。藥物組合物可被描述為分別如SEQIDNO:1,3或5所示和所述的CX4Z)虹人GC威iNF^多核苷酸序列的反義S-寡核苷酸或siRNA的至少一部分。適當(dāng)?shù)姆戳xS-寡核苷酸具有選自核苷酸序列SEQIDNO:23,25，27，29或31。包括具有SEQIDNO:23或25所示核苷酸序列的反義S-寡核苷酸的CX4DRL/反義S-寡核苷酸適用于治療胃癌；包括具有SEQIDNO:27或29所示核苦酸序列的反義S-寡核香酸的G07D/反義S-寡核香酸適用于治療胃癌、結(jié)直腸癌或肝癌；包括具有SEQIDNO:31所示核苷酸序列的反義S-寡核苷酸的7iW^反義S-寡核苷酸適用于治療結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌。適當(dāng)?shù)膕iRNA由一套核苷酸組成，所述核苷酸的序列選自SEQIDNO:40和41，42和43,或62和63。由一套核苷酸序列為SEQIDNO:40和41,或42和43的核苷酸組成的CX4D^ZJsiRNA適用于治療胃癌、結(jié)直腸癌或肝癌；由一套核苷酸序列為SEQIDNO:62和63的核苷酸組成的"W^siRNA適用于治療結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌。藥物組合物也可以含有通過本發(fā)明的治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的篩選方法所選擇的化合物。藥物組合物的作用過程需要抑制癌細(xì)胞的生長?？蓪⑺鏊幬锝M合物施用于哺乳動物，包括人和家養(yǎng)的哺乳動物。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明提供的藥物組合物治療細(xì)胞增殖性疾病的方法。另外，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括施用CXADRL1,GCUD1或RNF43多肽的步驟。預(yù)期施用CXADRL1，GCUD1或RNF43多肽能引發(fā)抗肺瘤免疫力。因此，本發(fā)明還提供了引發(fā)抗腫瘤免疫力的方法，所述方法包括施用CXADRLl,GCUD1或RNF43多肽，以及含有CXADRL1,GCUD1或RNF43多肽的治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物的步驟。應(yīng)理解不論是上文的發(fā)明概述還是下文的詳細(xì)描述都是優(yōu)選的實(shí)施方案，而不是對本發(fā)明或本發(fā)明的其它可替換實(shí)施方案的限制。圖la至ld顯示出爿5"S(CX4D^ZJ)和CW27(G07Z^)在胃癌中的表達(dá)。圖la顯示出通過cDNA微陣列檢測獲得的爿5^S在14個(gè)原發(fā)性胃癌中的相對表達(dá)率(癌癥/非-癌癥)。在穿過截留濾器(Cy3和Cy5信號都大于25，000)的14個(gè)胃癌中，所有胃癌中的A5^S表達(dá)被上調(diào)(Cy3:Cy5強(qiáng)度比率〉2.0)。圖lb顯示出通過cDNA微陣列檢測獲得的CS"7在12個(gè)原發(fā)性胃癌中的相對表達(dá)率(癌癥/非-癌癥)。在穿過截留濾器的12個(gè)胃癌中，10個(gè)胃癌中的CS"/表達(dá)被上調(diào)(Cy3:Cy5強(qiáng)度比率》.0)。圖lc顯示出使用IO個(gè)胃癌病例，經(jīng)半-定量RT-PCR分析獲得的CX4Z)iL/表達(dá)。圖ld顯示出使用9個(gè)胃癌病例，經(jīng)15半-定量RT-PCR分析獲得的GCUD/表達(dá)。將04尸D仔的表達(dá)用作CX4D^L7和GCC/D7表達(dá)分析的內(nèi)部對照。圖2a和2b顯示出CX4D^L/在多種人組織中的表達(dá)以及CXADRL1的推定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)基元。圖2a提供照片顯示出經(jīng)多組織Northern印跡分析獲得的CX!D/^/在多種人組織中的表達(dá)。圖2b顯示出CXADRL1的推定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。CX4Z)^L/cDNA由3423個(gè)核苷酸組成，其中具有1296個(gè)的核苷酸長的ORF,并且由7個(gè)外顯子組成。圖3a至3c顯示出CXADRL1的生長-促進(jìn)作用。圖3a提供照片顯示出被CK4D^Z:/轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞的集落形成試驗(yàn)結(jié)果。圖3b顯示出經(jīng)半-定量GL4尸Z)/Z的表達(dá)用作內(nèi)部對照。#2,#5,弁6和弁7皆表示被CXADRL1轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞。圖3c表示NIH3T3細(xì)胞的數(shù)目。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上看，NIH3T3-CXADRL1細(xì)胞在含有10。/。FBS的培養(yǎng)基中的生長要高于模擬(NIH3T3-LacZ)細(xì)胞(P〈0.05)。圖4顯示出被指定用于抑制CX4Z)iL7的反義S-寡核苷酸對MKN-l細(xì)胞的生長-抑制作用。經(jīng)證實(shí)CXADRL1-AS4和CXADRL1-AS5能抑制MKN-1細(xì)胞的生長。圖5A至5C顯示出CXADRU-siRNA對St-4細(xì)胞的生長抑制作用。圖5A提供照片顯示出(7^4/)見/和0^011(對照)在被模擬811^八或0:^\011]11-siRNA弁7轉(zhuǎn)染的St-4細(xì)胞中的表達(dá)。圖5B提供照片顯示出經(jīng)對照-siRNA或CXADRL1^1^八#7處理的存活細(xì)胞的Giemsa染色結(jié)果。圖5C顯示出經(jīng)對照質(zhì)?；虮磉_(dá)CXADRLl-siRNA7的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的MTT試驗(yàn)結(jié)果。圖6提供照片顯示出用抗-CXADRLl抗血清或抗-Flag抗體對表達(dá)經(jīng)Flag-標(biāo)記的外源性CXADRL1蛋白的細(xì)胞的免疫印跡分析結(jié)果。圖7顯示出通過酵母雙-雜合系統(tǒng)測定的CXADRLl和AIPl之間的相互作用。圖7提供照片顯示出通過雙-雜合系統(tǒng)測定的CXADRL1和AIP1之間的相互作用。圖8顯示出通過CXADRL1-207刺激產(chǎn)生的CTL系的肽特異性細(xì)胞毒性。CTL系對被CXADRL1-207脈沖的靶細(xì)胞(T2)顯示出高細(xì)胞毒活性，而對未經(jīng)肽脈沖的相同靶細(xì)胞(T2)未顯示出顯著的細(xì)胞毒活性。圖9顯示出CXADRLl-207CTL克隆對SNU475,MKN74和SNU-C4的細(xì)胞毒活性。CXADRL1-207CTL克隆對表達(dá)CXADRL1和HLA-A8150201的SNU475顯示出高細(xì)胞毒活性。另一方面，CXADRL1-207CTL克隆對表達(dá)CXADRL1但不表達(dá)HLA-A8150201的MKN74未顯示出顯著的細(xì)胞毒活性。另出顯著的細(xì)胞毒活性。圖IO顯示出未標(biāo)記靶的抑制試驗(yàn)結(jié)果。CXADRL1-207CTL克隆以HLA-A*0201限制性方式特異性識別CXADRLl-207。將用Na25icr04標(biāo)記的SNU475制備成經(jīng)標(biāo)記靶，而將經(jīng)CXADRL1-207肽-脈沖的T2(Peptide+)用作未標(biāo)記耙(抑制劑)。將E/T比率固定為20。加入用相同肽脈沖的T2可抑制對SNU475的細(xì)胞毒活性，而加入未經(jīng)肽脈沖的T2幾乎無抑制作用。圖ll顯示出阻斷試驗(yàn)的結(jié)果，該試驗(yàn)顯示出針對HLA-I類，HLA-II類，CD4和CD8產(chǎn)生的抗體對CXADRLl-207CTL克隆的細(xì)胞毒活性的作用。CXADRL1-207CTL克隆以HLA-I類和CD8限制性方式顯示出細(xì)胞毒活性。為了檢測用CXADRL1肽產(chǎn)生的CTL克隆的特征，檢測了針對HLA-I類，HLA-n類，CD4和CD8的抗體抑制細(xì)胞毒活性的能力。水平軸表示細(xì)胞毒性抑制作用的百分比。當(dāng)使用抗I類和CD8的抗體時(shí)，CTL克隆對SNU475靶的細(xì)胞毒性顯著降低。該結(jié)果表明CTL克隆以依賴于HLA-I類和CD8的方式識別書f生自CXADRL1的肽。圖12提供照片顯示出多種人組織中GCt/IX/的Northern印跡分析結(jié)果。GC77D/轉(zhuǎn)錄物的大小約為3.5-kb。圖13提供照片顯示出GCUD1的亞細(xì)胞定位，所述定位是通過免疫細(xì)胞化學(xué)在經(jīng)pcDNA3.1myc/His-GCUDl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上觀察得到的。經(jīng)cMyc-標(biāo)記的GCUD1蛋白表達(dá)自定位于胞質(zhì)中的質(zhì)粒。圖14提供照片顯示出通過集落形成試驗(yàn)檢查到的GCUD1對NIH3T3細(xì)胞的生長-促進(jìn)作用。圖15顯示出被指定用于抑制GC77D7的反義S-寡核苷酸對MKN-28細(xì)胞的生長-抑制作用。經(jīng)證實(shí)GCUDl-AS5和GCUDl-AS8能抑制MKN-28細(xì)胞的生長。圖16提供照片顯示出重組GCUD1蛋白的純化。圖17提供照片顯示出用抗-GCUDl抗血清或抗-Flag抗體對表達(dá)經(jīng)Flag-標(biāo)記的外源性GCUD1蛋白的細(xì)胞的免疫印跡分析結(jié)果。圖18A和18B顯示出通過GCUD1-196(A)或GCUD1-272(B)刺激產(chǎn)生的CTL系的肽特異性細(xì)胞毒性。CTL系對被GCUDl-196或GCUDl-272脈沖的靶細(xì)胞(T2)顯示出高細(xì)胞毒活性，而對未經(jīng)肽脈沖的相同靶細(xì)胞(T2)未顯示出顯著的細(xì)胞毒活性。圖19顯示出GCUD1-196CTL克隆對SNU475和MKN45的細(xì)胞毒活性。GCUD1-196CTL克隆對表達(dá)GCUD1和HLA-A承0201的SNU475顯示出高細(xì)胞毒活性。另一方面，GCUD1-196CTL克隆對表達(dá)GCUDl但不表達(dá)HLA-A*0201的MKN45未顯示出顯著的細(xì)胞毒活性。圖20顯示出未標(biāo)記耙的抑制試驗(yàn)結(jié)果。GCUD1-196CTL克隆以HLA-A*0201限制性方式特異性識別GCUD1-196。將用Na251Cr04標(biāo)記的SNU475制備成經(jīng)標(biāo)記靶，而將經(jīng)GCUDl-196肽-脈沖的T2(Peptide+)用作未標(biāo)記耙(抑制劑)。將E/T比率固定為20。加入用相同肽^P中的T2可抑制對SNU475的細(xì)胞毒活性，而加入未經(jīng)肽脈沖的T2幾乎無抑制作用。圖21顯示出阻斷試驗(yàn)的結(jié)果，該試驗(yàn)顯示出針對HLA-I類，HLA-II類，CD4和CD8產(chǎn)生的抗體對GCUD1-196CTL克隆的細(xì)月包毒活性的作用。GCUD1-196CTL克隆以HLA-I類和CD8限制性方式顯示出細(xì)胞毒活性。為了檢測用GCUD1肽產(chǎn)生的CTL克隆的特征，檢測了針對HLA-I類，HLA-II類,CD4和CD8的抗體抑制細(xì)胞毒活性的能力。水平軸表示細(xì)胞毒性抑制作用的百分比。當(dāng)使用抗I類和CD8的抗體時(shí)，CTL克隆對SNU475靶的細(xì)胞毒性顯著降低。該結(jié)果表明CTL克隆以依賴于HLA-I類和CD8的方式識別衍生自GCUD1的肽。圖22a至22b顯示出FZJ20W5在結(jié)腸癌中的表達(dá)。圖22a顯示出通過cDNA微陣列檢測獲得的FZJ20"在ll個(gè)原發(fā)性結(jié)腸癌病例中的相對表達(dá)率(癌癥/非-癌癥)。在穿過截留濾器(Cy3和Cy5信號都大于25,000)的ll個(gè)結(jié)腸癌病例中，IO個(gè)病例中的FL/2W"表達(dá)被上調(diào)(Cy3:Cy5強(qiáng)度比率》.0)。圖22b顯示出使用18個(gè)額外的結(jié)腸癌病例，經(jīng)半-定量RT-PCR分析獲得的FZJ20375表達(dá)(T，肺瘤組織；N,正常組織)。將G^PD/f的表達(dá)用作內(nèi)部對照。圖23a提供照片顯示出多個(gè)人胎組織中iWFW的月臺-組織Northem印跡分析結(jié)果。圖23b顯示出RNF43的推定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。圖24a和24b提供照片顯示出經(jīng)myc-標(biāo)記的RNF43蛋白的亞細(xì)胞定位。圖24a提供照片顯示出使用被pcDNA3.1myc/His-RNF43或?qū)φ召|(zhì)粒(模擬質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞的提取物對經(jīng)myc-標(biāo)記的RNF43蛋白進(jìn)行Western-印跡分析的結(jié)果。圖24b提供照片顯示出用小鼠抗-myc抗體染色并用與FITC偶聯(lián)的第二抗體觀察到的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。圖25a至25c顯示出iA^W3對細(xì)胞生長的影響。圖25a提供照片顯示出NIH3T3細(xì)胞中iA^43的集落形成試驗(yàn)結(jié)果。圖25b提供照片顯示出模擬細(xì)胞(COS7-pcDNA)和通過用pcDNA-RNF43轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞建立的COS7-RNF43細(xì)胞中的/MW3表達(dá)。圖25c顯示出穩(wěn)定表達(dá)外源性iA^/3的COS7-RNF43細(xì)胞和模擬細(xì)胞之間細(xì)胞生長的比較結(jié)果。圖26a和26b顯示出被指定用于抑制iA^^的反義S-寡核苦酸的生長-抑制作用。圖26a提供照片顯示出通過半-定量RT-PCR分析獲得的、用對照(KNF43-Sl)或反義S-寡核香酸(RNF43-ASl)處理12小時(shí)的LoVo細(xì)胞中的RNF43表達(dá)。圖26b顯示出經(jīng)MTT試驗(yàn)測定的、用對照或反義S-寡核苷酸處理后的LoVo細(xì)胞的細(xì)胞生存力。同時(shí)進(jìn)行三份MTT試驗(yàn)。圖27A至27C顯示出RNF43-siRNA的生長抑制作用。圖27A提供照片顯示出RNF43-siRNA對RNF43表達(dá)的作用。圖27B提供照片顯示出用對照-siRNA或RNF43-siRNA處理后，存活細(xì)胞的Giemsa染色結(jié)果。圖27C顯示出用對照質(zhì)?；虮磉_(dá)RNF43-siRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的MTT試驗(yàn)結(jié)果。*表示經(jīng)Fisher，sprotectedleast顯著性差異試驗(yàn)測定的顯著性差異(p〈0.05)。圖28A和28B顯示出經(jīng)標(biāo)記RNF43蛋白的表達(dá)。圖28A提供照片顯示出經(jīng)pFLAG-5CMV-RNF43(泳道2)或模擬載體(泳道l)轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞的培養(yǎng)基中分泌的、經(jīng)Flag-標(biāo)記的RNF43蛋白的Western-印跡分析結(jié)果。圖28B才是供照片顯示出經(jīng)pcDNA3.1-Myc/His-RNF43(泳道2)或模擬載體(泳道l)轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞的培養(yǎng)基中分泌的、經(jīng)Myc-標(biāo)記的RNF43蛋白的Western-印跡分析結(jié)果。圖29A和29B顯示出含有經(jīng)Myc-標(biāo)記或經(jīng)Flag-標(biāo)記的RNP43蛋白的條件培養(yǎng)基的生長促進(jìn)作用。圖29A提供照片顯示出在對照培養(yǎng)基(1)或被模擬載體(2)、pcDNA3.1-Myc/His-RNF43(3)或pFLAG-5CMV-RNF43(4)轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。圖29B顯示出在圖29A所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞的數(shù)目。所示^:據(jù)為每組三^f分實(shí)一瞼的平均值；線條表示土SE。*表示與對照，模擬載體相比較的顯著性差異(p<0.05)。圖30A至30C表示RNF43N-末端(N1)和C-末端(C1)重組蛋白質(zhì)的制備。圖30A圖解表示重組蛋白質(zhì)RNF43-N1和-Cl的結(jié)構(gòu)。圖30B提供照片顯示出在用(泳道2)或不用(泳道1)0.2mMIPTGi秀導(dǎo)時(shí)，經(jīng)NusTM-標(biāo)記的RNF43-Nl蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)。圖30C提供照片顯示出在用(泳道2)或不用(泳道1)0.2mMIPTG誘導(dǎo)時(shí)，經(jīng)NusTM-標(biāo)記的RNF43-Cl蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)。圖31A和31B顯示出通過酵母雙-雜合系統(tǒng)4全測到的RNF43和NOTCH2之間的相互作用。圖31A顯示出推定的NOTCH2結(jié)構(gòu)和相互作用區(qū)域。(a)顯示出推定的NOTCH2蛋白全長結(jié)構(gòu)，(b)顯示出推定的負(fù)責(zé)相互作用的區(qū)域(ECD,胞外結(jié)構(gòu)域；TM,跨膜結(jié)構(gòu)域；ICD,胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域)。圖31B提供照片顯示出通過雙-雜合系統(tǒng)檢測到的RNF43和NOTCH2之間的相互作用。圖32A和32B顯示出通過酵母雙-雜合系統(tǒng)檢測到的RNF43和STRIN之間的相互作用。圖32A顯示出推定的STRIN結(jié)構(gòu)和相互作用區(qū)域。(a)顯示出推定的STRIN蛋白全長結(jié)構(gòu)，(b)顯示出推定的負(fù)責(zé)相互作用的區(qū)域(RING,RING結(jié)構(gòu)域)。圖32B提供照片顯示出通過雙-雜合系統(tǒng)檢測到的RNF43和STRIN之間的相互作用。圖33顯示出通過RNF43-721刺激產(chǎn)生的CTL系的肽特異性細(xì)胞毒性。CTL系對經(jīng)RNF43-721脈沖的靶細(xì)胞(TISI)顯示出高細(xì)胞毒活性(四邊形)，而對未經(jīng)肽脈沖的相同靶細(xì)胞(TISI)未顯示出顯著的細(xì)胞毒活性(三角形)。已證實(shí)CTL系具有肽特異性細(xì)胞毒性。圖34顯示出通過RNF43-721刺激產(chǎn)生的CTL克隆的肽特異性細(xì)胞毒性。按照"材料和方法"中所述檢測13個(gè)RNF43-721CTL克隆對經(jīng)肽-脈沖的耙(TISI)的細(xì)胞毒活性。已建立的RNF43-721CTL克隆對經(jīng)肽-脈沖的靶細(xì)胞(TISI)具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，而對未經(jīng)任何肽月永沖的相同靶細(xì)胞(TISI)未顯示出任何顯著的細(xì)胞毒活性。圖35顯示出RNF43-721CTL克隆45對HT29,WiDR和HCT116的細(xì)胞毒活性。RNF43-721CTL克隆識別并裂解以HLA限制性方式內(nèi)源性表達(dá)RNF43的腫瘤細(xì)胞。HT29，WiDR和HCT116皆內(nèi)源性表達(dá)RNF43，將RNF43-721CTL克隆45用作效應(yīng)細(xì)胞。將TISI用作不表達(dá)RNF43的靶。RNF43_721CTL克隆^對同時(shí)表達(dá)RNF"和HLA-AZ4的HTM(實(shí)心三角形)和WiDR(菱形)顯示出高細(xì)月包毒活性。另一方面，-RNF43-721CTL克隆45對表達(dá)RNF"但不表達(dá)HLA-AZ4的HCT11《空心三角形)和表達(dá)HLA-AM但不表達(dá)RNF43的TISI(空心四邊形)未顯示出顯著的細(xì)胞毒活性。另外，RNF43-721CTL克隆45對經(jīng)不相關(guān)的肽脈沖的TISI(點(diǎn)狀實(shí)心四邊形)和表達(dá)RNF43但幾乎不表達(dá)HLA-A24的SNU-C4(實(shí)心圓)未顯示出細(xì)胞毒活性。圖36顯示出未標(biāo)記靶的抑制試驗(yàn)結(jié)果。RNF43-721CTL克隆以HLA-A24限制性方式特異性識別RNF43-721。將用Na2"Cr04標(biāo)記的HT29制備成經(jīng)標(biāo)記靶，而將經(jīng)RNF43-721肽-脈沖的TISI(Peptide+)用作未標(biāo)記靶(抑制劑)。將E/T比率固定為20。加入用相同肽脈沖的TISI可抑制對HT29的細(xì)胞毒活性(實(shí)心四邊形)，而加入未經(jīng)肽脈沖的TISI幾乎無抑制作用(空心四邊形)。圖37顯示出阻斷試驗(yàn)的結(jié)果，該試驗(yàn)顯示出針對HLA-I類，HLA-II類,CD3，CD4和CD8產(chǎn)生的抗體對RNF43-721CTL克隆的細(xì)胞毒活性的作用。RNF43-721CTL克隆以HLA-I類、CD3和CD8限制性方式顯示出細(xì)胞毒活性。為了檢測用RNF43肽產(chǎn)生的CTL克隆的特征，檢測了針對HLA-I類，HLA-II類，CD3,CD4和CD8的抗體抑制細(xì)胞毒活性的能力。水平軸表示細(xì)胞毒性抑制作用的百分比。當(dāng)使用抗I類、CD3和CD8的抗體時(shí)，CTL克隆對WiDR耙的細(xì)胞毒性顯著降低。該結(jié)果表明CTL克隆以依賴于HLA-I類、CD3和CD8的方式識別衍生自RNF43的肽。圖38A和38B顯示出用RNF43-1l-9(A)或RNF43-ll-10(B)產(chǎn)生的CTL系的肽特異性細(xì)胞毒性。這些CTL系對經(jīng)RNF43-11-9或RNF43-11-10脈沖的靶細(xì)胞(T2)顯示出高細(xì)胞毒活性，而對未經(jīng)肽脈沖的相同靶細(xì)胞(T2)未顯示出顯著的細(xì)胞毒活性。圖39A和39B顯示出通過RNF43-1l-9(A)或RNF43-ll-10(B)刺激產(chǎn)生的CTL克隆的肽特異性細(xì)胞毒性。按照"材料和方法"中所述檢測4個(gè)RNF43-ll-9CTL克隆或7個(gè)RNF43-11-10克隆對經(jīng)肽-脈沖的靶(T2)的細(xì)胞毒活性。已建立的RNF43-11-9和RNF43-11-10CTL克隆對經(jīng)肽-脈沖的靶細(xì)胞(T2)具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，而對未經(jīng)任何肽脈沖的相同耙細(xì)胞(T2)未顯示出任何顯著的細(xì)胞毒活性。圖40A和40B顯示出RNF43-5CTL克隆卯和RNF43-17CTL克隆25對HT29和DLD-1的細(xì)胞毒活性。RNF43-5CTL克隆90和RNF43-17CTL克隆25識別并裂解以HLA-限制性方式內(nèi)源性表達(dá)RNF43的腫瘤細(xì)胞。HT29和DLD-1皆內(nèi)源性表達(dá)RNF43，將RNF43-5CTL克隆90和RNF43-17CTL克隆25用作效應(yīng)細(xì)胞。將T2用作不表達(dá)RNF43的靶。RNF43-5CTL克隆卯和RNF43-17CTL克隆25對同時(shí)表達(dá)RNF43和HLA-A承0201的DLD-1顯示出高細(xì)胞毒活性。另一方面，RNF43-5CTL克隆90和RNF43-17CTL克隆25對表達(dá)RNF43但不表達(dá)HLA-A^201的HT29未顯示出顯著的細(xì)胞毒活性。圖41顯示出未標(biāo)記耙的抑制試-驗(yàn)結(jié)果。RNF43-ll-9CTL克隆以HLA-A2限制性方式特異性識別RNF43-ll-9。將用Na2"C.rO4標(biāo)記的HCTl16制備成經(jīng)標(biāo)記乾，而將經(jīng)RNF43-1l-9肽-脈沖的T2(P印tide+)用作未標(biāo)記靶(抑制劑)。將E/T比率固定為20。加入用相同肽脈沖的T2可抑制對HCT116的細(xì)胞毒活性，而加入未經(jīng)肽脈沖的TISI幾乎無抑制作用。發(fā)明詳述除非另有說明，本文所用術(shù)語"一個(gè)"、"一種"指的是"至少一個(gè)"和"至少一種"。本申請鑒定出新的人基因CA^DiU和CCC/D/，與相應(yīng)的非癌組織相比，所述基因在胃癌中的表達(dá)顯著升高。CX4DM/cDNA由3423個(gè)核苷酸組成，其中含有如SEQIDNO:l所示的1296個(gè)核苷酸長的開放閱讀框。開放閱讀框編碼推定的431個(gè)-氨基酸長的蛋白質(zhì)。CXADRL1與AIP1結(jié)合。AIPl(atripin-l-相互作用蛋白l)是與atropin-l結(jié)合的蛋白質(zhì)，atropin-l是遺傳病齒狀核紅核-蒼白J求底丘月S核萎縮(dentatorubral-pallidoluysianatrophy)的致病基因。AIP1編碼推定的1455個(gè)氨基酸長的蛋白質(zhì)，其中含有鳥苷酸激酶-樣結(jié)構(gòu)域、2個(gè)WW結(jié)構(gòu)域和5個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域。已證實(shí)AIP1的小鼠同系物能與活化素型IIA相互作用。然而，AIP1的功能仍有待闡明。推測的氨基酸序列與CXADR(柯薩奇病毒和腺病毒受體)的同一性約為37。/。。因此，將該蛋白質(zhì)命名為CXADRL1(柯薩奇病毒和腺病毒受體樣1)。另一方面，GC77D7cDNA由4987個(gè)核苦酸組成，其中含有如SEQIDNO:3所示的1245個(gè)核苷酸長的開放閱讀框。開放閱讀框編碼推定的414個(gè)-氨基酸長的蛋白質(zhì)。由于該蛋白質(zhì)的表達(dá)在胃癌中被上調(diào)，因此，將其命名為GCUD1(在胃癌中被上調(diào))。此外，本發(fā)明包括新的人基因7A^0,與相應(yīng)的非癌組織相比，所述基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)顯著升高。iWFWcDNA由5345個(gè)核苦酸組成，其中含有如SEQID—NO:5所示的2352個(gè)核苦酸長的開放閱讀框。開》文閱讀框編碼推定的783個(gè)-氨基酸長的蛋白質(zhì)。RNF43與NOTCH2和STRIN結(jié)合。據(jù)報(bào)道NOTCH2是大的跨膜受體蛋白，該蛋白質(zhì)是進(jìn)化上保守的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)機(jī)制的組分。NOTCH2是Notch信號傳導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)成員，據(jù)報(bào)道，它與腎臟中的腎小球發(fā)生以及心臟和眼血管系統(tǒng)的發(fā)育有關(guān)。另據(jù)報(bào)道，三種5/Serrate/Lag-2(DSL)蛋白，即51、Jaggaedl和Jaggaed2是NOTCH2的功能配體。STRIN編碼推定的與小鼠Trif共享79%同一性的蛋白質(zhì)。STRIN或Trif的功能仍有待闡明。CX4DM/，GCf/i^47MW3在細(xì)胞內(nèi)的外源性表達(dá)總能使細(xì)胞生長增強(qiáng)，而用反義S-寡核苷酸或小的干擾RNA(siRNA)抑制其表達(dá)會導(dǎo)致對癌細(xì)胞的顯著生長-抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)表明CXADRLl,GCUD1和RNF43為癌細(xì)胞提供了致癌活性，抑制這些蛋白質(zhì)的活性不失為一種治療癌癥的理想策略。本發(fā)明包括新的人基因CX4Z)M7，其包括SEQIDNO:l所述的多核苷酸序列及其簡并序列和突變體，條件是它們都能編碼CXADRL1蛋白，所述蛋白質(zhì)包括SEQIDNO:2所示氨基酸序列或其功能等同物。與CXADRL1蛋白功能等同的多肽包括例如其它生物體中與人CXADRL1蛋白相對應(yīng)的同源蛋白質(zhì)以及人CXADRL1蛋白的突變體。本發(fā)明還包括新的人基因GCM^，其包括SEQIDNO:3所述的多核苷酸序列及其簡并序列和突變體，條件是它們都能編碼GCUD1蛋白，所述蛋白質(zhì)包括SEQIDNO:4所示氨基酸序列或其功能等同物。與GCUD1功能等同的多肽包括例如其它生物體中與人GCUD1蛋白相對應(yīng)的同源蛋白質(zhì)以及人GCUD1蛋白的突變體。另外，本發(fā).明包括新的人基因/M^3，其包括SEQIDNO:5所述的多核苦酸序列及其簡并序列和突變體，條件是它們都能編碼RNF43蛋白，所述蛋白質(zhì)包括SEQIDNO:6所示氨基酸序列或其功能等同物。與RNF43功能等同的多肽包括例如其它生物體中與人RNF43蛋白相對應(yīng)的同源蛋白質(zhì)以及人RNF43蛋白的突變體。在本發(fā)明中，術(shù)語"功能等同"指的是所述多肽具有類似于CXADRL1,GCUD1或RNF43蛋白的促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性，并能賦予癌細(xì)胞以致癌活性。通過將編碼所述多肽的DNA導(dǎo)入表達(dá)各個(gè)多肽的細(xì)胞，并檢23測對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用或集落形成活性的提高，即可判新所述多肽是否具有細(xì)胞增殖活性。所述細(xì)胞包括例如針對CXADRL1和GCUD1的NIH3T3細(xì)胞；針對RNF43的NIH3T3細(xì)胞，SW480細(xì)胞和COS7細(xì)胞。或者，可通過檢測其與AIP1的結(jié)合能力來判斷所述多肽是否與CXADRL1功能等同。另外，可通過^r測其與NOTCH2或STRIN的結(jié)合能力來判斷所述多肽是否與RNF43功能等同。與給定蛋白質(zhì)功能等同的多肽的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且包括在蛋白質(zhì)中導(dǎo)入突變的已知方法。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過定點(diǎn)誘變(Hashimoto-Gotohetal"Gene152:271-275(1995);ZollerandSmith,MethodsEnzymol100:468-500(1983);Krameretal.,NucleicAcidsRes.12:9441-9456(1984);KramerandFritz,MethodsEnzymol154:350-367(1987);Kunkel,ProcNatlAcadSciUSA82:488-492(1985);Kunkel,MethodsEnzymol85:2763-2766(1988))在人CXADRLl，GCUD1或RNF43蛋白的氨基酸序列中導(dǎo)入適當(dāng)?shù)耐蛔?，即可制備出與所述的任一種蛋白質(zhì)功能等同的多肽。氨基酸突變也可自然發(fā)生。本發(fā)明的多肽包括具有人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸已經(jīng)突變，條件是所得突變多肽與人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的功能等同。所述突變體中突變氨基酸的數(shù)目一般為10個(gè)氨基酸或更少，優(yōu)選為6個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選為3個(gè)氨基酸或更少。已知經(jīng)突變或修飾的蛋白質(zhì)能保留原始的生物活性，其中所述蛋白質(zhì)具有因在某個(gè)氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而被修飾的氨基酸序列(Marketal.,ProcNatlAcadSciUSA81:5662-5666(1984);ZollerandSmith,NucleicAcidsRes10:6487-6500(1982);Dalbadie畫McFarlandetal"ProcNatlAcadSciUSA79:6409-6413(1982))。優(yōu)選將待突變的氨基酸殘基突變成不同的氨基酸，其中氨基酸側(cè)鏈的特性是保守的(已知為保守的氨基酸取代過程)。氨基酸側(cè)鏈特性的例子為:疏水氨基酸(A,I，L，M，F(xiàn),P,W，Y,V),親水氨基酸(R,D,N,C,E，Q,G，H,K，S，T),以及具有下述官能團(tuán)或共有特性的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G,A,V,L，I,P);含羥基側(cè)鏈(S，T，Y);含硫原子側(cè)鏈(C,M);含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D，N,E,Q);含堿基側(cè)鏈(R,K，H)和含芳香族側(cè)鏈(H，F(xiàn),Y，W)。需說明的是括號中的字母表示氨基酸的單字母代碼。在人CXADRLI，GCUD1或RNF43蛋白的氨基酸序列中添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基所得多肽的例子是含有人CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的融合蛋白。融合蛋白是人CXADRL1，GCUD1或RKF43蛋白與其它肽或蛋白質(zhì)的融合蛋白，本發(fā)明包括所述融合蛋白。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)即可制備融合蛋白，例如將編碼本發(fā)明的人CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的DNA與編碼其它肽或蛋白質(zhì)的DNA連接，使得讀碼框匹配，將融合DNA插入表達(dá)載體并在宿主中表達(dá)所述融合DNA。對于與本發(fā)明的蛋白質(zhì)融合的肽或蛋白質(zhì)沒有限制?？捎糜谂c本發(fā)明的蛋白質(zhì)融合的已知肽包括例如FLAG(Hoppetal.,Biotechnology6:1204-1210(1988))、含有6個(gè)His(組氨酸)殘基的6xHis、10xHis、流感病毒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、pl8HIV片段、T7-標(biāo)記、HSV-標(biāo)記、E-標(biāo)記、SV40T抗原片段、lck標(biāo)記、a-微管蛋白片段、B-標(biāo)記、C蛋白片段等。可與本發(fā)明的蛋白質(zhì)融合的蛋白質(zhì)包括例如GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定區(qū)、(3-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖-結(jié)合蛋白)等。通過將編碼上述融合肽或蛋白質(zhì)的商購DNA與編碼本發(fā)明多肽的DNA融合，并表達(dá)所制備的融合DNA即可制備出融合蛋白。另一種本領(lǐng)域已知的分離功能等同多肽的方法是例如使用雜交技術(shù)的方法(Sambrooketal.,MolecularCloning2nded.9.47-9.58,ColdSpringHarborLab.Press(1989))。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地分離出與編碼人CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的DNA序列(即SEQIDN0:l,.3或5)的全部或部分具有高度同源性的DNA,并且能從分離的DNA中分離出人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白的功能等同多肽。本發(fā)明的多肽包括由能與編碼人CXADRL1,GCUD1或RNF43蛋白的DNA序列的全部或部分雜交的DNA編碼、并且與人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽。所述多肽包括對應(yīng)于人源蛋白質(zhì)的哺乳動物同系物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因編碼的多肽)。當(dāng)從動物中分離與編碼人CXADRL1蛋白的DNA高度同源的cDNA時(shí)，特別優(yōu)選使用得自睪丸或卵巢的組織。或者，當(dāng)從動物中分離與編碼人GCUD1蛋白的DNA高度同源的cDNA時(shí)，特別優(yōu)選使用得自睪丸、卵巢或腦的組織。另外，當(dāng)從動物中分離與編碼人RNF43蛋白的DNA高度同源的cDNA時(shí)，特別優(yōu)選使用得自胎肺或胎腎的組織。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)選擇分離DNA所用的雜交條件，所述DNA編碼與人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽。例如，可通過于68Gc使用"Rapid-hyb緩沖液，，(AmershamLIFESCIENCE)進(jìn)行預(yù)雜交達(dá)30分鐘或更長時(shí)間，加入經(jīng)標(biāo)記的探針并于68GC加熱1小時(shí)或更長時(shí)間來進(jìn)行雜交。例如，可在低嚴(yán)緊條件下進(jìn)行下述洗滌步驟。低嚴(yán)緊條件是例如42。C，2xSSC,0.1%SDS,或優(yōu)選為5(^C，2XSSC，0.1%SDS。更優(yōu)選使用高度嚴(yán)緊條件。高度嚴(yán)緊條件是例如室溫下用2xSSC,0.01。/。SDS洗滌3次，每次20分鐘，然后于37^C用lxSSC,0.1%SDS洗滌3次，每次20分鐘，再于5()Gc用lxSSC,0.1%SDS洗滌2次，每次20分鐘。然而，幾個(gè)諸如溫度和鹽濃度的因素可影響雜交的嚴(yán)緊度，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)選擇這些因素以獲得所需的嚴(yán)緊度?？梢允褂没驍U(kuò)增法，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法替代雜交來分離DNA,所述DNA編碼與人CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽，所述方法使用基于編碼蛋白質(zhì)的DNA序列信息(SEQIDNO:1,3或5)所合成的引物。由通過上述雜交技術(shù)或基因擴(kuò)增技術(shù)分離的DNA編碼的、與人CXADRL1,GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽一般與人CXADRLl,GCUD1或RKF43蛋白的氨基酸序列具有高度同源性。"高度同源性"一般指的是同源性為40%或更高，優(yōu)選為60%或更高，更優(yōu)選為80°/?；蚋?，甚至更優(yōu)選為95%或更高。根據(jù)"WilburandLipman,ProcNatlAcadSciUSA80:726-730(1983)，，中的算法即可測定多肽的同源性。本發(fā)明多肽的氨基酸序列、分子量、等電點(diǎn)、糖鏈的存在或缺乏、或形式可以有所不同，這取決于用于產(chǎn)生所述多肽的細(xì)胞或宿主或所使用的純化方法。無論如何，只要其功能等同于本發(fā)明的人CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白，就落入本發(fā)明的范圍。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法可將本發(fā)明的多肽制備成重組蛋白質(zhì)或天然蛋白質(zhì)。通過下述方法即可制備重組蛋白質(zhì)，即將編碼本發(fā)明多肽的DNA(例如含有核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5的DNA)插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，將載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，獲得提取物，通過對提取物進(jìn)行層析來純化多肽，所述層析包括例如離子交換層析、反相層析、凝膠過濾、或利用固定有抗本發(fā)明蛋白質(zhì)之抗體的層析柱的親和層析，或一種以上所述柱的組合d另外，當(dāng)在宿主細(xì)胞(例如動物細(xì)胞和大腸桿菌)中將本發(fā)明的多肽表達(dá)成與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白或添加有多個(gè)組氨酸的重組蛋白質(zhì)時(shí)，可使用谷胱甘肽柱或鎳柱來純化所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)?；蛘撸?dāng)將本發(fā)明的多肽表達(dá)成被c-myc,多個(gè)組氨酸或FLAG標(biāo)記的蛋白質(zhì)時(shí)，可分別使用抗c-myc，His或FLAG的抗體來檢測和純化所述蛋白質(zhì)。純化融合蛋白之后，必要時(shí)也可以通過凝血酶或Xa因子切割來切除非目的多肽區(qū)域。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如通過使結(jié)合有能與CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白結(jié)合的下述抗體的親和柱與表達(dá)本發(fā)明多肽的組織或細(xì)胞提取物接觸，即可分離出天然蛋白質(zhì)?？贵w可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還包括本發(fā)明多肽的部分肽。部分肽具有本發(fā)明多肽所特有的氨基酸序列，并由至少7個(gè)氨基酸，優(yōu)選為8個(gè)或更多個(gè)氨基酸，更優(yōu)選為9個(gè)或更多個(gè)氨基酸組成。部分肽可用于例如制備抗本發(fā)明多肽的抗體，篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物，以及篩選本發(fā)明多肽的促進(jìn)劑或抑制劑。通過基因工程，通過已知的肽合成法或通過用適當(dāng)?shù)碾拿赶景l(fā)明的多肽，即可產(chǎn)生本發(fā)明的部分肽。例如，可以4吏用固相合成或液相合成來進(jìn)行肽合成。另外，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可用于體內(nèi)或體外產(chǎn)生如上所述的本發(fā)明多肽，或者可用于因編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因中的基因異常所致疾病的基因治療?？梢允褂萌魏涡问降谋景l(fā)明的多核苦酸，只要它能編碼本發(fā)明的多肽即可，其包括mRNA，RNA,cDNA，基因組DNA和化學(xué)合成的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括含有給定核苷酸序列及其筒并序列的DNA，只要所得DNA能編碼本發(fā)明的多肽即可。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法即可制備本發(fā)明的多核苦酸。例如，可通過下述方法制備本發(fā)明的多核苦酸由表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞制備cDNA文庫，并使用本發(fā)明DNA(如SEQIDNO:1,3或5)的部分序列作為探針進(jìn)行雜交。例如，通過Sambrooketal.,MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中所述的方法即可制備cDNA文庫；或者也可以使用商購的cDNA文庫。也可通過下述方法制備cDNA文庫從表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞中提取RNA,基于本發(fā)明DNA的序列(如SEQIDNO:1,3或5)合成寡DNA，使用寡DNA作為引物進(jìn)行PCR,并擴(kuò)增編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的cDNA。另外，通過對所得cDNA的核苦酸進(jìn)行測序，即可常規(guī)測定由cDNA編碼的翻譯區(qū)，并能容易地獲得本發(fā)明多肽的氨基酸序列。另外，通過使用所得cDNA或其部分作為探針篩選基因組DNA文庫，即可分離出基因組DNA。更具體地，可首先從表達(dá)本發(fā)明目的多肽的細(xì)胞、組織或器官中制備mRNA(CX4i^L/:睪丸或卵巢；GCt/Z)h睪丸、卵巢或腦；7WFW:胎肺或胎腎)?？墒褂靡阎椒ǚ蛛xmRNA;例如，通過胍超速離心(Chirgwinetal.,Biochemistry18:5294-5299(1979))或AGPC法(ChomczynskiandSacchi,AnalBiochem162:156-159(1987))即可制備總RNA。另外，可使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia)等從總RNA中純化mRNA,或者使用QuickPrepmRNA純化試劑盒(Pharmacia)直接純化mRNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶，用所得mRNA合成cDNA?？墒褂蒙藤彽脑噭┖校鏏MV逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(SeikagakuKogyo)合成cDNA。或者，可以才艮據(jù)5，-RACE法(Frohmanetal.，ProcNatlAcadSciUSA85:8998-卯02(1988);Belyavskyetal.,NucleicAcidsRes17:2919-2932(1989))合成和擴(kuò)增cDNA,所述方法使用本文所述的引物、5'-AmpliFINDERRACE試劑盒(Clontech)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。由PCR產(chǎn)物制備所需DNA片段，并與載體DNA連接。使用重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌等，由選定菌落制備所需重組載體。通過常規(guī)方法，如雙脫氧核苦酸鏈終止法證實(shí)所需DNA的核苷酸序列?？紤]到用于表達(dá)的宿主中的密碼子使用頻率，將本發(fā)明多核苷酸的核苦酸序列設(shè)計(jì)成能夠更有效地表達(dá)(Granthametal.,NucleicAcidsRes9:43-74(1981))?？赏ㄟ^商購試劑盒或常規(guī)方法改變本發(fā)明多核苷酸的序列。例如，可通過用限制性酶消化、插入合成的寡核苷酸或適當(dāng)?shù)亩嗪塑账崞?、添加接頭或插入起始密碼子(ATG)和/或終止密碼子(TAA,TGA或TAG)來改變序列。28具體地說，本發(fā)明的多核苷酸包括含有核苷酸序歹'JSEQIDNO:1,3或5的DNA。另外，本發(fā)明提供了能在嚴(yán)緊條件下與具有核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5的多核苦酸雜交、并且編碼與上文所述的本發(fā)明CXADRL1，GCUD1或RNF43蛋白功能等同的多肽的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)選擇嚴(yán)緊條件。例如，可使用低度嚴(yán)緊條件。更優(yōu)選使用高度嚴(yán)緊條件。這些條件與上文所述的相同。上述雜交DNA優(yōu)選為cDNA或染色體DNA。本發(fā)明還提供了載體，其中插入了本發(fā)明的多核苷酸。本發(fā)明的載體可用于在宿主細(xì)胞中維持本發(fā)明的多核苦酸，尤其是DNA,從而表達(dá)本發(fā)明的多肽，或者可用于施用本發(fā)明的多核苷酸以進(jìn)行基因治療。當(dāng)宿主細(xì)胞為大腸桿菌，并且在大腸4干菌(如JM109,DH5a,HB101或XLlBlue)中大量擴(kuò)增和制備載體時(shí)，載體應(yīng)具有欲在大腸桿菌中擴(kuò)增的"ori"和用于選擇轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的標(biāo)記基因(例如用藥物進(jìn)行選擇的藥物-抗性基因，如氨節(jié)青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素等)。例如，可使用M13-系列載體、pUC-系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，也可使用pGEM-T、pDIRECT和pT7亞克隆和提取cDNA以及上述載體。當(dāng)使用載體制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)時(shí)，表達(dá)載體特別有用。例如，欲在大腸桿菌中表達(dá)的表達(dá)載體應(yīng)具有欲在大腸桿菌中擴(kuò)增的上述特征。當(dāng)將大腸桿菌，如JM109，DH5a，HB101或XLlBlue用作宿主細(xì)胞時(shí)，載體應(yīng)具有能在大腸桿菌中有效表達(dá)所需基因的啟動子，例如lacZ啟動子(Wardetal"Nature341:544-546(1989);FASEBJ6:2422-2427(1992》、araB啟動子(Betteretal.,Science240:1041-1043(1988))或T7啟動子等。在此方面，可使用例如pGEX-5X-l(Pharmacia)、"QIAexpress系統(tǒng)，，(Qiagen)、pEGFP和pET(此時(shí)，宿主優(yōu)選為表達(dá)T7RNA聚合酶的BL21)來替代上述載體。另外，載體也可含有多肽分泌所用的信號序列。介導(dǎo)多肽分泌至大腸桿菌周質(zhì)的信號序列的例子為peffi信號序列(Leietal"JBacteriol169:4379(1987))。將載體導(dǎo)入靶宿主細(xì)胞的方法包括例如氯化鈞法和電穿孔法。除了大腸桿菌外，也可使用下述載體制備本發(fā)明的多肽，即得自哺乳動物的表達(dá)載體(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(NucleicAcidsRes18(17):5322(1990))，pEF，pCDM8)，得自昆蟲細(xì)胞的表達(dá)載體(例如"Bac-to-29BAC軒狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，，(GIBCOBRL),pBacPAK8),得自植物的表達(dá)載體(例如pMHl,pMH2),得自動物病毒的表達(dá)載體(例如pHSV,pMV,pAdexLcw)，得自逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體(例如pZIpneo),得自酵母的表達(dá)載體(例如"畢赤氏酵母表達(dá)試劑盒，，(Invitrogen)，pNVll,SP-Q01)以及得自枯草芽孢桿菌的表達(dá)載體(如pPL608,pKTH50)。為了在動物細(xì)胞，如CHO,COS或NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)載體，載體應(yīng)具有在所述細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)所必需的啟動子，例如SV40啟動子(Mulliganetal.,Nature277:108(1979))、MMLV-LTR啟動子、EFloc啟動子(Mizushimaetal.,NucleicAcidsRes18:5322(1990))、CMV啟動子等，優(yōu)選還具有選擇轉(zhuǎn)化子所用的標(biāo)記基因(例如用藥物進(jìn)行選擇的藥物抗性基因(如新霉素、G418))。具有這些特征的已知載體的例子包括例如pMAM,pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV,pOPRSV和pOP13。另外，可使用一些方法在穩(wěn)定表達(dá)基因的同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增基因的拷貝數(shù)。例如，可將含有互補(bǔ)DHFR基因的載體(如pCHOI)導(dǎo)入核酸合成途徑缺失的CHO細(xì)胞，然后通過氨甲蝶呤(MTX)進(jìn)行擴(kuò)增。另外，當(dāng)瞬時(shí)表達(dá)基因時(shí)，可以使用這樣一種方法，其中含有SV40復(fù)制起點(diǎn)的載體(pcD等)被轉(zhuǎn)化至染色體上含有表達(dá)SV40T抗原的基因的COS細(xì)胞。按上述方法獲得的本發(fā)明多肽可分離自宿主細(xì)胞的內(nèi)部或外部(如培養(yǎng)基)，并被純化成基本上純的均質(zhì)多肽。本文所用的與給定多肽有關(guān)的術(shù)語"基本上純"指的是多肽基本上不含其它生物大分子。基本上純的多肽是指干重至少75%(如至少80,85,95或99%)純。通過任何適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)方法皆可測定純度，所述方法包括例如柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析。分離和純化多肽的方法不局限于任何特定的方法；實(shí)際上，可使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法。例如，可以適當(dāng)選擇柱層析、過濾、超濾、鹽沉淀、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點(diǎn)電泳、透析和重結(jié)晶，并將它們組合用于分離和純化多肽。層析的例子包括例如親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層牙斤、吸附層析等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.Ed.DanielR.Marshaketal"ColdSpringHarborLaboratoryPress(1996))。通過液相層析，如HPLC和FPLC即可進(jìn)行這些層析。因此，本發(fā)明提供了通過上述方法制備的高度純化的多肽。通過在純化前或純化后用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)修飾酶處理本發(fā)明的多肽，即可對其進(jìn)行任意修飾或部分缺失。有用的蛋白質(zhì)修飾酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、賴氨酰內(nèi)肽酶、蛋白激酶、葡糖苦酶等。本發(fā)明提供了與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體可以任何形式被使用，如單克隆或多克隆抗體，并且包括通過用本發(fā)明的多肽免疫動物，如兔獲得的抗血清、所有類別的多克隆和單克隆抗體、人抗體和通過基因重組產(chǎn)生的人源化抗體?？捎米骺乖垣@得抗體的本發(fā)明多肽可得自任何動物，但優(yōu)選得自哺乳動物，如人、小鼠或大鼠，更優(yōu)選得自人。人源多肽可得自本文公開的核香酸或氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明，用作免疫抗原的多肽可以是完整蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的部分肽。部分肽可含有例如本發(fā)明多肽的氨基(N)-末端或羧基(C)-末端片段。更具體地，包含密碼子235-276,493-537或70-lll的CXADRLl多肽可用作制備抗本發(fā)明CXADRL1的抗體所用的部分肽?；蛘?，為了制備抗本發(fā)明多肽的抗體，可使用含有下述氨基酸序列中的任一個(gè)的肽。-RNF43;SEQIDNo:80,97或108-CXADRL1;SEQIDNo:124-GCUD1;SEQIDNo:164在本文中，抗體被定義為與本發(fā)明多肽的全長或片段反應(yīng)的蛋白質(zhì)?？蓪⒕幋a本發(fā)明多肽或其片段的基因插入已知表達(dá)載體，然后按本文所述用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。通過任何標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細(xì)胞的外部或內(nèi)部回收所需多肽或其片段，隨后將其用作抗原?；蛘?，將表達(dá)多肽的完整細(xì)胞或其裂解物或化學(xué)合成的多肽用作抗原?？捎每乖庖呷魏尾溉閯游铮珒?yōu)選考慮與細(xì)胞融合所用親代細(xì)胞的相容性。一般使用嚙齒類、兔形目(Lagomorpha)或靈長類動物。嚙齒類動物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔形目動物包括例如兔。靈長類動物包括例^口Catarrhini浙吳(oldworld猴),長口食蟹猴(Afacaca/osc/cm/otz'力,恒河猴(rhesusmonkey),sacred狒狒和黑猩猩(chimpanzees)。用抗原免疫動物的方法是本領(lǐng)域已知的。腹膜內(nèi)注射或皮下注射抗原是免疫哺乳動物的標(biāo)準(zhǔn)方法。更具體地，可稀釋抗原，將其懸浮于適當(dāng)量的磷酸緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等中。必要時(shí)，可將抗原懸浮液與適當(dāng)量的標(biāo)準(zhǔn)佐劑，如弗氏完全佐劑混合，制成乳劑，然后施用給哺乳動物。優(yōu)選隨后按照4至21天的間隔多次施用與適當(dāng)量的弗氏不完全佐劑混合的抗原。適當(dāng)?shù)妮d體也可用于免疫。按上文所述進(jìn)行免疫之后，通過標(biāo)準(zhǔn)方法檢查血清中所需抗體量的增加。通過從經(jīng)檢查后確定血清中所需抗體量有所增加的經(jīng)免疫哺乳動物體內(nèi)收集血液，并通過使用任何常規(guī)方法從血液中分離出血清，即可制備抗本發(fā)明多肽的多克隆抗體。多克隆抗體包括含有多克隆抗體的血清，可以從血清中分離含有多克隆抗體的組分。可以使用例如與本發(fā)明多肽偶聯(lián)的親和柱獲得僅識別本發(fā)明多肽的組分，并使用蛋白A或蛋白G柱進(jìn)一步純化該組分，從而由所述組分制備免疫5求蛋白G或M。為了制備單克隆抗體，從用抗原免疫的哺乳動物體內(nèi)收集免疫細(xì)胞，按上文所述^r查血清中水平有所增加的所需抗體，并進(jìn)行細(xì)胞融合。用于細(xì)胞融合的免疫細(xì)胞優(yōu)選得自脾臟。其它可與上迷免疫細(xì)胞融合的優(yōu)選親代細(xì)胞包括例如哺乳動物的骨髓瘤細(xì)胞，更優(yōu)選為具有用藥物選擇融合細(xì)胞時(shí)所需的獲得型特性的骨髓瘤細(xì)胞?？筛鶕?jù)已知方法，例如Milstein等的方法(GalfreandMilstein,MethodsEnzymol73:3-46(1981))融合上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。通過在標(biāo)準(zhǔn)的選擇培養(yǎng)基，如HAT培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)即可選擇出通過細(xì)胞融合獲得的雜交瘤。一^:在HAT培養(yǎng)基中維持細(xì)胞培養(yǎng)物數(shù)天至數(shù)周，維持的時(shí)間應(yīng)足以使除所需雜交瘤以外的所有其它細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡。然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的有限稀釋以篩選和克隆能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。除了上文所述的用抗原免疫非人動物以制備雜交瘤的方法外，也可在體外用多肽、表達(dá)多肽的細(xì)胞或其裂解物免疫人淋巴細(xì)胞，例如被EB病毒感染的人淋巴細(xì)胞。然后，使經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞與得自人的能夠無限分裂的骨髓瘤細(xì)胞，如U266融合，從而產(chǎn)生能生成所需人抗體的雜交瘤，所述抗體能結(jié)合所述多肽(未審公開的日本專利申請(JP-A)Sho63-17688)。隨后，將所得雜交瘤移植到小鼠腹腔中并抽取腹水?？赏ㄟ^例如硫酸銨沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE離子交換層析或偶聯(lián)有本發(fā)明多肽的親和柱來純化所獲得的單克隆抗體。本發(fā)明的抗體不僅可用于純化和檢測本發(fā)明的多肽，還可用作本發(fā)明多肽的候選激動劑和拮抗劑。另外，所述抗體還可用于與本發(fā)明多肽相關(guān)之疾病的抗體治療。當(dāng)給人體施用所得抗體時(shí)(抗體治療)，優(yōu)選人抗體或人源化抗體以降低免疫原性。例如，可以用選自多肽、表達(dá)多肽的細(xì)胞或其裂解物的抗原免疫攜有人抗體基因的轉(zhuǎn)基因動物。然后從動物體內(nèi)收集產(chǎn)生抗體的細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞融合，從而獲得雜交瘤，從中可制備出抗所述多肽的人抗體(參見WO92-03918,W093-2227,WO94-02602，W094-25585,W096-33735和W096國34096)。或者，可通過癌基因無限增殖化能產(chǎn)生抗體的免疫細(xì)胞，如經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞，并將其用于制備單克隆抗體。也可使用基因工程技術(shù)重組制備如此獲得的單克隆抗體(參見例如BorrebaeckandLarrick,TherapeuticMonoclonalAntibodies,publishedintheUnitedKingdombyMacMillanPublishersLTD(1990))。例如，可從能產(chǎn)生抗體的免疫細(xì)胞，如雜交瘤或經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞中克隆編碼抗體的DNA，將其插入適當(dāng)載體，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞以制備重組抗體。本發(fā)明還提供了按上文所述制備的重組抗體。另外，本發(fā)明的抗體可以是抗體片段或經(jīng)修飾的抗體，只要它們能結(jié)合本發(fā)明的一種或多種多肽即可。例如，抗體片段可以是Fab,F(ab，)2,Fv或單鏈Fv(scFv),其中通過適當(dāng)接頭連接得自H和L鏈的Fv片段(Hustonetal.:ProcNatlAcadSciUSA85:5879-5883(1988))。更具體地，通過用酶，如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體即可產(chǎn)生抗體片段?；蛘?，可構(gòu)建編碼抗體片段的基因，將其插入表達(dá)載體，并在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見例如Coetal.，JImmunol152:2968-2976(1994);BetterandHorwitz，MethodsEnzymol178:476-496(1989);HuckthunandSkerra，MethodsEnzymol178:497-515(1989);Lamoyi，MethodsEnzymol.121:652-663(1986);Rousseauxetal"MethodsEnzymol121:663-669(1986);BirdandWalker,TrendsBiotechnol9:132-137(1991))。通過與多種分子，如聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)即可修飾抗體。本發(fā)明提供了這種經(jīng)修飾的抗體。通過對抗體進(jìn)行化學(xué)修飾即可獲得經(jīng)修飾的抗體。33這些修飾方法是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)?；蛘?，本發(fā)明的抗體可以是得自非人抗體的可變區(qū)與得自人抗體的恒定區(qū)之間的嵌合抗體，或者是含有得自非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、得自人抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)和恒定區(qū)的人源化抗體。使用已知技術(shù)即可制備出所述抗體?？蓪瓷衔乃霁@得的抗體純化至均質(zhì)。例如，可根據(jù)用于普通蛋白質(zhì)的分離和純化方法進(jìn)行抗體的分離和純化。例如，通過適當(dāng)選擇和組合使用柱層析，如親和層析、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦等可以分離抗體(Antibodies:ALaboratoryManual.EdHarlowandDavidLane，ColdSpringHarborLaboratory,1988)，〈旦并不局P艮于此。蛋白A柱和蛋白G柱可用作親和柱?？梢允褂玫牡鞍譇柱的例子包括例如HyperD,POROS和SepharoseF.F.(Pharmacia)。除親和層析以外的層析例包括例如離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.Marshaketal.,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1996))。可通過液相層析，如HPLC和FPLC進(jìn)行層析過程。例如，可以使用吸光度測定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、酶免疫測定性。在ELISA中，將本發(fā)明的抗體固定在培養(yǎng)板上，將本發(fā)明的多肽上樣于板上，然后上樣含有所需抗體的樣品，如產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液或純化的抗體樣品。然后上樣能識別第一抗體并#1酶，如石咸性磷酸酶標(biāo)記的第二抗體，并保溫培養(yǎng)板。接著，在洗滌之后，在培養(yǎng)板中加入酶底物，如對硝基苯磷酸，測定吸光度以評價(jià)樣品的抗原結(jié)合活性。多肽的片段，如C-末端或N-末端片段可用作多肽?？墒褂肂IAcore(Pharmacia)評價(jià)本發(fā)明抗體的活性。上述方法通過將本發(fā)明的抗體暴露于假定含有本發(fā)明多肽的樣品，并^r測或測定抗體和多肽形成的免疫復(fù)合物，可以檢測或測定本發(fā)明的多肽。由于^r測或測定本發(fā)明多肽的方法可特異性^r測或測定多肽，因此，所述方法可用于多種使用所述多肽的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明還提供了含有至少15個(gè)核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸能與編碼人CXADRLl,GCUD1或RNP43蛋白的多核苷酸(SEQIDNO:1，3或5)或其互補(bǔ)鏈雜交。優(yōu)選本發(fā)明的多核苦酸是能與編碼本發(fā)明多肽的DNA特異性雜交的多核苷酸。本文所用術(shù)語"特異性雜交"指的是在通常的雜交條件下，優(yōu)選在嚴(yán)緊雜交條件下不與編碼其它蛋白質(zhì)的DNA發(fā)生顯著交叉雜交。所述多核苷酸包括能與編碼本發(fā)明多肽的DNA或其互補(bǔ)鏈特異性雜交的探針、引物、核苷酸和核苷酸衍生物(例如反義寡核香酸和核酶)。另外，所述多核苷酸可用于制備DNA芯片。本發(fā)明包括能與核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5內(nèi)的任何位點(diǎn)雜交的反義寡核苷酸。優(yōu)選所述反義寡核苷酸針對的是核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5中的至少15個(gè)連續(xù)核苦酸。甚至更優(yōu)選上述反義寡核苷酸在上述至少15個(gè)連續(xù)核苷酸中含有起始密碼子。更具體地，所述反義寡核苷酸包括含有核苷酸序列SEQIDNO:23或25的反義寡核苷酸用于抑制CXADRL1表達(dá)；含有核苷酸序列SEQIDNO:27或29的反義寡核苷酸用于抑制GCUD1的表達(dá)；含有核苷酸序列SEQIDNO:31的反義寡核苷酸用于抑制RNF43的表達(dá)。反義寡核苷酸的衍生物或修飾產(chǎn)物可用作反義寡核苷酸。所述修飾產(chǎn)物的例子包括低級烷基磷酸酯修飾，如曱基-磷酸酯型或乙基-磷酸酯型修飾，硫代磷酸酯修飾和氨基磷酸酯修飾。本文所用術(shù)語"反義寡核苷酸，，不僅意味著其中與構(gòu)成DNA或mRNA特定區(qū)域的核苦酸相對應(yīng)的核苦酸能夠完全互補(bǔ)，還意味著其中可含有一個(gè)或多個(gè)核苷酸錯(cuò)配，只要DNA或mRNA和反義寡核苷酸能與核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5特異性雜交即可。"至少15個(gè)連續(xù)核苷酸序列區(qū)域"中所包含的這種多核苷酸的同源性至少為70%或更高，優(yōu)選為80%或更高，更優(yōu)選為90%或更高，甚至更優(yōu)選為95%或更高?？梢允褂帽疚奶峒暗乃惴y定同源性。所述多核苷酸可用作探針以按照下文實(shí)施例所述分離或檢測編碼本發(fā)明的多肽，或用作擴(kuò)增所用的引物。本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物通過下述機(jī)制對產(chǎn)生本發(fā)明多肽的細(xì)胞發(fā)揮作用，即與編碼多肽的DNA或mRNA結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)mRNA降解并抑制本發(fā)明多肽的表達(dá)，從而導(dǎo)致多肽功能受抑制。通過與對衍生物無活性的適當(dāng)基質(zhì)混合，可將本發(fā)明的反義寡核香酸衍生物制成外用制劑，如涂抹劑(liniment)或泥罨敷劑(poultice)。必要時(shí)，也可通過加入賦形劑、等滲劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、止痛劑等，將衍生物配制成片劑、粉劑、顆粒劑、膠嚢、脂質(zhì)體膠嚢、注射劑、溶液、滴鼻劑和凍干劑。通過下述的一般方法即可制備所述制劑。通過直接施用于病痛部位或注射至血管以使其到達(dá)病痛部位，將反義寡核苦酸衍生物施用給患者。也可使用反義寡核苦酸-固定介質(zhì)增加持久性和膜-通透性。所述介質(zhì)如脂質(zhì)體、聚-L-賴氨酸、脂質(zhì)、膽固醇、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑，或其衍生物?？筛鶕?jù)患者的身體狀況適當(dāng)調(diào)整本發(fā)明的反義寡核苷酸衍生物的劑量，并按所需的量使用所述劑量。例如，可以施用的劑量范圍為0.1至100mg/kg,優(yōu)選為0.1至50mg/kg。本發(fā)明還包括小的干擾RNA(siRNA),其含有核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5的有義鏈核酸和反義鏈核酸組合。更具體地，抑制RNF43表達(dá)的siRNA包括其有義鏈含有核苷酸序列SEQIDNO:40,41,42或43的siRNA。或者，抑制CXADRLl表達(dá)的siRNA包括其有義鏈含有核苷酸序列SEQIDNO:62或63的siRNA。術(shù)語"siRNA"指的是能防止靼mRNA翻譯的雙鏈RNA分子?？墒褂脤iRNA導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括將DNA用作模板以轉(zhuǎn)錄RNA的技術(shù)。siRNA含有編碼人CXADRLl，GCUD1或RNF43蛋白的多核苷酸(SEQIDNO:1，3或5)的有義核酸序列和反義核酸序列。構(gòu)建siRNA使得單個(gè)轉(zhuǎn)錄物(雙鏈RNA)具有來自靶基因的有義和互補(bǔ)反義序列，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)。該方法被用于改變細(xì)胞中的基因表達(dá)，其中在所述細(xì)胞中，作為例如細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的結(jié)果，CXADRL1,GCUD1或RNF43的表達(dá)被上調(diào)。siRNA與耙細(xì)胞中CXADRL1，GCUD1或RNF43轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)減少。寡核苷酸的長度至少為10個(gè)核苷酸，并且可以與天然轉(zhuǎn)錄物一樣長。優(yōu)選寡核苦酸長度為19-25個(gè)核苷酸。最優(yōu)選寡核苦酸長度少于75，50或25個(gè)核香酸。能抑制其在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)的CXADRLl,GCUD1或RNF43siRNA寡核苷酸的例子包括含有SEQIDNO:112-114中的任一個(gè)的寡核苷酸。這些序列分別是下述siRNA序列的靶序列。SEQIDNO:112,SEQIDNO:40,41(RNF43);SEQIDNO:113,SEQIDNO:42,43(RNF43);和SEQIDNO:114,SEQIDNO:62,63(CXADRL1)。<吏用可4尋自Ambion網(wǎng)站(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—fmder.html)的siRNA設(shè)計(jì)計(jì)算機(jī)程序設(shè)計(jì)siRNA的核香酸序列?；谙率龇桨竿ㄟ^計(jì)算機(jī)程序選擇siRNA合成所用的核普酸序列。選擇siRNA耙位點(diǎn)1.自目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始，掃描下游的AA二核苷酸序列。記錄每個(gè)AA和3'方向鄰接的19個(gè)核苷酸的出現(xiàn)，以作為潛在的siRNA草巴位點(diǎn)。TuscW等推薦針對5'和3'非翻譯區(qū)(UTR)和起始密碼子附近的區(qū)域(75個(gè)堿基以內(nèi))設(shè)計(jì)siRNA,因?yàn)樗鰠^(qū)域中的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)較多。UTR-結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可干擾siRNA內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié)合。2.將潛在的靶位點(diǎn)與人基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，無需考慮任何與其它編碼序列具有顯著同源性的靶序列?？墒褂媚茉贜CBI服務(wù)器(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中找到的BLAST進(jìn)行同源性檢索。3.選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion網(wǎng)站，優(yōu)選沿著需評價(jià)之基因的長度選擇幾個(gè)靶序列。本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA能抑制本發(fā)明多肽的表達(dá)，從而可用于抑制本發(fā)明多肽的生物活性。含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的表達(dá)-抑制劑也可用于抑制本發(fā)明多肽的生物活性。因此，含有本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的組合物可用于治療細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥。另外，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明多肽的表達(dá)水平作為診斷標(biāo)記以診斷細(xì)胞增殖性疾病的方法。該診斷方法包括步驟(a)檢測本發(fā)明的CX!D7ZJ，GCt/D/或iA^^基因的表達(dá)水平；和(b)將表達(dá)水平的升高與細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥相關(guān)聯(lián)。通過定量與CX4Z)iI/，GCW^減iA^^基因相對應(yīng)的mRNA或由所述基因編碼的蛋白質(zhì)，即可估計(jì)特定樣品中CX4DiZJ,GCW^4tRM^3基因的表達(dá)水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知定量mRNA的方法。例如，通過Northern印跡或RT-PCR即可估計(jì)出與CX4DW/,GCC/D7威i2A^V3基因相對應(yīng)的mRNA的水平。由于CX1D^ZJ,GCt/D7威^A^^基因的全長核苷酸序列示于SEQIDNO:1，3或5,本領(lǐng)咸的任何技術(shù)人員都可設(shè)計(jì)探針或引物的核苷酸序列以定量CX4DiL/,GCt/D/成/iVFW基因。也可基于基因所編碼蛋白質(zhì)的活性或量來分析CX4Z)虹人GCt/ZX^戈iA^W基因的表達(dá)水平。下文將描述測定CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白量的方法。例如，免疫測定法可用于測定生物材料中的蛋白質(zhì)。任何生物材料都可用于測定蛋白質(zhì)或其活性。例如，可分析血樣以估計(jì)由血清標(biāo)記編碼的蛋白質(zhì)。另一方面，可選擇適當(dāng)方法，以根據(jù)每種待分析蛋白質(zhì)的活性測定CX4i)/Z/，GCM)/4'iA^^基因所編碼蛋白質(zhì)的活性。估計(jì)樣品(檢測樣品)中CX1D/ZJ，GCf/Z)L戎/A^^基因的表達(dá)水平，并與正常樣品中的表達(dá)水平相比較。當(dāng)比較結(jié)果表明靶基因的表達(dá)水平高于正常樣品中的表達(dá)水平時(shí)，可以判斷受試者患有細(xì)胞增殖性疾病。可同時(shí)測定得自正常樣品和受試者的樣本中的CX4"^L/,(7C77D/4t^A^O基因的表達(dá)水平?；蛘撸苑治鱿惹皬膶φ战M收集的樣品中的基因表達(dá)水平所得的結(jié)果為基礎(chǔ)，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法測定表達(dá)水平的正常范圍。通過將受試者的樣品與正常范圍相比較得出結(jié)果；當(dāng)結(jié)果未落入正常范圍時(shí)，可判斷受試者患有細(xì)胞增殖性疾病。在本發(fā)明中，被診斷的細(xì)胞增殖性疾病優(yōu)選為癌癥。更優(yōu)選地，當(dāng)估計(jì)出CX4Z)虹7或GCC/D/基因的表達(dá)水平并與正常樣品中的表達(dá)水平相比較時(shí)，診斷出的細(xì)胞增殖性疾病是胃癌、結(jié)直腸癌或肝癌；而當(dāng)估計(jì)出i^FW基因的表達(dá)水平時(shí)，診斷出的疾病是結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌。在本發(fā)明中，還提供了診斷細(xì)胞增殖性疾病所用的診斷試劑，所述疾病如癌癥，包括胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌和肝癌。本發(fā)明的診斷試劑含有與本發(fā)明的多核苷酸或多肽結(jié)合的化合物。優(yōu)選與本發(fā)明的多核苷酸雜交的寡核苦酸或與本發(fā)明多肽結(jié)合的抗體可用作所述化合物。另外，本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的多肽篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法。所述篩選方法的實(shí)施方案包括步驟(a)使受試化合物與本發(fā)明的多肽接觸，(b)檢測本發(fā)明多肽與受試化合物之間的結(jié)合活性，和(c)選擇與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。用于篩選的本發(fā)明多肽可以是重組多肽或得自天然的蛋白質(zhì)，或其部分肽?？梢允褂萌魏问茉嚮衔?，例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、發(fā)酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化的或粗的蛋白質(zhì)、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。與受試化合物接觸的本發(fā)明多肽可以是例如純化的多肽、可溶性蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合的形式或與其它多肽融合的融合蛋白。至于使用本發(fā)明的多肽篩選蛋白質(zhì)，例如與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法，可以使用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法。通過例如免疫沉淀法，特別是按照下述方式即可進(jìn)行所述篩選。通過將基因插入外源基因的表達(dá)載體，如pSV2neo，pcDNAI和pCD8，在動物細(xì)胞等中表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的基因。用于表達(dá)的啟動子可以是任何常用的啟動子，包括例如SV40早期啟動子(RigbyinWilliamson(ed.),GeneticEngineering,vol.3.AcademicPress,London,83-141(1982))、EF-la啟動子(Kimetal.，Gene91:217-223(1990》、CAG啟動子(Niwaetal.，Gene108:193-200(1991))、RSVLTR啟動子(Cullen，MethodsinEnzymology152:684-704(1987))、SRa啟動子(Takebeetal.，MolCellBiol8:466(1988))、CMV即早期啟動子(SeedandAmffo,ProcNatlAcadSciUSA84:3365-3369(1987))、SV40晚期啟動子(GheysenandFiers,JMolApplGenet1:385-394(1982))、腺病毒晚期啟動子(Kaufmanetal.,MolCellBiol9:946(1989))、HSVTK啟動子等?？筛鶕?jù)任何方法將基因?qū)雱游锛?xì)胞以表達(dá)外源基因，所述方法如電穿孔法(Chuetal.,NucleicAcidsRes15:1311-1326(1987))、磷酸鈣法(ChenandOkayama，MolCellBiol7:2745-2752(1987))、DEAE葡聚糖法(Lopataetal.，NucleicAcidsRes12:5707-5717(1984);SussmanandMilman，MolCellBiol4:GAS-WAS(1985))、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(Derijard,BCell7:1025-1037(1994);Lambetal.,NatureGenetics5:22-30(1993):Rabindranetal.，Science259:230-234(1993))等。通過在本發(fā)明多肽的N-或C-末端導(dǎo)入特異性已被揭示的單克隆抗體表位，可將本發(fā)明的多肽表達(dá)成含有單克隆抗體識別位點(diǎn)(表位)的融合蛋白?？梢允褂蒙藤彽谋砦?抗體系統(tǒng)(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。利用其多克隆位點(diǎn)表達(dá)與例如p-半乳糖苦酶、麥芽糖-結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、綠色焚光蛋白(GFP)等的融合蛋白的載體可以商購。本文還報(bào)道了通過僅導(dǎo)入由幾個(gè)至十幾個(gè)氨基酸組成的小表位而制備的融合蛋白，以致于融合不會改變本發(fā)明多肽的特性。諸如聚組氨酸(His-標(biāo)記)、流感病毒聚集體HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-標(biāo)記)、人單純皰滲病毒糖蛋白(HSV-標(biāo)記)、E-標(biāo)記(單克隆噬菌體上的表位)等的表位和識別它們的單克隆抗體可用作表位-抗體系統(tǒng)，用于篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。在免疫沉淀中，通過在使用適當(dāng)去污劑制備的細(xì)胞裂解物中加入這些抗體以形成免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物由本發(fā)明的多肽、能與所述多肽結(jié)合的多肽和抗體組成。除了使用抗上述表位的抗體外，還可使用可按上文所述制備的抗本發(fā)明多肽的抗體進(jìn)^f亍免疫沉淀。當(dāng)抗體是小鼠IgG抗體時(shí)，可通過例如蛋白ASepharose凝膠或蛋白GSepharose凝膠沉淀免疫復(fù)合物。如果本發(fā)明的多肽被制備成與表位，如GST的融合蛋白，可按照與使用抗本發(fā)明多肽的抗體相同的方式，使用與這些表位特異性結(jié)合的物質(zhì)，如谷胱甘肽-Sepharose4B形成免疫復(fù)合物?？筛鶕?jù)或按照例如文獻(xiàn)中所述的方法(HarlowandLane,Antibodies,511-552，ColdSpringHarborLaboratorypublications,NewYork(1988))進(jìn)4亍免疫沉淀。SDS-PAGE常用于分析被免疫沉淀的蛋白質(zhì)，使用具有適當(dāng)濃度的凝膠，通過蛋白質(zhì)的分子量可分析結(jié)合的蛋白質(zhì)。由于通過普通的染色法，如考馬斯染色或銀染難以檢測與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)，通過在含有放射性同位素"S-曱硫氨酸或35s-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞中的蛋白質(zhì)并檢測蛋白質(zhì)即可改善蛋白質(zhì)的檢測敏感性。當(dāng)已揭示出蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，可直接從SDS-聚丙烯酰胺凝膠中純化靶蛋白質(zhì)并測定其序列。至于使用本發(fā)明多肽篩選與所述多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法，可以使用例如West-Western印跡分析(Skolniketal.,Cell65:83-卯(1991))。具體地說，可通過下述步驟獲得與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)使用噬菌體載體(如ZAP),由有望表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的細(xì)胞、組織、器官(例如，篩選與CXADRL1結(jié)合的蛋白質(zhì)時(shí)，所述組織如睪丸和卵巢；篩選與GCUD1結(jié)合的蛋白質(zhì)時(shí)，所述組織為睪丸、卵巢和腦；篩選與RNF43結(jié)合的蛋白質(zhì)時(shí)，所述組織為胎肺和胎腎)或經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞制備cDNA文庫，在LB-瓊脂糖上表達(dá)蛋白質(zhì)，將表達(dá)的蛋白質(zhì)固定于濾膜上，使經(jīng)純化和標(biāo)記的本發(fā)明多肽與上述濾膜反應(yīng)，以及根據(jù)標(biāo)記檢測表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的噬斑。利用生物素和親和素之間的結(jié)合，或利用與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體，或與本發(fā)明多肽融合的肽或多肽(如GST),可以標(biāo)記本發(fā)明的多肽。也可利用使用放射性同位素或熒光等的方法?；蛘?，在本發(fā)明篩選方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，可4吏用利用細(xì)胞的雙-雜合系統(tǒng)("MATCHMAKER雙-雜合系統(tǒng)，，，"哺乳動物MATCHMAKER雙-雜合試驗(yàn)試劑盒"，"MATCHMAKER單-雜合系統(tǒng)，，(Clontech);"HybriZAP雙-雜合載體系統(tǒng)"(Stratagene);參見文獻(xiàn)"DaltonandTreisman,Cell68:597-612(1992)"，"FieldsandSternglanz,TrendsGenet10:286-292(1994)，,)。在雙-雜合系統(tǒng)中，本發(fā)明的多肽與SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)融合并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。cDNA文庫制備自有望表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的細(xì)胞，使得所述文庫表達(dá)時(shí)能與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。然后將cDNA文庫導(dǎo)入上述酵母細(xì)胞，從檢測到的陽性克隆中分離得自文庫的cDNA(當(dāng)在酵母細(xì)胞中表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)時(shí)，兩者的結(jié)合激活了報(bào)道基因，使得陽性克隆能被檢測到)。通過將上文分離到的cDNA導(dǎo)入大腸桿菌并表達(dá)蛋白質(zhì)即可制備由cDNA編碼的蛋白質(zhì)。至于報(bào)道基因，除了HIS3基因外，還可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。也可使用親和層析篩選與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。例如，可將本發(fā)明的多肽固定在親和柱的載體上，將含有能與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的受試化合物上樣于親和柱。本文中的受試化合物可以是例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞裂解物等。上樣受試化合物之后，洗滌柱，即可制備與本發(fā)明多肽結(jié)合的化合物。當(dāng)受試化合物是蛋白質(zhì)時(shí)，分析所得蛋白質(zhì)的氨基酸序列，基于所述序列合成寡DNA,使用該寡DNA作為探針篩選cDNA文庫以獲得編碼蛋白質(zhì)的DNA。在本發(fā)明中，使用表面胞質(zhì)基因組共振現(xiàn)象的生物傳感器可用作檢測或定量結(jié)合化合物的儀器。當(dāng)使用所述生物傳感器時(shí)，僅使用極少量的多肽并且無需標(biāo)記，即可實(shí)時(shí)觀察到表現(xiàn)為表面胞質(zhì)基因組共振信號的本發(fā)明多肽和受試化合物之間的相互作用(例如BIAcore,Pharmacia)。因此，可以使用生物傳感器，如BIAcore評價(jià)本發(fā)明多肽和受試化合物之間的結(jié)合。當(dāng)固定化的本發(fā)明多肽暴露于合成化合物，或天然物質(zhì)庫，或隨機(jī)噬菌體肽展示文庫時(shí)篩選結(jié)合分子的方法，以及基于組合化學(xué)技術(shù)(Wrightonetal.,Science273:458-64(1996);Verdine,Nature384:11-13(1996);Hogan,Nature384:17-9(1996))進(jìn)行高通量篩選從而不僅分離出蛋白質(zhì)，還分離出與本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物(包括激動劑和拮抗劑)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的?；蛘?，本發(fā)明的篩選方法可包括下述步驟a)使候選化合物與已導(dǎo)入載體的細(xì)胞接觸，所述載體含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制之下表達(dá)的^艮道基因，其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因選自CXADRL1,GCUD1和RNF43,b)測定所述報(bào)道基因的活性；和c)選擇與對照相比能降低所述報(bào)道基因的表達(dá)水平的化合物。適當(dāng)?shù)膱?bào)道基因和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域眾所周知的。通過使用標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以制備篩選所需的報(bào)道構(gòu)建體。當(dāng)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知時(shí)，使用先前已知的序列信息即可制備報(bào)道構(gòu)建體。當(dāng)仍未鑒定出標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)時(shí)，可基于標(biāo)記基因的核苷酸序列信息，從基因組文庫中分離出含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的核苦酸區(qū)段。通過篩選分離出的化合物是能促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的候選藥物，可用于治療或預(yù)防例如細(xì)胞增殖性疾病所導(dǎo)致的疾病，如癌癥。通過本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物包括這樣一種化合物，其中通過本發(fā)明的篩選方法獲得的、具有與本發(fā)明多肽結(jié)合之活性的化合物的部分結(jié)構(gòu)通過添加、缺失和/或取代被改變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了篩選候選藥劑的方法，所述藥劑是治療細(xì)胞增殖性疾病的潛在靶。如上文所詳細(xì)討論的，通過控制CXADRL1,GCUD1或RNF43的表達(dá)水平，就可以控制胃癌，或結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，通過利用CXADRL1，GCUD1或RNF43的表達(dá)水平和活性作為指標(biāo)進(jìn)行篩選，即可鑒定出身為治療細(xì)胞增殖性疾病的潛在靶的候選藥劑。在本發(fā)明的上下文中，所述篩選包括例如下述步驟a)使候選化合物與表達(dá)CXADRLl，GCUD1或RNF43的細(xì)胞接觸；和b)選擇與缺乏所述化合物時(shí)檢測到的表達(dá)水平相比，能降低CXADRL1GCUD1或RNF43表達(dá)水平的化合物。42表達(dá)CXADRL1，GCUD1或RNF43中的至少一種的細(xì)胞包括例如由胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌或肝癌建立的細(xì)胞系；所述細(xì)胞可用于本發(fā)明的上述篩選。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法即可估計(jì)出表達(dá)水平。在篩選方法中，可將能降低CXADRL1，GCUD1或RNF43中的至少一種的表達(dá)水平的化合物選擇為候選藥劑。在本發(fā)明的另一個(gè)篩選治療細(xì)胞增殖性疾病所用化合物的方法的實(shí)施方案中，所述方法利用本發(fā)明多肽的生物活性作為指標(biāo)。由于本發(fā)明的CXADRL1,GCUD1或RNF43蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性，使用此活性作為指標(biāo)可以篩選出能促進(jìn)或抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)之一的此活性的化合物。該篩選方法包括步驟(a)使受試化合物與本發(fā)明的多肽接觸；(b)4全測步驟(a)中多肽的生物活性；和(c)選擇與缺乏受試化合物時(shí)檢測到的生物活性相比，能抑制多肽生物活性的化合物。任何多肽都可用于篩選，只要它們具有CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的生物活性即可。所述生物活性包括人CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白的細(xì)胞-增殖活性，RNF43與NOTCH2或STRIN結(jié)合的活性。例如，可使用人CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白，也可使用與這些蛋白質(zhì)功能等同的多肽。所述多肽可由細(xì)胞內(nèi)源或外源性地表達(dá)。可以使用任何受試化合物，例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、發(fā)酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化的或粗的蛋白質(zhì)、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物或天然化合物。通過所述篩選分離出的化合物是本發(fā)明多肽的候選激動劑或拮抗劑。術(shù)語"激動劑"指的是通過與本發(fā)明多肽結(jié)合而激活所述多肽功能的分子。類似地，術(shù)語"拮抗劑"指的是通過與本發(fā)明多肽結(jié)合而抑制所述多肽功能的分子。另外，通過所述篩選分離出的化合物是能抑制本發(fā)明多肽與分子(包括DNA和蛋白質(zhì))的體內(nèi)相互作用的候選化合物。當(dāng)本發(fā)明方法欲檢測的生物活性是細(xì)胞增殖時(shí)，通過例如制備能表達(dá)本發(fā)明多肽的細(xì)胞，在受試化合物的存在下培養(yǎng)細(xì)胞，并按實(shí)施例中所述測定細(xì)胞增殖的速度，測定細(xì)胞周期，以及測定集落形成活性即可檢測到所述活性。通過上述篩選分離出的化合物是能抑制本發(fā)明多肽之活性的候選藥物，并可用于治療與本發(fā)明多肽相關(guān)的疾病，如包括癌癥的細(xì)胞增殖性疾病。更具體地，當(dāng)將CXADRLi或GCUDl蛋白的生物活性用作指標(biāo)時(shí)，通過本發(fā)明的方法篩選的化合物用作治療胃癌、結(jié)直腸癌或肝癌的候選藥物。另一方面，當(dāng)將RNF43蛋白的生物活性用作指標(biāo)時(shí)，通過本發(fā)明的方法篩選的化合物還可用作治療結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌的候選藥物。另外，通過本發(fā)明的篩選方法可以獲得的化合物還包括這樣一種化合物，其中能抑制CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白之活性的化合物的部分結(jié)構(gòu)通過添加、缺失和/或取代被改變。在本發(fā)明的另一個(gè)篩選治療細(xì)胞增殖性疾病所用化合物的方法的實(shí)施方案中，所述方法利用RNF43與NOTCH2或STRIN的結(jié)合能力。已證實(shí)本發(fā)明的RNF43蛋白能與NOTCH2和STRIN結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)表明本發(fā)明的RNF43蛋白通過與諸如NOTCH2和STRIN的分子結(jié)合而發(fā)揮細(xì)胞增殖功能-。因此，抑制RNF43蛋白與NOTCH2或STRIN之間的結(jié)合有望導(dǎo)致細(xì)胞增殖受抑制，能抑制結(jié)合的化合物可用作治療細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥的直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌。該篩選方法包括步驟(a)在受試化合物的存在下使本發(fā)明的多肽與NOTCH2或STRIN接觸；(b)檢測多肽與NOTCH2或STRIN之間的結(jié)合；和(c)選擇能抑制多肽與NOTCH2或STRIN之間的結(jié)合的化合物。用于篩選的本發(fā)明的RNF43多肽以及NOTCH2或STRIN可以是重組多肽或天然來源的蛋白質(zhì)，或者也可以是它們的部分肽，只要能保留彼此之間的結(jié)合能力即可。用于篩選的RNF43多肽、NOTCH2或STRIN可以是例如純化的多肽、可溶性蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合的形式或與其它多肽融合的融合蛋白?？梢允褂萌魏问茉嚮衔铮缂?xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、發(fā)酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化的或粗的蛋白質(zhì)、肽、非-肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。至于篩選能抑制RNF43蛋白與NOTCH2或STRIN結(jié)合的化合物的方法，可使用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法。可在體外檢測系統(tǒng)，如細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行篩選。更具體地，首先使RNF43多肽，或者NOTCH2或STRIN與.支持物結(jié)合，再在支持物上添加另一種蛋白質(zhì)以及受試樣品。接著保溫混合物，洗滌，檢測和/或測定與支持物結(jié)合的另一種蛋白質(zhì)。同樣，通過本發(fā)明可分離出能干擾CXADRL1和AIP1結(jié)合的化合物。抑制CXADRL1和AIP1之間的結(jié)合有望能抑制細(xì)胞增殖，而能抑制結(jié)合的化合物可用作治療細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥的藥物?？捎糜诮Y(jié)合蛋白質(zhì)的支持物包括例如不溶性的多糖，如瓊脂糖、纖維素和葡聚糖；和合成樹脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；優(yōu)選使用由上述材料制備的可商購的珠和板(如多孔板，生物傳感器芯片等)。當(dāng)使用珠時(shí)，可將其填充于柱中?？筛鶕?jù)常規(guī)方法，如化學(xué)鍵合和物理吸附使蛋白質(zhì)與支持物結(jié)合?；蛘?，可經(jīng)由特異性識別蛋白質(zhì)的抗體使蛋白質(zhì)與支持物結(jié)合。另外，也可以利用親和素和生物素結(jié)合使蛋白質(zhì)與支持物結(jié)合。在例如，但不限于磷酸緩沖液和Tris緩沖液的緩沖液中進(jìn)行蛋白質(zhì)之間的結(jié)合，只要緩沖液不會抑制蛋白質(zhì)之間的結(jié)合即可。在本發(fā)明中，使用表面胞質(zhì)基因組共振現(xiàn)象的生物傳感器可用作檢測或定量結(jié)合蛋白質(zhì)的儀器。當(dāng)使用所述生物傳感器時(shí)，僅使用極少量的多肽并且無需標(biāo)記，即可實(shí)時(shí)觀察到表現(xiàn)為表面胞質(zhì)基因組共振信號的蛋白質(zhì)之間的相互作用(例如BIAcore,Pharmacia)。因此，可以4吏用生物傳感器，如BIAcore評價(jià)RNF43多肽與NOTCH2或ST腿之間的結(jié)合?；蛘撸蓸?biāo)記RNTF43多肽，或NOTCH2或STRIN,結(jié)合蛋白質(zhì)的標(biāo)記可用于檢測或測定結(jié)合蛋白質(zhì)。具體地，預(yù)標(biāo)記一種蛋白質(zhì)之后，在受試化合物的存在下使標(biāo)記的蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)接觸，洗滌后根據(jù)標(biāo)記檢測或測定結(jié)合蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的方法中，可使用標(biāo)記物質(zhì)，如放射性同位素(如3fi，14C,32p，33p，35s,125j，13、、酶(如械性磷酸酶、辣根過氧化物酶、p-半乳糖苷酶、p-葡糖苷酶)、熒光物質(zhì)(如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明)和生物素/親和素標(biāo)記蛋白質(zhì)。當(dāng)用放射性同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)，可通過液體閃爍進(jìn)行4全測或測定?；蛘?，通過加入酶底物，用吸光計(jì);險(xiǎn)測底物的酶促變化，如顏色的產(chǎn)生，即可檢測或測定用酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)。另外，當(dāng)將熒光物質(zhì)用作標(biāo)記時(shí)，可使用熒光光度計(jì)檢測或測定結(jié)合蛋白質(zhì)。RNF43多肽與NOTCH2或STRIN的結(jié)合。例如，使固定于支持物上的RNF43多肽與受試化合物和NOTCH2或STRIN接觸之后，保溫混合物并洗滌，使用抗NOTCH2或STRIN的抗體進(jìn)行檢測或測定?；蛘撸瑢OTCH2或STRIN固定于支持物上，將抗RNF43的抗體用作抗體。當(dāng)在本發(fā)明的篩選方法中使用抗體時(shí)，優(yōu)選用上述的一種標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記抗體，并基于標(biāo)記物質(zhì)檢測或測定抗體?；蛘撸瑢⒖筊NF43多肽、NOTCH2或STRIN的抗體用作第一抗體，用經(jīng)標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的第二抗體可以檢測出所述第一抗體。另外，使用蛋白G或蛋白A柱可以4企測或測定在本發(fā)明的篩選方法中與蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。或者，在本發(fā)明篩選方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用利用細(xì)胞的雙-雜合系統(tǒng)("MATC畫AKER雙-雜合系統(tǒng)"，"哺乳動物MATCHMAKER雙陽雜合試驗(yàn)試劑盒"，"MATCHMAKER單-雜合系統(tǒng)，，(Clontedi);"HybriZAP雙-雜合載體系統(tǒng)，，(Stratagene);參見文獻(xiàn)"DaltonandTreisman，Cell68:597-612(1992)，，，"FieldsandStemglanz,TrendsGenet10:286-292(1994)")。在雙-雜合系統(tǒng)中，本發(fā)明的RNF43多肽與SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)融合并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。與本發(fā)明的RNF43多肽結(jié)合的NOTCH2或STRIN與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合，并能在受試化合物的存在下在酵母細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)受試化合物不能抑制RNF43多肽與NOTCH2或STRIN之間的結(jié)合時(shí)，兩者的結(jié)合會激活報(bào)道基因，使得陽性克隆能被;險(xiǎn)測到。至于報(bào)道基因，除了HIS3基因外，還可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。通過篩選分離出的化合物是能抑制本發(fā)明RNF43蛋白之活性的候選藥物，并可用于治療與RNF43蛋白相關(guān)的疾病，例如細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥，更具體地為結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌。另外，通過本發(fā)明的篩選方法可以獲得的化合物還包括這樣一種化合物，其中能抑制RNF43蛋白與代被改變。當(dāng)將通過本發(fā)明的方法分離出的化合物作為藥物施用于人和其它哺乳動物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、雞、貓、狗、綿羊、豬、牛、猴、狒狒、黑猩猩以治療細(xì)胞增殖性疾病(如癌癥)時(shí)，可直接施用分離的化合物，或使用已知的藥物制備方法將其配制成劑量形式。例如，根據(jù)需要，可以糖衣片劑、膠嚢、酏劑和微嚢劑型口服藥物，或者以溶于水或任何其它藥物可接受液體的無菌溶液或懸浮液注射劑形式非口服給藥。例如，可以常規(guī)藥物實(shí)踐所需的單位劑量形式將化合物與藥學(xué)可接受載體或介質(zhì)混合，所述載體或介質(zhì)具體地為無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、增味劑、賦形劑、載體、防腐劑、結(jié)合劑等。這些制品中活性成分的量能提供所示范圍內(nèi)的適當(dāng)劑量?？膳c片劑和膠嚢混合的添加劑的例子有如明膠、玉米淀粉、黃蓍膠和阿拉伯膠的結(jié)合劑；如晶體纖維素的賦形劑；如玉米淀粉、明膠和藻酸的膨脹劑；如硬脂酸鎂的潤滑劑；如蔗糖、乳糖或糖精的甜味劑；如胡椒薄荷、Gaultheriaadenothrix油和櫻桃的增味劑。當(dāng)單位劑量形式是膠嚢時(shí)，上述成分中還可包括液體載體，如油?？墒褂米⑸溆幂d體，如蒸餾水，根據(jù)常規(guī)藥物實(shí)踐配制注射用的無菌混合物。'生理鹽水、葡萄糖和其它包括助劑的等滲液體，如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉可用作注射用的水溶液。它們可與適當(dāng)?shù)脑鋈軇绱?，特別是乙醇；聚醇，如丙二醇和聚乙二醇；非離子型表面活性劑，如Polysorbate80(TM)和HCO-50—起使用。芝麻油或豆油可用作油質(zhì)液體，并可與苯曱酸千酯或千醇一起用作增溶劑，并可與如磷酸緩沖液和醋酸鈉緩沖液的緩沖液；如鹽酸普魯卡因的止痛劑；如千醇、酚的穩(wěn)定劑；和抗氧化劑一起配制。可將制備好的注射液注入適當(dāng)?shù)陌参嵬咧??？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法給患者施用本發(fā)明的藥物組合物，例如以動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮注射給藥和鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管、肌內(nèi)或口服給藥。給藥劑量和方法隨患者體重和年齡的變化而改變；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)選擇給藥劑量和方法。如果所述化合物可由DNA編碼，可將DNA插入基因治療載體，施用所述載體以進(jìn)行治療。給藥劑量和方法隨患者體重、年齡和癥狀的變化而改變；但本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)選擇給藥劑量和方法。例如，當(dāng)給正常成人(體重為60kg)口服給藥時(shí)，盡管根據(jù)癥狀的不同有一些差異，但與本發(fā)明多肽結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物劑量約為0.lmg至100mg/天，優(yōu)選約為1.0mg至50mg/天，更優(yōu)選約為1.0mg至20mg/天。當(dāng)以注射液形式給正常成人(體重為60kg)非腸道給藥時(shí)，盡管根據(jù)患者、靶器官、癥狀和給藥方法的不同有一些差異，但合適的靜脈內(nèi)注射劑量約為0.01mg至30mg/天，優(yōu)選約為0.1至20mg/天，更優(yōu)選約為0.1至10mg/天。當(dāng)給其它動物給藥時(shí)，可以施用被轉(zhuǎn)換成60kg體重的量。另外，本發(fā)明提供了使用抗本發(fā)明多肽的抗體治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥的方法。根據(jù)此方法，需施用藥物有效量的抗本發(fā)明多肽的抗體。由于CXADRLl,GCUD1和RNF43蛋白的表達(dá)在癌細(xì)胞中被上調(diào)，因此抑制這些蛋白質(zhì)的表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性降低，通過抗體與這些蛋白質(zhì)的結(jié)合有望治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病。因此，以足以降低本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的劑量施用抗本發(fā)明多肽的抗體，所述劑量范圍是0.1至約250mg/kg/天。成人的劑量范圍一般約為5mg至17.5g/天，優(yōu)選約為5mg至10g/天，最優(yōu)選約為100mg至3g/天?；蛘?，將與特異于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記結(jié)合的抗體用作藥物傳遞的工具。例如，以足以損傷腫瘤細(xì)胞的劑量施用與細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)的抗體。本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)抗-腫瘤免疫力的方法，所述方法包括施用CXADRL1,GCUD1或RNF43蛋白或其免疫活性片段，或編碼蛋白質(zhì)或其片段的多核苦酸的步驟。CXADRL1,GCUD1或RNF43蛋白或其免疫活性片段可用作抗細(xì)胞增殖性疾病的疫苗。在某些情況下，蛋白質(zhì)或其片段可以與T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合的形式，或者以被抗原呈遞細(xì)胞(APC)，如巨噬細(xì)胞、樹狀細(xì)胞(DC)或B-細(xì)胞呈遞的形式被施用。由于DC具有強(qiáng)的抗原呈遞能力，因此在APC中最優(yōu)選使用DC。在本發(fā)明中，抗細(xì)胞增殖性疾病的疫苗指的是當(dāng)接種于動物時(shí)，具有誘導(dǎo)抗-腫瘤免疫力功能的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，含有氨基酸序列SEQIDNO:80,97或108的多肽是HLA-A24或HLA-A承0201限制性的表位肽，它們能誘導(dǎo)針對表達(dá)RNF43的結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌或肝癌細(xì)胞的強(qiáng)有力的特異性免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，含有氨基酸序列SEQIDNO:124的多肽是HLA-八*0201限制性的表位肽，它們能誘導(dǎo)針對表達(dá)CXADRL1的結(jié)腸癌、胃癌或肝癌細(xì)胞的強(qiáng)有力的特異性免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，含有氨基酸序列SEQIDNO:164的多肽是HLA-A^201限制性的表位肽，它們能誘導(dǎo)針對表達(dá)GCUD1的結(jié)腸癌、胃癌或肝癌細(xì)胞的強(qiáng)有力的特異性免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明還包括使用含有氨基酸序列SEQIDNO:80，97,108,124或164的多肽誘導(dǎo)抗-腫瘤免疫力的方法。一般說來，抗-腫瘤免疫力包括如下所述的免疫應(yīng)答-誘導(dǎo)抗腫瘤的-細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞，-誘導(dǎo)識別腫瘤的抗體，和-誘導(dǎo)產(chǎn)生抗-肺瘤的細(xì)胞因子。因此，當(dāng)將某種蛋白質(zhì)接種于動物可誘導(dǎo)任一種免疫應(yīng)答時(shí)，就可以說該蛋白質(zhì)具有誘導(dǎo)抗-腫瘤免疫力的作用。通過觀察宿主免疫系統(tǒng)在體內(nèi)或體外針對蛋白質(zhì)的反應(yīng)，即可檢測出蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的抗-肺瘤免疫力。例如，檢測細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的方法是眾所周知的。進(jìn)入活體的外源物質(zhì)通過抗原呈遞細(xì)胞(APC)的作用被呈遞至T細(xì)胞和B細(xì)胞。以抗原特異性方式對APC呈遞的抗原作出反應(yīng)的T細(xì)胞因受抗原的刺激而分化成細(xì)胞毒T細(xì)胞(或細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞；CTL),然后進(jìn)行增殖(也稱作T細(xì)胞激活)。因此，通過用APC將某種肽呈遞至T細(xì)胞，并檢測CTL的誘導(dǎo)即可評價(jià)肽導(dǎo)致的CTL誘導(dǎo)。另外，APC具有激活CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的作用。由于CD4十T細(xì)胞和CD8十T細(xì)胞對抗-腫瘤免疫力也很重要，因此，使用這些細(xì)胞的激活作用作為標(biāo)志，即可評價(jià)肽的抗-腫瘤免疫力誘導(dǎo)作用。知的。DC是APC中具有最強(qiáng)CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC。在此方法中，起初使受試多肽與DC接觸，然后使該DC與T細(xì)胞接觸。與DC接觸后檢測到具有針對感興趣細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的T細(xì)胞，這表明受試多肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞的活性。例如，使用"Cr-標(biāo)記的肺瘤細(xì)胞的裂解作為標(biāo)志，可以檢測抗腫瘤的CTL活性。或者，使用3H-胸苷攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)-釋放作為標(biāo)志評價(jià)肺瘤細(xì)胞損害程度的方法也是眾所周知的。除了DC外，也可將外周血單核細(xì)胞(PBMC)用作APC。在這種情況下，據(jù)報(bào)道，在GM-CSF和IL-4的存在下培養(yǎng)PBMC可以增強(qiáng)CTL誘導(dǎo)。類似地，已證實(shí)在匙孔戚血藍(lán)蛋白(KLH)和IL-7的存在下培養(yǎng)PBMC可以誘導(dǎo)CTL。經(jīng)這些方法證實(shí)具有CTL誘導(dǎo)活性的受試多肽是具有DC激活作用繼而具有CTL誘導(dǎo)活性的多肽。因此，能誘導(dǎo)針對胂瘤細(xì)胞的CTL的多肽可用作抗腫瘤疫苗。另外，通過與多肽接觸獲得誘導(dǎo)抗腫瘤CTL的能力的APC可用作抗腫瘤疫苗。另外，因APC呈遞多肽抗原而獲得細(xì)胞毒性的CTL也可用作抗腫瘤疫苗。使用APC和CTL所導(dǎo)致的抗-腫瘤免疫力的腫瘤治療方法被稱為細(xì)胞免疫治療。通常，當(dāng)使用多肽進(jìn)行細(xì)胞免疫治療時(shí)，已知混合多種具有不同結(jié)構(gòu)的多肽并將它們與DC接觸可以增加CTL-誘導(dǎo)的效率。因此，當(dāng)用蛋白質(zhì)片段刺激DC時(shí)，使用多種類型的片段較為有利?；蛘?，通過觀察對抗腫瘤抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo)可以進(jìn)一步證實(shí)多肽對抗-腫瘤免疫力的誘導(dǎo)。例如，當(dāng)在用多肽免疫的實(shí)驗(yàn)室動物中誘導(dǎo)出抗多肽的抗體時(shí)，以及在腫瘤細(xì)胞的生長受所述抗體抑制時(shí)，可測定出多肽具有誘導(dǎo)抗-腫瘤免疫力的能力。通過施用本發(fā)明的疫苗可誘導(dǎo)抗-腫瘤免疫力，所述抗-腫瘤免疫力的誘導(dǎo)可治療和預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病，如胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌和肝癌?？拱┲委熁虬┌Y發(fā)生的預(yù)防包括下述步驟中的任何一種，如抑制癌細(xì)胞生長、癌癥的退化和對癌癥發(fā)生的抑制作用。癌癥的治療或預(yù)防也包括患癌個(gè)體死亡率的降低、血液中胂瘤標(biāo)記的減少、與癌癥相伴隨的可測癥狀的減輕等。優(yōu)選治療和預(yù)防作用在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的，例如，與未施用疫苗的對照相比，優(yōu)選在5%或更低的顯著性水平上觀察到抗細(xì)胞增殖性疾病的治療或預(yù)防效果。例如，Student'st-試驗(yàn)、Mann-WhitneyU-試驗(yàn)或ANOVA可用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。上述具有免疫活性的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的載體可與佐劑混合。佐劑指的是當(dāng)與具有免疫活性的蛋白質(zhì)一起(或相繼)施用時(shí)能增強(qiáng)抗蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答的化合物。佐劑的例子包括霍亂毒素、沙門氏菌毒素、明礬等，但并不局限于此。另外，本發(fā)明的疫苗可與藥物可接受載體適當(dāng)混合。所述載體的例子是無菌水、生理鹽水、磷酸緩沖液、培養(yǎng)液等。另夕卜，必要時(shí)疫苗還可含有穩(wěn)定劑、懸浮劑、防腐劑、表面活性劑等?？扇砘蚓植渴┯靡呙??？赏ㄟ^單次給藥施用疫苗，或通過多次給藥加強(qiáng)免疫。當(dāng)使用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗時(shí)，可通過例如來自體內(nèi)的方法治療或預(yù)防腫瘤。更具體地，收集接受治療或預(yù)防的受試者的PBMC，使來自體內(nèi)的細(xì)胞與多肽接觸，誘導(dǎo)APC或CTL之后，可給受試者施用細(xì)胞。也可通過在來自體內(nèi)的PBMC中導(dǎo)入編碼多肽的載體來誘導(dǎo)APC。在給藥前可克隆在體外誘導(dǎo)的APC或CTL。通過克隆和培養(yǎng)具有較高靶細(xì)胞損害活性的細(xì)胞，可更有效地進(jìn)行細(xì)胞免疫治療。另外，按此方式分離的APC和CTL不僅可甩于針對細(xì)胞所來源的個(gè)體的細(xì)胞免疫治療，還可用于針對來自其它個(gè)體的相似類型腫瘤的細(xì)胞免疫治療。另外，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病，如癌癥的藥物組合物，其含有藥物有效量的本發(fā)明多肽。藥物組合物可用于產(chǎn)生抗腫瘤免疫力。CXADRL1的正常表達(dá)局限于睪丸和卵巢，GCUD1的正常表達(dá)局限于睪丸、卵巢和腦；而RNF43的正常表達(dá)局限于胎兒，更具體地為胎肺和胎腎。因此，抑制這些基因不會對其它器官有不利影響。因此，優(yōu)選使用CXADRL1和GCUD1多肽治療細(xì)胞增殖性疾病，特別是胃癌、結(jié)腸癌或肝癌；優(yōu)選使用RNF43多肽治療細(xì)胞增殖性疾病，特別是結(jié)腸癌、肺癌、胃癌和肝癌。另外，由于已證實(shí)分別含有氨基酸序列SEQIDNO:80,97和108的RNF43肽片段能誘導(dǎo)抗RNF43的免疫應(yīng)答，因此，含有氨基酸序列SEQIDNO:80,97或108的多肽是用于藥物組合物的優(yōu)選多肽的例子，所述組合物可用于治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病，特別是結(jié)腸癌、肺癌、胃癌和肝癌。另外，由于已證實(shí)分別含有氨基酸序列SEQIDNO:124的CXADRL1肽片段能誘導(dǎo)抗CXADRL1的免疫應(yīng)答，因此，含有氨基酸序列SEQIDNO:124的多肽是用于藥物組合物的優(yōu)選多肽的例子，所述組合物可用于治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病，特別是結(jié)腸癌、肺癌、胃癌和肝癌。另外，由于已證實(shí)分別含有氨基酸序列SEQIDNO:164的GCUD1肽片段能誘導(dǎo)抗GCUD1的免疫應(yīng)答，因此，含有氨基酸序列SEQIDNO:164的多肽是用于藥物組合物的優(yōu)選多肽的例子，所述組合物可用于治療或預(yù)防細(xì)胞增殖性疾病，特別是結(jié)腸癌、肺癌、胃癌和肝癌。在本發(fā)明中，以足以誘導(dǎo)抗-月中瘤免疫力的劑量施用多肽或其片段，所述劑量范圍是0.1mg至10mg，優(yōu)選為0.3mg至5mg，更優(yōu)選為0.8mg至1.5mg?？梢灾貜?fù)給藥。例如，每2周可施用lmg肽或其片段4次以誘導(dǎo)抗-腫瘤免疫力。提供下述實(shí)施例是為了闡明本發(fā)明，并幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員制備和使用本發(fā)明。這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員所通常理解的意思相同。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或檢驗(yàn)中可使用與本文所述類似或等同的方法和材料，但下文描述了適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?。本文提及的任何專利、專利申請和出版物都列入本文作為參考。?shí)施本發(fā)明的最佳模式51通過下述實(shí)施例詳細(xì)闡明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。l.材料與方法(1)患者和組織樣本在已接受外科手術(shù)的患者知情同意的情況下，從其手術(shù)樣品中獲得所有胃癌和結(jié)腸癌組織以及相應(yīng)的非-癌組織。(2)全基因組cDNA微陣列在此研究中使用含有23040個(gè)基因的來自機(jī)構(gòu)內(nèi)部的全基因組cDNA微陣列。從微量解剖組織中提取總RNA，用DNaseI處理提取的總RNA,用AmpliscribeT7轉(zhuǎn)錄試劑盒(EpicentreTechnologies)進(jìn)行擴(kuò)增，并在逆轉(zhuǎn)錄過程中使用Cy-染料(Amersham)進(jìn)行標(biāo)記(分別使用Cy5和Cy3標(biāo)記得自非-癌組織和腫瘤的RNA)。然后，根據(jù)先前描述的方法(Onoetal.，CancerRes60:5007-11(2000))進(jìn)行雜交、洗滌和4全測，使用ArrayVision軟件(AmershamPharmacia)測定每個(gè)靼點(diǎn)Cy5和Cy3的熒光強(qiáng)度。每個(gè)點(diǎn)測定雙份數(shù)值，減去背景信號之后，計(jì)算兩個(gè)值的平均值。然后，將載玻片上的所有熒光強(qiáng)度歸一化以調(diào)整每個(gè)載玻片上52個(gè)持家基因的平均Cy5和Cy3強(qiáng)度。從進(jìn)一步的研究中排除Cy3和Cy5的強(qiáng)度皆低于25,000個(gè)熒光單位的基因，選擇Cy3/Cy5信號比率".0的基因進(jìn)行進(jìn)一步評價(jià)。(3)細(xì)月包系人胚腎293(HEK293)得自TaKaRa。C0S7纟田胞、NIH3T3細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、人胃癌細(xì)胞系MKN-l和MKN-28、人肝癌細(xì)胞系A(chǔ)lexander以及人結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo,HCT116,DLD-1和SW480皆得自美國典型培養(yǎng)-物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。人肝癌細(xì)胞系SNU475和人結(jié)腸癌細(xì)胞系SNUC4和SNUC5得自韓國細(xì)胞系庫。在適當(dāng)培養(yǎng)基單層中培養(yǎng)所有細(xì)胞COS7，NIH3T3,HEK293和Alexander使用Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基；MKN-1，MKN-28,SNU475,SNUC4，DLD-1和SNUC5使用RPMI1640;HCT116使用McCoy's5A培養(yǎng)基；SW480使用Leibovitz，sL-15;LoVo使用HAM,sF-12;HeLa使用Eagle，s極限必需培養(yǎng)基(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)。所有培養(yǎng)基中都添加有10%胎牛血清和1%抗菌/抗真菌溶液(Sigma)。人胃癌細(xì)胞系St-4由日本癌癥研究所的Tsumo博士惠贈。在添加有10%胎牛血清和1%抗菌/抗真菌溶液(Sigma)的RPMI1640單層中培養(yǎng)St-4纟田月包。T2細(xì)胞(HLA-A承0201)和EHM(HLA-A3/3)，人B-類淋巴母細(xì)胞系由Shiku教授(Univ.Mie)惠贈。HT29(結(jié)腸癌細(xì)胞系；HLA-A24/01)，WiDR(結(jié)腸癌細(xì)胞系；HLA-A24/01)和HCT116(結(jié)腸癌細(xì)胞系；HLA-A02/01),DLD-1(結(jié)腸癌細(xì)胞系；HLA-A24/01),SNU475(肝細(xì)胞癌細(xì)胞系；HLA-A*0201)，MKN45(胃癌細(xì)胞系；HLA-A2陰性)，MKN7斗(胃癌細(xì)胞系；HLA-A2陰性)皆購自ATCC。TISI細(xì)胞(HLA-A24/24)由TakaraShuzo有限公司(Otsu，Japan)惠贈。RT-PCR檢測表明CX4i^L/在SNU475和MKN74中強(qiáng)表達(dá)。RT-PCR檢測表明GCMW在SNU475和MKN45中強(qiáng)表達(dá)。(4)RNA制備和RT-PCR根據(jù)廠商提供的方案，使用QiagenRneasy試劑盒(Qiagen)或Trizol試劑(LifeTechnologies)提取總RNA。使用聚dT12-18引物(AmershamPharmaciaBiotech)與SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies),將10微克總RNA等分試樣逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。稀釋每個(gè)單鏈cDNA制品，隨后在20(JPCR緩沖液(TaKaRa)中通過標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在下述條件下使用GeneAmpPCR9700系統(tǒng)(Perkin-Elmer,FosterCity,CA)進(jìn)行擴(kuò)增94。C變性4分鐘；接著94。C30秒，56。C30秒和72°C45秒共20(GAPDH)，35(CXADRL1)，30(GCUD1)，30(RNF43)輪循環(huán)。引物序列為GAPDH:正向，5,畫ACAACAGCCTCAAGATCATCAG(SEQIDNO:7)和反向，5，-GGTCCACCACTGACACGTTG(SEQIDNO:8);CXADRL1:正向，5，-AGCTGAGACATTTGTTCTCTTG(SEQIDNO:9)和反向5，-TATAAACCAGCTGAGTCCAGAG(SEQIDNO:10);GCUD1正向5，-TTCCCGATATCAACATCTACCAG(SEQIDNO:11),反向5，-AGTGTGTGACCTCAATAAGGCAT(SEQIDNO:12),RNF43正向5，-CAGGCTTTGGACGCACAGGACTGGTAC-3，(SEQIDNO:13)和反向5，-CTTTGTGATCATCCTGGCTTCGGTGCT-3，(SEQIDNO:14)。(5)Northern-印跡分析使人多組織印跡(Clontech，PaloAlto,CA)與CXADRLl,GCUDl或RNF43經(jīng)^P-標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交。根據(jù)廠商的推薦進(jìn)行預(yù)-雜交，雜交和洗滌。于-80。C用增感屏對印跡進(jìn)行放射自顯影24至72小時(shí)。(6)cDNA末端的5，快速擴(kuò)增f5，RACE)根據(jù)廠商說明，使用MarathoncDNA擴(kuò)增試劑盒(CIontech)進(jìn)行5，RACE實(shí)驗(yàn)。為了擴(kuò)增CXADRL1的5，部分，使用了基因-棒異性的反向引物(5，-GGTTGAGATTTAAGTTCTCAAA-3，(SEQIDNO:15))和試劑盒提供的AP-1引物。由人睪丸mRNA(Clontech)合成cDNA模板。使用TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆PCR產(chǎn)物，并用ABIPRISM3700DNA測序儀(AppliedBiosystems)測定其序列。(7)構(gòu)建表達(dá)CXADRL1，GCUD1和FU20315的質(zhì)粒使用下述基因特異性引物套，通過RT-PCR擴(kuò)增CXADRLl,GCUD1和RNF43的完整編碼區(qū)CXADRL1,5，-AGTTAAGCTTGCCGGGATGACTTCTCAGCGTTCCCCTCTGG-3,(SEQIDNO:16)和5,-ATCTCGAGTACCAAGGACCCGGCCCGACTCTG-3,(SEQIDNO:17);GCUD1,5,-GCGGATCCAGGATGGCTGCTGCAGCTCCTCCAAG-3,(SEQIDNO:18)和5,-TAGAATTCTTAAAGAACTTAATCTCCGTGTCAACAC-3，(SEQIDNO:19);forRNF43,5，-TGCAGATCTGCAGCTGGTAGCATGAGTGGTG-3，(SEQIDNO:20)和5，-GAGGAGCTGTGTGAACAGGCTGTGTGAGATGT-3，(SEQIDNO:21)。將PCR產(chǎn)物克隆至pcDNA3.1(Invitrogen)或pcDNA3.1myc/His(Invitrogen)載體的適當(dāng)克隆位點(diǎn)。(8)免疫印跡用PBS將用pcDNA3.1myc/His-CXADRLl,pcDNA3.1myc/His-GCUDl,pcDNA3.lmyc/His-RNF43或pcDNA3.lmyc/His-LacZ轉(zhuǎn)染的細(xì)胞洗滌2次，并收集于裂解緩沖液(150mMNaCl，1°/。TritonX-100,50mMTris-HClpH7.4,lmMDTT和lx完全蛋白酶抑制劑混合物(Boehringer))中。勻漿之后，以10,000xg離心細(xì)胞30分鐘，通過Bradford試驗(yàn)(Bio-Rad)使上清液中的蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)化。通過10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并用小鼠抗-myc抗體(SANTACRUZ)進(jìn)行免疫印跡。將與HRP-偶聯(lián)的山羊抗-小鼠IgG(Amersham)用作ECL檢測系統(tǒng)(Amersham)的第二抗體。(9)免疫組化染色用含有4。/o低聚甲醛的PBS將經(jīng)pcDNA3.1myc/His-CXADRLl，pcDNA3.1myc/His-GCUDl，pcDNA3.1myc/His-RNF43或pcDNA3.1myc/His-LacZ轉(zhuǎn)染的細(xì)胞固定15分鐘，然后，于室溫(RT)下用含有0.P/。TritonX-100的PBS將細(xì)胞透化2.5分鐘。隨后，于4。C用含2。/。BSA的PBS覆蓋細(xì)胞24小時(shí)以阻斷非特異性雜交。將l:1000稀釋的小鼠抗-myc單克隆抗體(Sigma)用作第一抗體，在同與羅丹明-偶聯(lián)的抗-小鼠第二抗體(Leinco和ICN)保溫之后觀察反應(yīng)。用4，,6，-二脒-2，-苯基p引哚二鹽酸化物(DAPI)復(fù)染細(xì)胞核。在ECLIPSEE800顯微鏡下獲得熒光圖像。(10)集落形成試驗(yàn)將被表達(dá)每種基因的質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與適當(dāng)濃度的遺傳霉素一起保溫10至21天。用100。/。甲醇固定細(xì)胞并通過Giemsa溶液染色。所有實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行三份。(11)建立過表達(dá)CXADRL1或RNF43的細(xì)胞在含有適當(dāng)濃度遺傳霉素的培養(yǎng)基中維持分別被pcDNA3.1myc/His-CXADRL1,pcDNA3.1myc/His-RNF43,pcDNA3.1myc/His-LacZ或?qū)φ召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染的NIH3T3，COS7和LoVo細(xì)胞。轉(zhuǎn)染2周后，選擇存活的單個(gè)集落，通過半定量RT-PCR檢查每種基因的表達(dá)?！?2)檢查反義寡核苷酸對細(xì)胞生長的作用使用LIPOFECTIN試劑(GIBCOBRL),用質(zhì)?；蛘逤XADRLl,GCUD1或RNF43的合成S-寡核苷酸轉(zhuǎn)染鋪于10-cm平皿上的細(xì)胞(2xl()5個(gè)細(xì)胞/皿)。然后在添加有適當(dāng)濃度遺傳霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6至12天。然后，用100%曱醇固定細(xì)胞并用Giemsa溶液染色。S-寡核苷酸的序列如下CXADRL1-S4，5,-TCTGCACGGTGAGTAG-3，(SEQIDNO:22);CXADRL1-AS4,5,-CTACTCACCGTGCAGA-3，(SEQIDNO:23);CXADRL1畫S5，5,-TTCTGTAGGTGTTGCA-3，SEQIDNO:24);CXADRL1-AS5,5,-TGCAACACCTACAGAA-3，(SEQIDNO:25);GCUD1-S5，5'-CTTTTCAGGATGGCTG畫3，(SEQIDNO:26);GCUD1-AS5,5，-CAGCCATCCTGAAAAG-3,(SEQIDNO:27);GCUD1-S8,5,-AGGTTGAGGTAAGCCG-3，(SEQIDNO:28);GCUD1-AS8，5，-CGGCTTACCTCAACCT-3，(SEQIDNO:29);RNF43陽S1，5,-TGGTAGCATGAGTGGT-3，(SEQIDNO;30);和RNF43國AS1，5,-ACCACTCATGCTACCA隱3，(SEQIDNO:31)。(13)3-(4,5-二曱基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)試驗(yàn)用指定用于抑制CXADRLl,GCUDl或RNF43的有義或反義S-寡核苷酸轉(zhuǎn)染三份以5xl()5個(gè)細(xì)胞/皿的密度鋪于100mm平皿的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72小時(shí)之后，用含有500^g/mlMTT(3-(4，5-二曱基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四換培養(yǎng)基，將平板置于37。C保溫4小時(shí)。然后，加入lml0.01NHCl/10%SDS以裂解細(xì)胞。用ELISA平板讀數(shù)器，在570nm的檢測波長下(參比波長為630nm)測定裂解液的吸光度。用與對照相比而言的吸光度描述細(xì)胞生存力。(14)構(gòu)建psiHlBX3.0由于據(jù)報(bào)道H1RNA基因由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄，所述酶可在3，末端產(chǎn)生具有尿苷的短轉(zhuǎn)錄物，因此，使用一套引物5，-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3，[SEQIDNO:32]和5，-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3，[SEQIDNO:33],以人胎盤DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增含有其啟動子區(qū)域的H1RNA基因的基因組片段。純化產(chǎn)物，根據(jù)廠商提供的方案使用TA克隆試劑盒(Invitrogen)將產(chǎn)物克隆至pCR2.0質(zhì)粒載體。純化含有H1RNA基因的5awffl-J^oI片段，將其克隆至pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的第1257至56位核苷酸，使用一套引物5，-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3，(SEQIDNO:34)和5,-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3,(SEQIDNO:35),通過PCR擴(kuò)增質(zhì)粒，然后用5amHI和^2oI消化。將連接的DNA用作PCR模板，PCR引物是5，-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAC-3，(SEQIDNO:36)和5，-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3，(SEQIDNO:37)。用歷Win消化產(chǎn)物，隨后自身連接以產(chǎn)生psiHlBX3.0載體質(zhì)粒。通過將雙鏈寡核苷酸5，-CTTC-3,(SEQIDNO:38)和5,-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3，(SEQIDNO:39)克隆至psiHlBX載體的加jI位點(diǎn)，制備出psiHlBX-EGFP以用作對照。(15)檢查RNF43-或CXADRL1-siRNA的基因沉默作用通過將雙鏈寡核苷酸克隆至psiHlBX3.0載體，制備出表達(dá)RNF43-siRNA或CXADRLl-siRNA的質(zhì)粒。用作RNF43siRNA的寡核苷酸是siRNA16-4,5,-TCCCGTCACCGGATCCAACTCAGTTCAAGAGACTGAGTTGGATCCGGTGAC陽3，(SEQIDNO:40)和5，-AAAAGTCACCGGATCCAACTCAGTCTCTTGAACTGAGTTGGATCCGGTGAC-3，(SEQIDNO:41);siRNAl834，5，-TCCCGCTATTGCACAGAACGCAGTTCAAGAGACTGCGTTCTGTGCAATAGC-3，(SEQIDNO:42)和5,畫AAAAGCTATTGCACAGAACGCAGTCTCTTGAACTGCGTTCTOTGCAATAGC-3，CSEQIDNO:43);siRNAl,5,-TCCCCAGAAAGCTGTTATCAGAGTTCAAGAGACTCTGATAACAGCTTTCTG-3,(SEQIDNO:44)和5,-AAAACAGAAAGCTGTTATCAGAGTCTCTTGAACTCTGATAACAGCTTTCTG-3，(SEQIDNO:45);siRNA14,5，-TCCCTGAGCCACCTCCAATCCACTTCAAGAGAGTGGATTGGAGGTGGCTCA-3，(SEQIDNO:46)和5,-AAAATGAGCCACCTCCAATCCACTCTCTTGAAGTGGATTGGAGGTGGCTCA國3，(SEQIDNO:47);siRNAl5,5，-TCCCCTGCACGGACATCAGCCTATTCAAGAGATAGGCTGATGTCCGTGCAG-3,(SEQIDNO:48)和5，-AAAACTGCACGGACATCAGCCTATCTCTTGAATAGGCTGATGTCCGTGCAG-3，(SEQIDNO:49)。用作CXADRL1-siRNA的寡核苷酸是siRNA#1,5，-TCCCGTGTCAGAGAGCCCTGGGATTCAAGAGATCCCAGGGCTCTCTGACAC曙3，(SEQIDNO:50)和5，-AAAAGTGTCAGAGAGCCCTGGGATCTCTTGAATCCCAGGGCTCTCTGACAC-3,(SEQIDNO:51);siRNA#2,5，-TCCCCCTCAATGTCATTTGGATGTTCAAGAGACATCCAAATGCAATTGAGG-3,(SEQIDNO:52)和5TGAGG-3,(SEQIDNO:53);siRNA#3，5,-TCCCTGTCATTTGGATGGTCACTTTCAAGAGAAGTGACCATCCAAATGACA-3，(SEQIDNO:54)和5，-AAAATGTCATTTGGATGGTCACTTCTCTTGAAAGTGACCATCCAAATGACA-3，(SEQIDNO:55);siRNA#4,5，畫TCCCTGCCAACCAACCTGAACAGTTCAAGAGACTGTTCAGGTTGGTTGGCA-3,(SEQIDNO:56)和5,-AAAATGCCAACCAACCTGAACAGTCTCTTGAACTGTTCAGGTTGGTTGGCA-3,(SEQIDNO:57);siRNA#5,5'-TCCCCCAACCTGAACAGGTCATCTTCAAGAGAGATGACCTGTTCAGGTTGG國3，(SEQIDNO:58)和5，-AAAACCAACCTGAACAGGTCATCTCTCTTGAAGATGACCTGTTCAGGTTGG-3,(SEQIDNO:59);siRNA#6,5，-TCCCCCTGAACAGGTCATCCTGTTTCAAGAGAACAGGATGACCTGTTCAGG-3，(SEQIDNO:60)和5，-AAAACCTGAACAGGTCATCCTGTTCTCTTGAAACAGGATGACCTGTTCAGG-3，(SEQIDNO:61);以及CXADRL-siRNA弁7,5，-TCCCCAGGTCATCCTGTATCAGGTTCAAGAGACCTGATACAGGATGACCTG畫3,(SEQIDNO:62)和5，-AAAACAGGTCATCCTGTATCAGGTCTCTTGAACCTGATACAGGATGACCTG-3，(SEQIDNO:63)。根據(jù)廠商推薦的方法，使用FuGENE6試劑(Roche)將psiHlBX-RNF43,psiHlBX-CXADRLl或psiHlBX畫mock質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SNUC4或St-4細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后，從細(xì)胞中提取總RNA。(16)構(gòu)建RNF43蛋白重組的氨基-和羧基-末端區(qū)域使用下述引物套，通過RT-PCR擴(kuò)增iiVF^3的氨基-和羧基-末端區(qū)域5'-GAAGATCTGCAGCGGTGGAGTCTGAAAG誦3，(SEQIDNO:64)和5，-GGAATTCGGACTGGGAAAATGAATCTCCCTC-3，(SEQIDNO:65)(氨基-末端區(qū)域)；以及5，-GGAGATCTCCTGATCAGCAAGTCACC-3，(SEQIDNO:66)和5，-GGAATTCCACAGCCTGTTCACACAGCTCCTC隱3，(SEQIDNO:67)(羧基-末端區(qū)域)。用BawHHcoRI消化產(chǎn)物，克隆至pET-43.1a(+)載體(Novagen)的Bawffl-5coRI位點(diǎn)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21&xS(DE3)pLysS細(xì)胞。加入0.2mMIPTG之后，從在25^C培養(yǎng)16小時(shí)的細(xì)胞中提取重組RNF43蛋白。(!7)酵母雙-雜合實(shí)驗(yàn)根據(jù)廠商提供的方案，使用MATCHMAKERGAL4雙雜合系統(tǒng)3(Clontech)進(jìn)行酵母雙-雜合試驗(yàn)。將/2iVF^5完整的編碼序列克隆至pAS2-l載體的五coRI-Saw別位點(diǎn)以作為辨，用以篩選人-睪丸cDNA文庫(Clontech)。為了進(jìn)一步證實(shí)酵母中的相互作用，將pAS2-RNF43用作誘辨載體，將pACT2-NOTCH2和pACT2-STRIN用作捕獲載體。我們將CXADRL1的胞質(zhì)區(qū)克隆至pAS2-1載體的EcoRI位點(diǎn)以作為斜，用以篩選人睪丸cDNA文庫(Clontech)。為了進(jìn)一步證實(shí)酵母中的相互作用，我們將pAS2-CXADRLl用作誘餌載體，將pACT2-AIPl用作捕獲載體。(18)制備CXADRL特異性抗體通過用包含密碼子235-276(Ab-l),493-537(Ab-2)或70-lll(Ab-3)的CXADRL合成肽進(jìn)行免疫，制備出抗-CXADRL抗血清。使用在被pET-CXADRL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的大腸桿菌中制備的經(jīng)His-標(biāo)記的重組CXADRLl蛋白純化血清。通過10%SDS-PAGE進(jìn)一步分離從表達(dá)經(jīng)Flag標(biāo)記的CXADRLl的細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)，并用抗-CXADRL1血清或抗-Flag抗體進(jìn)行免疫印跡。分別將與HRP-偶聯(lián)的山羊抗-兔IgG或與HRP-偶聯(lián)的綿羊抗-小鼠IgG抗58體用作ECL檢測系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)的第二抗體。抗-CXADRLl抗血清的免疫印跡顯示出50kD經(jīng)FLAG-標(biāo)記的CXADRL1帶，其模式與用抗-FLAG抗體檢測到的相同。(19)制備重組GCUD1蛋白為了產(chǎn)生特異于GCUD1的抗體，需制備重組GCUD1蛋白。使用下述引物套，通過RT-PCR擴(kuò)增GCOD/的完整編碼區(qū)5，-GCGGATCCAGGATGGCTGCAGCTCCTCCAAG-3,(SEQIDNO:68)和5,-CTGAATTCACTTAAAGAACTTAATCTCCGTGTCAACAC-3，(SEQIDNO:69)。純化產(chǎn)物，用5amHl和五coRl消化，克隆至pGEX6P-2的適當(dāng)克隆位點(diǎn)。將所得質(zhì)粒稱為pGEX-GCUDl。將pGEX-GCUDl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B。通過加入IPTG誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，根據(jù)廠商提供的方法，用GlutathioneSepharoseTM4B(AmershamPharmacia)純4匕蛋白質(zhì)。(20)制備GCUD1特異性抗體抗GCUD1的多克隆抗體純化自血清。通過10%SDS-PAGE進(jìn)一步分離用表達(dá)經(jīng)Flag標(biāo)記的GCUD1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，并用抗-GCUD1或抗-Flag抗體進(jìn)行免疫印跡。分別將與HRP-偶聯(lián)的山羊抗-兔IgG(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)或與HRP-偶聯(lián)的抗-Flag抗體用作ECL檢測系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,NJ)的第二抗體。與用抗-FLAG抗體檢測到的相同。(21)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析(ANOVA)和Schef伎，sF試驗(yàn)。(22)制備肽借且力于纟吉合預(yù)領(lǐng)']專欠4牛(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker—comboform)預(yù)測能與HLA-A24或HLA-A*0201分子結(jié)合的RNF43,CXADRL1或GCUD19聚體和10聚體肽。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的固相合成法，通過Mimotopes,SanDiego,LA合成這些肽，并通過反相HPLC進(jìn)行純化。分別通過分析型HPLC和質(zhì)譜分析測定肽的純度(>90%)和同一性。以20mg/ml的濃度將肽溶解于二曱基亞砜(DMSO),并儲存于-80。C。(23)體外CTLi秀導(dǎo)對HLA上呈遞的肽的CTL應(yīng)答。按文獻(xiàn)所述在體外產(chǎn)生DC(N—ukayaetal.，IntJCancer80:92-7(1999);Tsaietal"JImmunol158:1796-802(1997))。具體地說，使用Ficoll-Plaque(Pharmacia)溶液從具有HLA-A*0201或HLA-A24的健康志愿者體內(nèi)分離外周血單核細(xì)胞(PBMC),通過粘附于塑料組織培養(yǎng)瓶(BectonDickinson)分離出PBMC的單核細(xì)胞組分。在含有2%熱-滅活的自身血清(AS)、1000U/mlGM-CSF(由KirinBrewery公司提供)和lOOOU/mlIL-4(Genzyme)的AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen)中將所述單核細(xì)胞組分培養(yǎng)7天以獲得DC組分。于20。C，在AIM-V中，在3嗎/ml卩2-微球蛋白的存在下將20嗎/ml候選肽脈沖至富含DC的細(xì)胞群體上達(dá)4小時(shí)。然后，照射(5500拉德)這些經(jīng)肽脈沖的抗原呈遞細(xì)胞，并以l:20的比例與自身CD8+T細(xì)胞混合，所述T細(xì)胞是通過用DynabeadsM-450CD8(Dynal)和Detachabead(Dynal)進(jìn)行陽性選擇而獲得的。在48-孔培養(yǎng)板(Corning)中建立這些培養(yǎng)物，在每孔0.5ml含有2%AS的AIM-V中含有1.5乂104個(gè)經(jīng)肽脈沖的抗原呈遞細(xì)胞，3xl()S個(gè)CD8+T細(xì)胞和10ng/mlIL-7(Genzyme)。3天后，在這些培養(yǎng)物中添加IL-2(CfflRON)至終濃度為20IU/ml。在第7和14天，使用每次皆按照與上述相同的方法制備的經(jīng)自身肽-脈沖的抗原呈遞細(xì)胞重新刺激T細(xì)胞。第21天，收集培養(yǎng)物中的淋巴細(xì)胞并檢測其針對經(jīng)肽-脈沖的TISI或T2細(xì)胞的細(xì)胞毒性。(24)CTL擴(kuò)展(ex。ansion)使用與Riddell等所述的方法(Walteretal.,NEnglJMed333:1038-1044，1995;Riddeletal"NatureMed.2:216-223,1996)類似的方法，在培養(yǎng)物中進(jìn)一步擴(kuò)展經(jīng)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞，已證實(shí)所述細(xì)胞對經(jīng)肽-脈沖的TISI或T2細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性。將5xl(^個(gè)淋巴細(xì)胞重新懸浮于25ml添加有5%AS的AIM-V中，其中還含有25xl()6個(gè)經(jīng)照射(3300拉德)的PBMC,5xl06個(gè)經(jīng)照射(8000拉德)的EHM細(xì)胞和40ng/ml抗-CD3單克隆抗體(Pharmingen)。培養(yǎng)1天后，在培養(yǎng)物中加入120IU/mlIL-2。在第5，8和11天，培養(yǎng)物包含新鮮的AIM-V,其中添加有5。/。AS和30IU/mlIL-2。f25)建立CTL克隆使用一些具有強(qiáng)細(xì)胞毒性的淋巴細(xì)胞獲得CTL克隆。在96孔圓底微滴板(NalgeNuncInternational)中，將細(xì)胞懸浮液稀釋成密度為0.3,1和3CTL/淋巴細(xì)胞/孔。在150pl/孔添加有5%AS的AIM-V中培養(yǎng)這些細(xì)胞，所迷培養(yǎng)基中含有7xl(^個(gè)細(xì)胞/孔的同種異體PBMC,lx—104個(gè)細(xì)胞/孔的EHM,30ng/ml抗-CD3抗體和125U/mlIL-2。IO天后，在培養(yǎng)基中加入50^1/孔IL-2至終濃度為125U/ml。第14天，檢測經(jīng)培養(yǎng)CTL的細(xì)胞毒活性，使用與上述相同的方法擴(kuò)展CTL克隆。(26)細(xì)胞毒性試驗(yàn)于37。C,在C02溫箱中用100pCiNa251CrO4(PerkinElmerLifeSciences)將靶細(xì)胞標(biāo)記1小時(shí)。當(dāng)使用經(jīng)肽脈沖的靶時(shí)，在用Na^Cr04標(biāo)記前，于37。C加入20iig/mi肽與靶細(xì)胞一起保溫16小時(shí)。沖洗耙細(xì)胞，在圓底微滴板中與效應(yīng)細(xì)胞混合至終體積為0.2ml。離心微滴板(4分鐘，800xg)以增加細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，并置于37°C的C02溫箱中。保溫4小時(shí)之后，從每個(gè)孔中收集O.lml上清液，用y計(jì)數(shù)器測定其放射性。當(dāng)評價(jià)針對內(nèi)源性表達(dá)或CX4DiI7或GCt/D7的耙細(xì)胞的細(xì)胞毒性時(shí)，在過量30倍的未標(biāo)記K562細(xì)胞的存在下檢測細(xì)胞裂解活性，K562的存在是為了降低任何由NK-樣效應(yīng)細(xì)胞引起的非-特異性裂解。通過未標(biāo)記靶的抑制試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)抗原特異性，所迷試驗(yàn)利用被肽脈沖(20jag/ml，16小時(shí)，37。C)的未標(biāo)記TISI或T2細(xì)胞以竟?fàn)幗?jīng)"Cr-標(biāo)記的HT29或SNU475細(xì)胞的識別。通過阻斷試驗(yàn)檢查MHC限制，測定抗HLA-I類(W6/32)抗體和抗HLA-II類抗體，抗CD4抗體和抗CD8抗體(DAKO)對細(xì)胞毒性的抑制作用。通過用下述公式計(jì)算特異性51Cr-釋放的百分比以測定特異性細(xì)胞毒性的百分比{(受試樣品釋放的cpm-自發(fā)釋放的cpm)/(最大釋放的cpm-自發(fā)釋放的cpm)}x100。通過在缺乏效應(yīng)細(xì)胞時(shí)僅保溫靶細(xì)胞來測定自發(fā)釋放，通過使靶與INHC1保溫獲得最大釋放。所有決定因子都測兩份，平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差始終低于平均值的10%。2.結(jié)果n)鑒定兩個(gè)常在胃癌中被上調(diào)的新的人基因CXADRL1和GCUD1利用含有23040個(gè)基因的全基因組cDNA微陣列，將20例胃癌的表達(dá)分布圖與相應(yīng)的非癌粘膜相比較。由微陣列分析檢測到的常被上調(diào)的基因中，對應(yīng)于UniGene簇的EST,Hs.6658(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGeneA)、機(jī)構(gòu)內(nèi)部登錄號為A5928的基因在4.09至48.60的范圍內(nèi)過表達(dá)(圖la)。由于該基因的開放閱讀框編碼的蛋白質(zhì)與CXADR(柯薩奇病毒和腺病毒受體)的同一性約為37%。因此，將該基因命名為CXADRL1(柯薩奇病毒和腺病毒受體樣1)。CX4ARZJ也在6例結(jié)腸癌的6例中和20例HCC的12例中被上調(diào)。另外，通過微陣列我們還注意到對應(yīng)于UniGene簇的KIAA0913基因產(chǎn)物(Hs.75137)、機(jī)構(gòu)內(nèi)部登錄號為C8121的基因，與相應(yīng)的非-癌胃粘膜相比，所述基因在12個(gè)胃癌組織的9個(gè)中有顯著增強(qiáng)的表達(dá)(圖lb)。將機(jī)構(gòu)內(nèi)部登錄號為C8121的基因稱為GCUD1(在胃癌中被上調(diào))。GCf/D/也在6例結(jié)腸癌中的5例，6例HCC中的1例，14例肺癌(鱗狀細(xì)胞細(xì)胞癌)中的1例，13例睪丸精原細(xì)胞瘤中的1例中被上調(diào)。為了闡明cDNA微陣列的結(jié)果，通過半定量RT-PCR檢查這些轉(zhuǎn)錄物在胃癌中的表達(dá)，以證實(shí)CXADRL1在所有10個(gè)腫瘤中的表達(dá)增加(圖lc)，GCUD1在9例癌癥中的7例中表達(dá)提高(圖ld)。(2)新基因CX4i^L7的分離和結(jié)構(gòu)使用CXADRL1PCR產(chǎn)物作為探針的多-組織Northern-印跡分析揭示出3.5-kb轉(zhuǎn)錄物在睪丸和卵巢中的表達(dá)(圖2a)。由于A5928小于在Northern印跡上檢測到的基因，進(jìn)行5，RACE實(shí)驗(yàn)以測定CX4Z)虹7基因的完整編碼序列。推定的全長cDNA由3423個(gè)核苷酸組成，其中1296個(gè)核苷酸長的開放閱讀框(SEQIDNO:l)編碼431個(gè)氨基酸長的蛋白質(zhì)(SEQIDNO:2)(GenBank登錄號AB071618)。第一個(gè)ATG的側(cè)翼序列為(CCCGGGATGA)(SEQIDNO:70),這與真核生物中起始翻譯所用的共有序列一致，其上游具有框內(nèi)終止密碼子。使用BLAST程序在NCBI(國立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索，鑒定出GenBank登錄號為AC068984的基因組序列，該序列被定位于染色體帶3ql3。將該cDNA與基因組序列相比較，揭示出CXADRLl由7個(gè)外顯子組成(圖2b)。用SimpleModularArchitectureResearchTool(SMART，http:〃smart.embl-heiddberg.de)檢索蛋白質(zhì)基元，結(jié)果表明推測的蛋白質(zhì)含有2個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(密碼子29-124和158-232)和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(密碼子246-268),暗示CXADRLl可能屬于免疫球蛋白超家族。(3)CXADRL1對細(xì)胞生長的作用通過用表達(dá)CXADRLl的質(zhì)粒(pcDNA3.1myc/His-CXADRLl)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞以進(jìn)行集落-形成試驗(yàn)。與被模擬載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，被pcDNA3.1myc/His-CXADRLl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生顯著更多的集落(圖3a)。為62了進(jìn)一步研究CXADRL1的生長-促進(jìn)作用，建立了穩(wěn)定表達(dá)外源性CXADRL1的NIH3T3細(xì)胞(圖3b)。在含有10%FBS的培養(yǎng)基中，NIH3T3-CXADRL1細(xì)胞的生長速度顯著高于親代NIH3T3細(xì)胞(圖3c)。(4)通過反義S-寡核苷酸抑制CXADRL1在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)將6對對應(yīng)于CX4D^ZJ的對照和反義S-寡核苦酸轉(zhuǎn)染至MKN-1胃癌細(xì)胞，在被4全查的6個(gè)胃癌細(xì)胞系中，MKN-1顯示出最高水平的CXADRL1表達(dá)。轉(zhuǎn)染6天后，通過MTT試驗(yàn)測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生存力。被反義S-寡核苦酸(CXADRL1-AS4或-AS5)轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞顯著少于被對照S-寡核苷酸(CXADRL1-S4或-S5)轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞(圖4)。在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中獲得了一致的結(jié)果。(5)表達(dá)CXADRL1siRNA的質(zhì)粒的構(gòu)建及其對胃癌細(xì)胞生長的作用構(gòu)建表達(dá)多種CXADRLl-siRNA的質(zhì)粒，并檢查其對C%4￡>^L7表達(dá)的作用。在構(gòu)建的siRNA中，psiHlBX-CXADRL7能顯著抑制CX4i^L7在St-4細(xì)胞中的表達(dá)(圖5A)。為了檢測抑制CX4D/U是否能導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制，用psiHlBX-CXADRL7或模擬載體轉(zhuǎn)染St-4細(xì)胞。用psiHlBX-CXADRL7轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞數(shù)目少于存活的對照細(xì)胞數(shù)目(圖5B和5C)。(6)制備抗-CXADRLl抗體為了檢查CXADRL1的表達(dá)并研究其功能，制備了抗CXAD虹1的抗血清。用抗-CXADRLl進(jìn)行的免疫印跡檢測到50kD經(jīng)FLAG-標(biāo)記的CXADRL1帶，這與用抗-FLAG抗體檢測到的大小幾乎相同(圖6)。.(7)通過酵母雙-雜合篩選系統(tǒng)鑒定CXADRLl-相互作用蛋白為了闡明CXADRL1的功能，我們使用酵母雙-雜合篩選系統(tǒng)搜索CXADRLl-相互作用蛋白。在鑒定出的陽性克隆中，通過同時(shí)用pAS2.1-CXADRL1和pACT2-AIPl轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞而使核AIP1(atrophin相互作用蛋白l)的C-末端區(qū)域與CXADRL1相互作用(圖7)。陽性克隆含有密碼子808至1008，AIP1中負(fù)責(zé)相互作用的區(qū)域就位于該區(qū)域內(nèi)。(8)推測衍生自CXADRL1的候選肽表1以高結(jié)合親和性的次序顯示出候選肽(SEQIDNO:115-154)。總共選捧和4企查了下述40個(gè)肽。表1推測衍生自CXADRL1的候選肽<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>(9)使用候選肽刺激T細(xì)胞并建立CTL克隆按照"材料和方法"中所述的方法，使用這些衍生自CXADRLl的候選肽培養(yǎng)淋巴細(xì)胞。擴(kuò)展所獲得的顯示出可測細(xì)胞毒活性的淋巴細(xì)胞，并建立CTL克隆。使用有限稀釋法由上述CTL系增殖CTL克隆。與未經(jīng)任何肽脈沖的乾相比，用CXADRLl-207(ALSSGLYQC)(SEQIDNO:124)誘導(dǎo)的CTL克隆對經(jīng)肽脈沖的靶顯示出較高的細(xì)胞毒活性。圖8顯示了該CTL克隆的細(xì)胞毒活性。該CTL克隆對經(jīng)肽脈沖的靶顯示出很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，而對未經(jīng)任何肽脈沖的靶未顯示出任何細(xì)胞毒活性。(10)針對內(nèi)源性表達(dá)CXADRLl以作為靶的腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性檢查針對推測肽產(chǎn)生的CTL克隆識別并殺死內(nèi)源性表達(dá)CXADRLl的腫瘤細(xì)胞的能力。圖9顯示出針對CXADRLl-207(ALSSGLYQC)(SEQIDNO:124)產(chǎn)生的CTL克隆75的結(jié)果。CTL克隆75對表達(dá)CXADRLl和HLA-A*0201的SNU475顯示出強(qiáng)有力的細(xì)胞毒活性，然而對表達(dá)CXADRLl但不表達(dá)HLA-A*0201的MKN74,以及表達(dá)HLA-A*0201但不表達(dá)CXADRLl的SNU-C4卻未顯示出細(xì)胞毒活性。(in已建立的CTL的特異性進(jìn)行未標(biāo)記靶的抑制試驗(yàn)以進(jìn)—一步證實(shí)CXADRL1-207CTL克隆的特異性。將經(jīng)"Cr標(biāo)記的SNU475細(xì)胞用作經(jīng)標(biāo)記耙，而將用CXADRL1-207(SEQIDNO:124)脈沖的未經(jīng)"Cr標(biāo)記的T2細(xì)胞用作未標(biāo)記耙。當(dāng)在試驗(yàn)中以多個(gè)比例加入用CXADRL1-207(SEQIDNO:124)脈沖的.T2時(shí)，針對SNU475細(xì)胞的特異性細(xì)胞裂解^C顯著抑制(圖10)。以E/T-20的比例將這些結(jié)果表示為特異性裂解的百分比。關(guān)于CXADRL1-207CTL克隆，為了檢查這些CTL克隆的特征，檢測了抗HLA-I類，HLA-II類，CD4和CD8的抗體抑制細(xì)胞毒活性的能力。當(dāng)使用抗-HLA-I類抗體和抗-CD8抗體時(shí)，CTL克隆對SNU475細(xì)胞的細(xì)胞毒性受到顯著抑制(圖11),這表明CTL克隆以HLA-I類和CD8方式識別衍生自CXADRL1的肽。(12)表達(dá)和鑒定新的人基因GCL^>7使用GCUD1cDNA作為探針進(jìn)行多-組織Northern印跡分析，結(jié)果顯示出5.0-kb轉(zhuǎn)錄物在睪丸、卵巢和腦中特異性表達(dá)(圖12)。盡管與GCUD1相對應(yīng)的KIAA0913的核苷酸序列(GenBank登錄號XM-014766)由4987個(gè)核苦酸組成，使用睪丸、卵巢和癌癥組織的RT-PCR實(shí)驗(yàn)揭示出由由4987個(gè)核苷酸組成的轉(zhuǎn)錄物含有1245個(gè)核苦酸長的開放閱讀框(SEQIDNO:3)(GenBank登錄號AB071705)。另外，在基因組數(shù)據(jù)庫中檢索對應(yīng)于Gt/CZ)7的基因組序列以尋找出定位于染色體帶7pl4的草圖序列(GenBank登錄號NT-007819)。將cDNA序列與基因組序列相比較，揭示出Gf/CD/基因由8個(gè)外顯子組成。n3)GCUDl的亞細(xì)胞定位將對應(yīng)于GCt/D7的完整編碼區(qū)克隆至pCDNA3.1myc/His載體，將構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至C0S7細(xì)胞。COS7細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色揭示出經(jīng)標(biāo)記的GCUD1蛋白存在于胞質(zhì)中(圖13)。(14)GCUD1對細(xì)胞生長的作用為了分析GCUD1對細(xì)胞生長的作用，通過用表達(dá)GCUD1的質(zhì)粒(pcDNA3.1myc/His-GCUDl)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞來進(jìn)行集落-形成試驗(yàn)。與對照質(zhì)粒(pcDNA3.1myc/His-LacZ)相比，pcDNA3.1myc/His誦GCUDl能在NIH3T3細(xì)胞中誘導(dǎo)明顯更多的集落(圖14)。通過三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果。(15)通過指定用于減少GCUD1表達(dá)的反義S-塞核苷酸抑制胃癌細(xì)胞的生長為了檢測抑制GCUD1是否能導(dǎo)致胃癌細(xì)胞死亡，合成了多個(gè)被設(shè)計(jì)用于抑制GCUD1表達(dá)的反義S-寡核苷酸。用各個(gè)反義S-寡核苦酸轉(zhuǎn)染6天后，通過MTT試驗(yàn)測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生存力。在MKN-28細(xì)胞中，被反義S-寡核苦酸(GCUD1-AS5或-AS8)轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞顯著少于被對照S-寡核苷酸(GCUD1-S5或-S8)轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞(圖15)。通過三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)果。用MKN-1細(xì)胞觀察到類似的結(jié)果。(16)制備抗-GCUDl抗體為了檢查GCUD1的表達(dá)并研究其功能，制備了抗GCUD1的抗血清。重組GCUD1蛋白提取和純化自表達(dá)GST-GCUD1融合蛋白的細(xì)菌細(xì)胞(圖16)。用重組蛋白質(zhì)免疫三只兔。用抗-GCUD1血清而不是預(yù)免疫血清進(jìn)行的免疫印跡顯示出47kD經(jīng)FLAG-標(biāo)記的GCUD1帶，這與用抗-FLAG抗體檢測到的大小幾乎相同(圖17)?！?7)推測衍生自GCUD1的候選肽表2(GCUD1)以高結(jié)合親和性的次序顯示出候選肽(SEQIDNO:155-194)。總共選擇和;險(xiǎn)查了下述40個(gè)肽。表.2推測衍生自GCUD1的候選肽HLA-A*02019聚體HLA-A*020110聚體<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>(18M吏用候選肽刺激T細(xì)胞并建立CTL克隆按照"材料和方法"中所述的方法，使用這些衍生自GCUD1的候選肽培養(yǎng)淋巴細(xì)胞。擴(kuò)展所獲得的顯示出可測細(xì)胞毒活性的淋巴細(xì)胞，并建立CTL克隆。使用有限稀釋法由上述CTL系增殖CTL克隆。與未經(jīng)任何肽脈沖的耙相比，用GCUD1-196(KMDAEHPEL)(SEQIDNO:164)和GCUD1-272(FLTTASGVSV)(SEQIDNO:177)誘導(dǎo)的CTL克隆對經(jīng)肽脈沖的耙顯示出較高的細(xì)胞毒活性。圖18顯示了這些CTL克隆的細(xì)胞毒活性。每個(gè)CTL克隆對經(jīng)肽脈沖的靶顯示出很強(qiáng)的細(xì)胞毒浩性，而對未經(jīng)任何肽脈沖的革巴未顯示出任何細(xì)胞毒活性。(19)針對內(nèi)源性表達(dá)GCUD1以作為靶的腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性檢查針對推測肽產(chǎn)生的CTL克隆識別并殺死內(nèi)源性表達(dá)GCUD1的肺瘤細(xì)胞的能力。圖19顯示出針對GCUD1-196(SEQIDNO:164)產(chǎn)生的CTL克隆23的結(jié)果。CTL克隆23對表達(dá)GCUD1和HLA-A*0201的SNU475顯示出強(qiáng)有力的細(xì)胞毒活性，然而對表達(dá)GCUD1但不表達(dá)HLA-A*0201的MKN45卻未顯示出細(xì)胞毒活性。(20)已建立的CTL的特異性進(jìn)行未標(biāo)記靶的抑制試驗(yàn)以進(jìn)一步證實(shí)GCUD1-196CTL克隆的特異性。將經(jīng)"Cr標(biāo)記的SNU47—5細(xì)胞用作經(jīng)標(biāo)記靶，—而將用GCUDl-196脈沖的未經(jīng)"Cr標(biāo)記的T2細(xì)胞用作未標(biāo)記靶。當(dāng)在試驗(yàn)中以多個(gè)比例加入用GCUDl-196(SEQIDNO:164)脈沖的T2時(shí)，針對SNU475細(xì)胞的特異性細(xì)胞裂解^皮顯著抑制(圖20)。以E/T=20的比例將這些結(jié)果表示為特異性裂解的百分比。關(guān)于GCUDl-196(SEQIDNO:164)CTL克隆，為了檢查這些CTL克隆的特征，；險(xiǎn)測了抗HLA-I類，HLA-II類，CD4和CD8的抗體抑制細(xì)胞毒活性的能力。當(dāng)使用抗-HLA-I類抗體和抗-CD8抗體時(shí)，CTL克隆對SNU475細(xì)胞的細(xì)胞毒性受到顯著抑制(圖21),這表明CTL克隆以HLA-I類和CD8方式識別衍生自GCUD1的肽。(21)鑒定在人結(jié)腸癌中常凈皮上調(diào)的基因使用含有23040個(gè)基因的cDNA微陣列將11個(gè)結(jié)腸癌組織的表達(dá)分布圖與相應(yīng)的結(jié)腸非癌粘膜組織相比較。根據(jù)此分析，多個(gè)基因在癌癥組織中的表達(dá)水平經(jīng)常比相應(yīng)的非癌組織中的高。其中，與相應(yīng)的非癌粘膜相比，對應(yīng)于UniGene蔟的EST(FU20315),Hs.l8457(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)、機(jī)構(gòu)內(nèi)部登錄號為B4469的基因在癌癥組織中以1.44至11.22的放大范圍被上調(diào)(圖22a)。也在18例胃癌中的6例，20例HCC中的12例，22例肺癌(腺癌)中的11例，2例睪丸精原細(xì)胞瘤中的2例和9例前列腺癌中的3例中被上調(diào)。為了闡明微陣列的結(jié)果，通過半定量RT-PCR檢查這些轉(zhuǎn)錄物在其它結(jié)腸癌樣品中的表達(dá)，以進(jìn)一步證實(shí)18例腫瘤中的15例中FLJ20315表達(dá)的增加(圖22b)。f22)RNF43的表達(dá)和結(jié)構(gòu)使用國立生物技術(shù)信息中心的BLAST程序(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),在公共數(shù)據(jù)庫中對F厶/2W/5序列進(jìn)行額外的同源性檢索，鑒定出包括XM—097063，BF817142的EST,以及被定位于染色體帶17pter-pl3.1的基因組序列(GenBank登錄號為NT-010651)。結(jié)果，獲得5345個(gè)核苷酸長的裝配序列，其中含有2352個(gè)核苷酸長的開放閱讀框(SEQIDNO:5)，其編碼783個(gè)氨基酸長的蛋白質(zhì)(SEQIDNO:6)(GenBank登錄號AB081837)。將該基因稱為RNF43(環(huán)指蛋白43)。第一個(gè)ATG的側(cè)翼序列為(AGCATGC),這與真核生物中起始翻譯所用的共有序列一致，其上游具有框內(nèi)終止密碼子。將該cDNA與基因組序列相比較，揭示出該基因由11個(gè)外顯子組成。使用以RNF43的PCR產(chǎn)物為探針的成人多-組織Northem-印跡進(jìn)行的Northern-印跡分析未檢測到任何帶(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，使用以相同PCR產(chǎn)物為探針的人胎組織Northern-印跡在胎肺和胎腎中檢測到5.2kb-轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)(圖23a)。用SimpleModularArchitectureResearchTool(SMART,http:〃smart.embl-heidelberg.de)檢索蛋白質(zhì)基元，揭示出推測的蛋白質(zhì)含有環(huán)指基元(密碼子272-312)(圖23b)。(23)經(jīng)myc-標(biāo)記的RNF43蛋白的亞細(xì)胞定位為了研究RNF43蛋白的亞細(xì)胞定位，將表達(dá)經(jīng)myc-標(biāo)記的RNF43蛋白的質(zhì)粒(pDNAmyc/His-RNF43)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞。使用細(xì)胞提取物和抗-myc抗體的Western印跡分析揭示出對應(yīng)于經(jīng)標(biāo)記蛋白質(zhì)的85.5-Kda帶(圖24a)。隨后用相同抗體對細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果表明蛋白質(zhì)主要存在于細(xì)胞核中(圖24b)。在SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞中觀察到類似的RNF43亞細(xì)"包定位。〖24)RNP43對細(xì)胞生長的作用通過用表達(dá)RKF43的質(zhì)粒(pcDNA-RNF43)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞以進(jìn)行集落-形成試驗(yàn)。與對照細(xì)胞相比，被pcDNA-RNF43轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生顯著更多的集落(圖25a)。在RNF43的內(nèi)源性表達(dá)很低的SW480細(xì)胞中也顯示出由RNF43導(dǎo)致的增加的集落形成活性(數(shù)據(jù)未顯示)。為了進(jìn)一步研究該生長-促進(jìn)作用，建立了穩(wěn)定表達(dá)外源性RNF43的COS7細(xì)胞(COS7-RNF43)(圖25b)。在含有10%FBS的培養(yǎng)基中，COS7-RNF43細(xì)胞的生長速度顯著高于COS7-模擬細(xì)胞(圖25c)。(25):通過指定用于降低RNF43表達(dá)的反義S-寡核苷酸抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長為了檢測抑制RNF43表達(dá)是否能導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的生長阻滯和/或細(xì)胞死亡，合成了5對對應(yīng)于RNF43的對照和反義S-寡核苷酸，并將它們轉(zhuǎn)染至LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞，在被檢查的11個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系中，LoVo細(xì)胞顯示出較高水平的RNF43表達(dá)。轉(zhuǎn)染12小時(shí)后，與對照S-寡核苷酸(RNF43-Sl)相比，5個(gè)反義S-寡核苦酸中的RNF43-AS1能顯著抑制RNF43表達(dá)(圖26a)。轉(zhuǎn)染6天后，被RNF43-AS1轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞數(shù)目顯著少于被RNF43-S1轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞數(shù)目，暗示著抑制RNF43表達(dá)能抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長和/或存活(圖)。在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中獲得一致的結(jié)果?！馁|(zhì)?！臉?gòu)建及其對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用最近已證實(shí)在哺乳動物細(xì)胞中，短的干擾RNA(siRNA)具有基因特異性的基因沉默作用，而不會誘導(dǎo)基因表達(dá)的全面改變，所述siRNA由具有19個(gè)互補(bǔ)核苦酸和3'末端互補(bǔ)的胸苷或尿苷二聚體的20至21聚體雙鏈RNA(dsRNA)組成。因此，本發(fā)明人構(gòu)建了表達(dá)多種RNF43-siRNA的質(zhì)粒，并檢查了它們對凡VFW表達(dá)的作用。在多種RNF43-siRNA中，psiHlBX-RNF16-4和psiHlBX-RNF1834能顯著抑制SNUC4細(xì)胞中的/WF43表達(dá)(圖27A)。為了檢測抑制iA^^3是否能導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的生長受抑制，用psiHlBX-RNF16-4，psiHlBX-RNF1834或模擬載體轉(zhuǎn)染SNUC4細(xì)胞。與反義S-寡核苷酸的數(shù)據(jù)一致，被psiHlBX-RNF16-4或psiHlBX-RNF1834轉(zhuǎn)染的存活細(xì)胞數(shù)目少于存活的對照細(xì)胞數(shù)目(圖27B,27C)?！?7)經(jīng)Flag-標(biāo)記的RNF43蛋白在具有經(jīng)Flag-標(biāo)記的外源性RNP43蛋白的COS7細(xì)胞的培養(yǎng)基中的分泌由于使用SimpleModularArchitectureResearchTool(SMART,http:〃smart.embl-heidelberg.de)檢索具有RNF43氨基酸序列的蛋白質(zhì)基元推測出信號肽和環(huán)指結(jié)構(gòu)域，因此檢查了RNF43蛋白的分泌情況。將表達(dá)經(jīng)Flag-標(biāo)記的RNF43(pFLAG-RNF43)或經(jīng)Myc-標(biāo)記的RNF43(pcDNA3.1-Myc/His-RNF43)的質(zhì)粒或模擬載體轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞，在添加有0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)。用抗-Flag抗體或抗-Myc抗體進(jìn)行Western印跡分析，分別在含有被pFLAG-RNF43或pcDNA3.1-Myc/His-RNF43轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基，而不是含有被模擬載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基中檢測出分泌的經(jīng)Flag-標(biāo)記的RNF43或經(jīng)Myc-標(biāo)記的蛋白質(zhì)(圖28A和28B)。(28)被pFLAG-RNF43轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基對NIH3T3細(xì)胞的作用由于RNF43的外源性表達(dá)對NIH3T3細(xì)胞有生長促進(jìn)作用，因此，檢查了分泌的經(jīng)Flag-標(biāo)記的RNF43是否也對NIH3T3細(xì)胞有增殖作用。不更換培養(yǎng)基，或用被模擬載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，或用被pFlag-RNF43轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞。正如所期望的那樣，與在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未經(jīng)處理的細(xì)胞或被模擬載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的被pFlag-RNF43或pcDNA3.1-Myc/His-RNF43轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示出顯著較高的生長速度(圖29A和29B)。這些數(shù)據(jù)表明RNF4370可以自泌的方式發(fā)揮其生長促進(jìn)作用。(29)制備重組氨基-和羧基-末端RNF43蛋白為了產(chǎn)生抗RNF43的特異性抗體，構(gòu)建了表達(dá)經(jīng)Nus-標(biāo)記的RNF43蛋白的質(zhì)粒(圖30A)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21trxB(DE3)pLysS細(xì)胞，通過SDS-PAGE觀察到細(xì)菌提取物中具有預(yù)期大小的重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生(圖30B和30C)。(30)通過酵母雙雜合篩選系統(tǒng)鑒定RNF43-相互作用蛋白為了闡明RNF43的致癌機(jī)理，使用酵母雙雜合篩選系統(tǒng)搜索RNTF43-相互作用蛋向。在鑒定出的陽性克隆中，通過用pAS2.1-RNF43和pACT2-N0TCH2(圖31B),或pAS2.1-RNF43和pACT2-STRIN(圖32B)同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞使NOTCH2或STRIN與RNF43相互作用。圖31A和圖32A分別顯示了NOTCH2和STRIN中負(fù)責(zé)相互作用的區(qū)域。Ol)推測衍生自RMF43的HLA-A24結(jié)合肽<吏用結(jié)合予頁測壽欠"f牛(http:〃bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker—comboform)掃描RNF43的氨基酸序列以搜索長度為9或10個(gè)氨基酸的與HLA-A24結(jié)合的肽。表3以高結(jié)合親和性的次序顯示出推測的肽(SEQIDNO:71-90)。總共選擇和檢查了下述20個(gè)肽。表3推測的與HLA-A24結(jié)合的RNF43多肽<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>在表中，起始位置表示自RNF43N-末端起的氨基酸位置。(32)使用推測的肽刺激T細(xì)胞根據(jù)"材料和方法"中所述的方法產(chǎn)生針對這些衍生自RNF43的肽的CTL。擴(kuò)展所獲得的顯示出可測細(xì)胞毒活性的CTL,并建立CTL系。表4顯示了通過9聚體-肽(SEQIDNO:71-80)刺激所誘導(dǎo)的CTL系的細(xì)胞毒活性。表4CTL系(9聚體)的細(xì)月^性起始位置AA.序列士合,口口親和性20x2已建立的P印(+)P印(-)P印(+)P印(-)CTL1隆RNF43-331SY鄰PGRRL3肌02%1%0%0%RNF43'350HYHLPAAYL200.026%17%5%4%RNF43-639LFNLQKSSL30.042%33%7%5%RNF43-24GFGRTGLVL20.08%9%1%2%RNF43-247RYQASCRQA15.071%82%28%腦RNF43-397RAPGEQQEL14441%32%15%15%RNF43-114RAPRPCI^L12.023%26%6%9%RNF43-368RPPRPGPFL12.01%0%0%0%RNF43-45KAVI函PL12.0NERNF43-721NSQPVWLCL10.068%0%26%0%13NE:未建立CTL系用RNF43-350(HYHLPAAYL)(SEQIDNO:72),RNF43-639(LFNLQKSSL)(SEQIDNO:73)和RNF43-721(NSQPVWLCL)(SEQIDNO:80)刺激的CTL系對經(jīng)肽脈沖的靶的細(xì)胞毒活性高于對未經(jīng)任何肽脈沖的靶的細(xì)胞毒活性。由這些CTL開始，用RNF43-639建立了一個(gè)CTL克隆，用RNF43-721建立了13個(gè)CTL克隆。用RNF43-721刺激的CTL系對經(jīng)肽脈沖的扭顯示出強(qiáng)有力的細(xì)胞毒活性，而對未經(jīng)任何肽脈沖的靶未顯示出任何顯著的細(xì)胞毒活性(圖33)。表5顯示了通過4僉查用10聚體-肽(SEQIDNO:81-90)刺激的CTL系的細(xì)胞毒活性所獲得的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>一步證實(shí)RNF43-721CTL克隆的特異性。將經(jīng)"Cr標(biāo)記的HT29細(xì)胞用作經(jīng)標(biāo)記靶，而將用RNF43-721脈沖的未經(jīng)"Cr標(biāo)記的TISI細(xì)胞用作未標(biāo)記靶。當(dāng)在試^r中以多個(gè)比例加入用RNF43-721脈沖的TISI時(shí)，針對HT29細(xì)胞的特異性細(xì)胞裂解被顯著抑制(圖36)。以E/T=20的比例將這些結(jié)果表示為特異性裂解的百分比。為了檢查針對RNF43肽產(chǎn)生的CTL克隆的特征，檢測了抗HLA-I類，HLA-II類，CD3,CD4和CD8的抗體抑制CTL克隆的細(xì)胞毒活性的能力。當(dāng)使用抗-HLA-I類，CD3和CD8的抗體時(shí)，CTL克隆對WiDR細(xì)胞靶的細(xì)胞毒性受到顯著抑制(圖37)。該結(jié)果表明CTL克隆經(jīng)由HLA-I類，CD3和CD8識別衍生自RNF43的肽?！?6)RNF43-721肽的同源性分析針對RNF43-721建立的CTL克隆顯示出很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。該結(jié)果表示RNF43-721的序列與其它已知可致敏人免疫系統(tǒng)的分子所衍生的肽同源。為了排除這種可能性，使用BLAST(http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)進(jìn)行RNF43-721的同源性分析。在BLAST所列的分子中未發(fā)現(xiàn)與RNF43-721完全匹配或高度同源的序列(表6)。表6RNF43-721的同源性分析(BLASThttp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)鑒定(9/9)0鑒定(8/9)0鑒定(7/9)0鑒定(6/9)2這些結(jié)果表明RKF43-721的序列是獨(dú)特的，用RNF43-721建立的CTL克隆對其它分子產(chǎn)生免疫應(yīng)答的可能性很小。(37)修飾RNF43-721以改善表位呈遞的效力為了改善肽呈遞的效力，在錨位點(diǎn)上進(jìn)行氨基酸改變以修飾RNF43-721肽。該修飾有望能改善肽與HLAI類分子的結(jié)合親和性。表7表明將第2位氨基酸(SEQIDNO:91和92)改變后，RNF43-721與HLA-A24分子的結(jié)合親和性較好。表7RNF43-721天然肽的修飾肽的預(yù)測結(jié)合能力序列NSQPVWLCLN踐PVWLCLNIQPVWLCL分值排位10.081050.403504.001*在HLA-A24限制性的9聚體肽中(38)推測衍生自RNF43的候選肽表8按高結(jié)合親和性次序顯示出候選肽(SEQIDNO:87和93-111)。表8RNF43:預(yù)測表位肽(HLA-AW201)編號起始序列分值編號起始序列分值位置位置160KLNLTLEGV274.31181KLMQSHPLYL1521.52QLAALWPWL199.712357YLLGPSRSAV1183.7382LMQSHPLYL144.213202LMTVVGTIFV469.643581XGPSRSAV118.2142卯CLHEFHRNCV285.1511ALWPWLLMA94.815500SLSSDFDPLV264.2615WLLMATLQA84.5168QLAAIWPWLL跳21711ALWPWLLMAT142.2"7200W謹(jǐn)TVVGT40.118了LQLAALWPWL127.38171KLMEFVYKN34.519726WLCLTPRQPL98.2962NLTLEGVFA27.320302WLHQHRTCPL98.210156GLTWPVVLI23.9總共選擇和檢查了下迷20個(gè)肽。(39)使用候選肽刺激T細(xì)胞按照"材料和方法"中所述的方法，使用這些衍生自RNF43的候選肽培養(yǎng)淋巴細(xì)胞。擴(kuò)展所獲得的顯示出可測細(xì)胞毒活性的淋巴細(xì)胞,并建立CTL系。表9顯示出使用9聚體-肽(SEQIDNO:93-102)刺激誘導(dǎo)的CTL系的細(xì)胞毒活性。表9CTL系(HLA-A^2019聚體)的細(xì)月包毒性_起始AA結(jié)合細(xì)胞毒性(％)_位置序列親和性x20x2Pep(+)Pep(-)Pep(+)Pep(-)RNF43-60KLNLTLEGV274.3-2,10.2-1.60.0RNF43-8QLAALWPWL199.73.50.00.01.0RNF43-82I^QSHPLYL44.2.71.20.0-0.4RNF43-358LLGPSRSAV118.2-0.4-0.70.0-0.8RNF43-11ALWPWLLMA94.890.21.545,41.3RNF43-15WLLMATLQA84.5-0.20.0-0.4-0.9RNF43-200WILMTVVGT40.1未合成RNF43-171KLMEFVYKN34.52.60.0U-0.5RNF43-62NLTLEGVFA27.3未合成RNF43-156GLTWPVVLI23.9-0.40.7-0.5-0.3NE:未建立CTL系用RNF43-ll-9(ALWPWLLMA)(SEQIDNO:97)誘導(dǎo)的CTL系對經(jīng)肽脈沖的耙的細(xì)胞毒活性高于對未經(jīng)任何肽脈沖的草巴的細(xì)胞毒活性。由這些CTL開始，用RNF43-ll-9建立了4個(gè)CTL克隆。用RNF43-ll-9刺激的CTL系對經(jīng)肽脈沖的靶顯示出強(qiáng)有力的細(xì)胞毒活性，而對未經(jīng)任何肽脈沖的靶未顯示出任何顯著的細(xì)胞毒活性(圖38A)。表IO顯示了通過檢查用IO聚體-肽(SEQIDNO:87和103-111)誘導(dǎo)的CTL系的細(xì)胞毒活性所獲得的結(jié)果。表10CTL系(HLA-AW201IO聚體)的細(xì)胞毒性起始位置AA序列結(jié)合親和性細(xì)胞毒性(％):20p印(+)p印(-)p印(+)p印(-)RNF43-81RNF43-357RNF43-202RNF43-2卯RNF43-500RNF43-8RNF43-11KLMQSHPLYL1521.5YLLGPSRSAV1183.7LMTVVGTIFV469.6CLHEFHRNCV285.1SLSSDFDPLV264.2QLAA酵WLL160.2ALWPWLLMAT142.218.027.66.38.318.215.43.73.0未合成9.69.72.73.'NE6.79.0U1.39.527.140.54.3RNF43-7LQLAALWPWL127.3RNF43-726WLCLTPRQPL98.2RNF43-302WLHQHRTCPL98.27.4NENE6.11.52.2NE:未建立CTL系用RNF43-ll-l6^ALWPWLLMAT)(SEQIDNO:108)i秀導(dǎo)的CTL系對經(jīng)肽脈沖的靶的細(xì)胞毒活性高于對未經(jīng)任何肽脈沖的靶的細(xì)胞毒活性(圖38B)。(40)建立CTL克隆使用有限稀釋法由上述CTL系增殖CTL克隆。建立了4個(gè)針對RNP43-ll-9的CTL克隆(見上文的表9)。圖39A和39B顯示了RNF43肽-衍生的CTL克隆的細(xì)胞毒活性。每個(gè)CTL克隆對經(jīng)肽脈沖的靶具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，而對未經(jīng)任何肽脈沖的靶未顯示出任何細(xì)胞毒活性。(41)針對內(nèi)源性表達(dá)RNF43以作為靶的結(jié)腸癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性檢查針對推測肽產(chǎn)生的CTL克隆識別并殺死內(nèi)源性表達(dá)RNF43的腫瘤細(xì)胞的能力。圖40A和40B顯示出針對RKF43衍生肽產(chǎn)生的CTL克隆的結(jié)果。該CTL克隆對表達(dá)RNF43和HLA-A*0201的DLD-1顯示出強(qiáng)有力的細(xì)胞毒活性，但對表達(dá)RNF43但不表達(dá)HLA-A*0201的HT29未顯示出任何細(xì)胞毒活性。(42)CTL克隆的特異性進(jìn)行未標(biāo)記靶的抑制試驗(yàn)以進(jìn)一步證實(shí)RNF43-5-ll(9聚體)CTL克隆的特異性。將經(jīng)"Cr標(biāo)記的HCT116細(xì)胞用作經(jīng)標(biāo)記耙，而將用RKF43-5116細(xì)胞靶的特異性細(xì)胞裂解被顯著抑制(圖41)。工業(yè)實(shí)用性與非癌胃組織相比，新的人基因COD/^7和GCt/D/在胃癌中的表達(dá)顯著提高。另一方面，與非癌粘膜組織相比，新的人基因RNF43在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著提高。因此，這些基因可用作癌癥的"^斷標(biāo)記，由它們編碼的蛋白質(zhì)可用于癌癥診斷試驗(yàn)。本發(fā)明人還證實(shí)新蛋'白質(zhì)CXADRL1,GCUD1或RNF43的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞生長，而通過與CX4D^L7，GC77A^戈iWFW基因相對應(yīng)的反義寡核苷酸或小的干擾RNA可抑制細(xì)胞生長。這些發(fā)現(xiàn)暗示CXADRLl,GCUD1或RNF43蛋白中的每一種都能刺激致癌活性。因此，這些新的癌癥蛋白質(zhì)中的每一種都是對開發(fā)抗癌藥物有用的靶。例如，能阻斷CXADRLl,GCUD1或RNF43表達(dá)或抑制其活性的藥劑具有作為抗-癌藥劑，特別是治療胃癌和結(jié)腸癌的抗-癌藥劑的治療用途。所述藥劑的例子包括反義寡核苷酸、小的干擾RNA和能識別CXADRL1,GCUD1或RNF43的抗體。另外，本發(fā)明人還證實(shí)了CXADRL1能與AIP1相互作用。CXADRL1與AIP1的結(jié)合有望調(diào)節(jié)CXADRL1的細(xì)胞增殖活性。因此，能抑制由CXADRL1與AIP1組成的復(fù)合物形成的藥劑可用于治療和預(yù)防癌癥，尤其是結(jié)腸癌、肺癌、胃癌和肝癌?；蛘撸景l(fā)明人還證實(shí)了RNF43能與N0TCH2或STRIN相互作用。RNF43與NOTCH2或STRIN的結(jié)合有望調(diào)節(jié)RNF43的細(xì)胞增殖活性。因此，能抑制由RNF43與NOTCH2或STRIN組成的復(fù)合物形成的藥劑可用于治療和預(yù)防癌癥，尤其是結(jié)腸癌、肺癌、胃癌和肝癌。盡管根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案詳細(xì)描述了本發(fā)明，但本發(fā)明的多種變化和修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，并不背離本發(fā)明的精神和范圍。序列表<110〉腫瘤療法科學(xué)股份有限公司(0NC0THERAPY國立大學(xué)法人東京大學(xué)(THEUNIVERSITYSCIENCE,INC.)OFTOKYO)<120>與人結(jié)腸癌相關(guān)的基因和多肽<130>0NC-A0203Y2P<150〉<151>US60/386,9852002-06-06<150><151>US60/415,2092002-09-30<150><151>US60/451,0132003-02-28<160>194<170>PatentInversion3.1<210><211〉<212><213>13423DNA人(Homosapiens)<220><221><222><223〉CDS(238)..(1533)<400〉1gctggcgagcccggaacgcctctggtcacagctcagcgtccgcggagccgggcggcgctg60gagctgcacttggctcgtctgtgggtctgacagtcccagctctgcgcggggaacagcggc120ccggagctgggtgtgggaggaccaggctgccccaagagcgcggagactcacgcccgctcc180tCtCCtgUgCg3CCggg3gCCgggUgg3ggC3ggCgCgctccctgcggccccggg237atgacttctcagcgtteccctctggcgcctttgctgetcetctctc.tg285MetThrSerGinArgSerProLeuXlaProLeuLeuLeuLeuSerLeu151015cacggtgttgcagcatecctggaagtgteagagagecctgggagtate333HisG!yValAlaAlaSerLeuGluValSerGluSerProGlySerlie202530caggtggcceggggtcagccagcagtcctgccctgcactUcactacc381GinValAlaArgGlyGinProAlaValLeuProCysThrPheThrThr354045agegetgccetca"aacetcaatgtcatttggatggtcactcctetc429SerAlaAlaLeulieAsnLeuAsnVallieTrpMetValThrProLeu505560tecaatgccaaccaacctgaacaggtcatectgtatcagggtggacag477SerAsnAlaAsnGinProGluGinVallieLeuTyrGinGlyGlyGin65707580atgtttgatggtgccccceggUccacggtagggUggatttacaggc525MetPheAspGlyAlaProArgPheHisGlyArgValGlyPheThrGly859095accatgccagetaccaatgtctctateUcattaataacactcagUa573ThrMetProAlaThrAsnValSerliePhelieAsnAsnThrGinLeu100105110<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>ProArgProProHis400actcattectacaccateagecacgcaacactgThrHisSerTyrThrlieSerHisXlaThrLeu405410gaacgaattggtgcaGluArglieGlyAla4151485gUcctgtcatggtaccagcccagagtegggccValProValMetValProAlaGinSerArgAla420425gggtecttggUtagGlySerLeuVal4301533gacatgaggaaatgttgtgttcagaaatgaataaatggaatgccctcatagggggag1593ggtggggtggggagtgctgggaaagaaacacttcctutataaaatgeae1653a汪汪gaagaaggcagtgctgttacttggecaCU柳tgtgUaaatgg汪ctgaa"gctc1713catcatgaagacttgcUccccaccaaa^tgtcctgggauctgctggatctcaaagat1773gtgccaagccaaggaaaaagatacaagagcagaatagtacUaaaatccaaactgccgcc1833tgttcUcatgectaacttaagagattaaagtgccag"g1893gagtttaaatattgaaatUttttaaaaggtaggtgtcttacaagcaacc1953ctgtgaUtgttccgtctctccca"tccctcgttaUUgagggcttMtggtataaat2013ggtcccaacagggctgactcttctatcataUatcaaaactttttacatg2073agcaaaattcagtaagaaataaagga^iacgtctttgagaagccccttcat2133atttatttatttatctcttcaatttcatatgtggaatattgctatattga2193cagattcttgcctgtctgtgtUUcUgg"ctgtUcaggtccatggcaattactgU2253UttttUcctggaaaaataUUUUtaaaaggcttutttutmt2313gaggcattgggcUagaaagaaaagactgttgUtaaUccttgttcaatggttgUttt2373tagaggtccatcatatcatgaccgagctaggttgtgtgggcaggaaggta2433gggcuaggggttgUgccttgctgggcagcctctcagagcaaggttgttcagatctccc2493UgctattacsgtaggmctatUatgagggcagc汪cctg"gcctUtgtdctgaggt2553atgtaactttctccttatttgacaagUgacttgtcagggagggcagacg2613UtUUgttctgtUcgtttttcaaaataatgcUtUgcaaaagaggtaagactgaga2673ct,ggtgttatcttctggtgtgctcctggaagtgtcuccctacatttgtgtcagctc2733鄉(xiāng)gttgC3gtgUgcccagatgeatUUcatcactgU33g卿tUCttttgtggtt2793acUcctggcttggctggccUgcggUcaccagatuatttacaaactcccccacttta2853ttttgtgctatgtagatctggecatacttgcattagtgactgtcttgecttaaccacact2913UagcaacccacaaatUcttctc，UtgtttccUgattacUatgatactcatccc2973atgtctcaataagagtgtcttttctttctggatgtgttctctUctccctctUccacca3033tactttttgctctcttctcctgcaagcgtagtcttcacagggagtggcttcctgacattt3093UUcagtta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>87<211>10<212〉PRT<213〉人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400〉87LysLeuMetGinSerHisProLeuTyrLeu1510<210>88<211>10<212>PRT<213>人工的<220〉<223〉人工合成的肽序列<400>88LysMetAspProThrGlyLysLeuAsnLeu1510<210>89<211>10<212〉PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>89HisTyrThrProSerValAlaTyrProTrp<21D><211><212>9010PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>90GlyGinGluLeuArgVallieSerCysLeu1510<210>91<211>9<212〉PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>91AsnPheGinProValTrpLeuCysLeu15<210〉92<211〉9<212>PRT<213〉人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400〉92AsnTyrGinProValTrpLeuCysLeu15<210>93<211〉9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>93LysLeuAsnLeuThrLeuGluGlyVal15<210>94<211>9<212>PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>94GinLeuAlaAlaLeuTrpProTrpLeu15<210〉95<211>9<212〉PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>95LeuMetGinSerHisProLeuTyrLeu15<210>96<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>96LeuLeuGlyProSerArgSerAlaVal15<210>97<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>97AlaLeuTrpProTrpLeuLeuMetAla15<210〉98<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>98TrpLeuLeuMetAlaThrLeuGinAla15<210>99<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>99TrplieLeuMetThrValValGlyThr15<210>100<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>100LysLeuMetGluPheValTyrLysAsn15<210>101<211>9<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>101AsnLeuThrLeuGluGlyValPheAla15<210〉102<211〉9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>102GlyLeuThrTrpProValValLeulie15<210>103<211〉10<212>PRT<213>人工的<220〉<223〉人工合成的肽序列<400>103TyrLeuLeuGlyProSerArgSerAlaVal1510<210>104<211>10<212〉PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>104LeuMetThrValValGlyThrliePheVal1510<210>105<211〉10<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉105CysLeuHisGluPheHisArgAsnCysVal1510<210>106<211>10<212>PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>106SerLeuSerSerAspPheAspProLeuVal1510<210>107<211〉10<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>107GinLeuAlaAlalieTrpProTrpLeuLeu1510<210>108<211>10<212〉PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉108AlaLeuTrpProTrpLeuLeuMetAlaThr1510<210>109<211>10<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>109LeuGinLeuAlaAlaLeuTrpProTrpLeu1510<210>110<211〉10<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>110TrpLeuCysLeuThrProArgGinProLeu1510<210〉111<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>111TrpLeuHisGinHisArgThrCysProLeu1510<210><211><212><213><220><223>11220醒人工的siRNA的人工合成靶序列<400>112gtcaccggatccaactcagt20<210〉113<211〉20<212>DNA<213>人工的<220><223>siRM的人工合成把序列'<400〉113gctattgcacagaacgcsgt20<210>114<211〉20<212〉DNA<213>人工的<220><223>siRNA的人工合成靶序列<400>114caggtcatcctgtatcaggt20<210>115<211>9<212>PRT114<213>人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>115TyrLeuTrpGluLysLeuAspAsnThr15<210〉116<211>9<212>PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>116LeuLeuLeuLeuSerLeuHisGlyVal15<210>117<2il〉9<212〉PRT<213〉人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400〉117lieAsnLeuAsnVallieTrpMetVal15<210>118<211>9<212>PRT<213〉人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400〉118TrpMetValThrProLeuSerAsnAla15<210>119<211〉9<212>PRT<213>人工的<220〉<223〉人工合成的肽序列<400>119CysLeuValAsnAsnLeuProAsplie15<210>120<211>9<212>PRT<213〉人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>120SerLeuHisGlyValAlaAlaSerLeu15<210>121<211>9<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉121VallielieliePheCyslieAlaLeu15<210〉122<211〉9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉122LeulieAsnLeuAsnVallieTrpMet15<210>123<211〉9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>123AlaValLeuProCysThrPheThrThr15<210>124<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>124AULeuSerSerGlyLeuTyrGinCys15<210〉125<211>9<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>125ValMetSerArgSerAsnGlySerVal15<210〉126<211>9<212〉PRT<213〉人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>126SerliePhelieAsnAsnThrGinLeu15<210〉127<211〉9<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>127LysValHisArgAsnThrAspSerVal15<210>128<211〉9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>128ArglieGlyAlaValProValMetVal15<210〉129<211〉9<212〉PRT<213〉人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>129AsnlieGlyValThrGlyLeuThrVal15<210〉130<211〉9<212〉PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉130SerlieTyrAlaAsnGlyThrHisLeu15<210>131<211〉9117<212〉PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>131LeuLeuCysSerSerGluGluGlylie15<210〉<211〉<212><213>1329PRT人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>132LeuLeuSerLeuHisGlyValAlaAla15<210><211〉<212><213>1339PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>133lieliePheCyslieAlaLeulieLeu15<210><211><212〉<213>1349PRT人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>134ThrMetProAlaThrAsnValSerlie15<210><211><212><213>13510PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉135TyrLeuTrpGluLysLeuAspAsnThrLeu1510<210>136<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>136LeulieAsnLeuAsnVallieTrpMetVal1510<210>137<211>10<212〉PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉137AlaLeuSerSerGlyLeuTyrGinCysVal1510<210>138<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉138AlaLeulieAsnLeuAsnVallieTrpMet1510<210>139<211〉10<212〉PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>139lieLeuLeuCysSerSerGluGluGlylie1510<210〉140<211>10<212〉PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉140ValLeuProCysThrPheThrThrSerAla1510<210〉141<211〉10<212>PRT<213>人工的<220〉<223〉人工合成的肽序列<400〉141LeuLeuLeuSerLeuHisGlyValAlaAla1510<210><211〉<212〉<213〉14210PRT人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>142SerlieTyrAlaAsnGlyThrHisLeuVal1510<210><211〉<212〉<213>14310PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>143GinLeuSerAspThrGlyThrTyrGinCys1510<210><211><212><213>14410PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>144GlyLeuTyrGinCysValAlaSerAsnAla1510<210><2U><212><213〉14510PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉145ProLeuLeuLeuLeuSerLeuHisGlyVal1510<210><211><212〉<213>14610PRT人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>146lieGinValAlaArgGlyGinProAlaVal1510<210><211><212〉<213>14710PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉147PhelieAsnAsnThrGinLeuSerAspThr1510<210><2H><212><213>14810PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>148LeuValProGlyGinHisLysThrLeuVal1510<210><211〉<212><213>14910PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>149AsnLeuProAsplieGlyGlyArgAsnlie1510<210><211><212><213>15010PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>150ValLeuValProProSerAlaProHisCys1510<210><211〉<212〉<213>15110PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>151AlaVallielieliePheCyslieAlaLeu1510<210>152<211>10<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>152VallielieliePheCyslieAlaLeulie1510<210>153<211>10<212>PRT<213>人工的<220〉<223〉人工合成的肽序列<400〉153lieLeuGlyAlaPhePheTyrTrpArgSer1510<210〉154<211〉10<212〉PRT<213>人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>154GlyLeuThrValLeuValProProSerAla1510<210>155<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>155SerliePheLysProPheliePheVal15<210>156<211〉9<212〉PRT<213>人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>156TrpLeuTrpGlyAlaGluMetGlyAla15<210〉157<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>157lieMetlieSerArgProAlaTrpLeu15<210>158<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>158LeuLeuGlyMetAspLeuValArgLeu15<210>159<211〉9<212〉PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>159PheliePheValAspAspValLysLeu15<210〉160<211>9<212〉PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>160ValCyslieAspSerGluPhePheLeu15<210〉161<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>161LysProPheliePheValAspAspVal15<210>162<211>9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉162lieValAspArgAspGluAlaTrpVal15123<210><211〉<212〉<213>1639PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>163ThrLeuArgAspLysAlaSerGlyVal15<210><211><212><213>1649PRT人工的<220〉<223〉人工合成的肽序列<400〉164LysMetAspAlaGluHisProGluLeu15<210><211><212><213>1659PRT人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>165AlaLeuAspVallieValSerIxuLeu15<210〉<211〉<212><213>1669PRT人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>166TyrAlaGinSerGinGlyTrpTrpThr15<210><211><212><213〉1679PRT人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>167LysLeuArgSerThrMetLeuGluLeu15<210>168<211〉9<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>168TyrLeulieValAspArgAspGluAla15<210><211><212><213>1699PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>169AlaAlaProProSerTyrCysPheVal15<210><211><212〉<213>1709PRT人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400〉170GlyMetAspLeuValArgLeuGlyLeu15<210><211〉<212><213>1719PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>171LysValThrGluGlyValArgCyslie15<210><211><212><213〉1729PRT人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>172CyslieAspSerGluPhePheLeuThr15<210〉173<211>9<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>173ThrValGinThrMetMetAsnThrLeu15<210>174<211〉9<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉174GluMetGlyAlaAsnGluHisGlyVal15<210>175<211〉10<212〉PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉175PheliePheValAspAspValLysLeuVal1510<210〉176<211〉10<212〉PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>176LeulieValAspArgAspGluAlaTrpVal1510<210>177<211〉10<212>PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>177PheLeuThrThrAlaSerGlyValSerVal1510<210〉178<211>10<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉178ThrMetLeuGluLeuGluLysGinGlyLeu10<210><211><212><213>17910PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>179AlaLeuLeuGlyMetAspLeuValArgLeu1510<210><211〉<212><213>18010PRT人工的<220〉<223〉人工合成的肽序列<400〉180AlalieMetlieSerArgProAlaTrpLeu1510<210><211><212><213>18110PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>181GlyValCyslieAspSerGluPhePheLeu1510<210>182<211>10<212>PRT<213>人工的<220〉<223〉人工合成的肽序列<400>182LysLeuValProLysThr'15<210>183<211>10<212〉PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>183PheAsnPheSerGluVal15<210>1841010127<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400〉184TyrlieSerlieAspGinValProArgThr1510<210>185<211>10<212>PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>185GlyGluGlyGluPheAsnPheSerGluVal1510<210〉186<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400〉186TrpAlaAlaGluLysValThrGluGlyVal1510<210>187<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223〉人工合成的肽序列<400>187ValLeuProGinAsnArgSerSerProCys1510<210>188<211〉10<212>PRT<213〉人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>188AlaAlaAlaProProSerTyrCysPheVal<210><211><212><213>18910PRT人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>189ThrMetMetAsnThrLeuArgAspLysAla1510<210>190<211>10<212>PRT<213>人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>190GluValGlyAspLeuPheTyrAspCysVal1510<210>191<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>191AlaGluMetGlyAlaAsnGluHisGlyVal1510<210>192<211>10<212>PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>192GlyLeuValValPheGlyLysAsnSerAla1510<210>193<211>10<212〉PRT<213>人工的<220><223>人工合成的肽序列<400>193GinLeuSerLeuThrThrLysMetAspAla1510<210>194<211>10<212>PRT<213〉人工的<220〉<223>人工合成的肽序列<400>194ArgSerliePheLysProPheliePheVal1510權(quán)利要求1.選自下列的基本上純的多肽(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO2，4或6；(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO2，4或6且其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO2，4或6組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO1，3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由SEQIDNO2，4或6中任一氨基酸序列組成的多肽等同的生物活性。2.分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求l的多肽。3.載體，其含有權(quán)利要求2的多核苷酸。4.宿主細(xì)胞，其攜有權(quán)利要求2的多核苷酸或權(quán)利要求3的載體。5.產(chǎn)生權(quán)利要求l的多肽的方法，所述方法包括下述步驟(a)培養(yǎng)權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞；(b)使宿主細(xì)胞表達(dá)所述多肽；和(c)收集所表達(dá)的多肽。6.抗體，其與權(quán)利要求l的多肽結(jié)合。7.多核苷酸，它與權(quán)利要求2的多核苷酸或其互補(bǔ)鏈互補(bǔ)，并且含有至少15個(gè)核苷酸。8.反義多核苷酸或小的干擾RNA,其針對權(quán)利要求2的多核苷酸。9.權(quán)利要求8的反義多核苷酸，其選自含有核苷酸序列SEQIDNO:23:25,27,29或31的核香酸。10.權(quán)利要求8的小的干擾RNA，其有義鏈選自含有核苷酸序列SEQIDNO:112，113和114的核苷酸。11.診斷細(xì)胞增殖性疾病的方法，所述方法包括下述步驟(a)檢測樣本的生物樣品中編碼氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6的基因的表達(dá)水平；和(b)將對表達(dá)水平的評價(jià)與疾病相關(guān)聯(lián)。12.權(quán)利要求ll的方法，其用選自下列的任一種方法檢測表達(dá)水平(a)檢測編碼氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6的mRNA;(b)檢測含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6的蛋白質(zhì)；和(c)檢測含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6的蛋白質(zhì)的生物活性。13.篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步驟(a)使受試化合物與選自下列的多肽接觸(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6;(2)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(3)多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性；(b)檢測所述多肽與受試化合物之間的結(jié)合活性；和(c)選擇與所述多肽結(jié)合的化合物。14.篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步驟(a)使候選化合物與表達(dá)一或多種由核香酸序列SEQIDNO:1,3或5組成的多核苷酸的細(xì)胞接觸；和(b)選擇與缺乏受試化合物時(shí)檢測到的表達(dá)水平相比，能降低一或多種由核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5組成的多核苦酸的表達(dá)水平的化合物。15.篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步驟(a)使受試化合物與選自下列的多肽接觸(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6;(2)多肽，其含有氨基S臾序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(3)多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1，3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性；(b)檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和(c)選擇與缺乏受試化合物時(shí)檢測到的生物活性相比，能抑制所述多肽生物活性的化合物。16.權(quán)利要求15的方法，其中生物活性是細(xì)胞-增殖活性。17.篩選治療細(xì)J包增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步驟(a)在受試化合物的存在下，使選自下列的多肽與AIP1接觸(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2;(2)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2且其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(3)多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:l組成的多核香酸雜交的多核芬酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2組成的多肽等同的生物活性；(b)沖企測所述多肽與AIPl之間的結(jié)合；和(c)選擇能抑制所述多肽與AIP1之間的結(jié)合的受試化合物。18.篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步驟(a)在受試化合物存在的條件下，使選自下列的多肽與NOTCH2或ST麗接觸(1)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:6;(2)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:6且其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:6組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(3)多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:6組成的多肽等同的生物活性；(b)檢測多肽與NOTCH2或STRIN之間的結(jié)合；和(c)選擇能抑制多肽與NOTCH2或STRIN之間的結(jié)合的受試化合物。19.篩選治療細(xì)胞增殖性疾病的化合物的方法，包括下述步驟a)使候選化合物與已導(dǎo)入載體的細(xì)胞接觸，所述載體含有一或多種標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制之下表達(dá)的報(bào)道基因，其中一或多種標(biāo)記基因含有選自SEQIDNO:1,3或5任一的核苷酸序列，b)測定所述報(bào)道基因的活性；和c)選擇與對照相比能降低所述報(bào)道基因的表達(dá)水平的化合物。20.權(quán)利要求11至19中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞-增殖性疾病是癌癥。21.治療細(xì)胞增殖性疾病的組合物，所述組合物含有藥物有效量的針對編碼選自下列之多肽的多核苷酸的反義多核苦酸或小干擾RNA作為活性成分并含有可藥用載體(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6;(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苦酸序列SEQIDNO:1,3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性。22.治療細(xì)胞增殖性疾病的組合物，所述組合物含有藥物有效量的抗選自下列之多肽的抗體作為活性成分并含有可藥用載體(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6;(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性。23.治療細(xì)胞增殖性疾病的組合物，所述組合物含有藥物有效量的通過權(quán)利要求13至19任一方法選擇的化合物作為活性成分并含有可藥用載體。24.權(quán)利要求21至23之一的組合物，其中細(xì)胞增殖性疾病是癌癥。25.治療細(xì)胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用藥物有效量的針對編碼選自下列之多肽的多核苷酸的反義多核苷酸或小干擾RNA的步驟(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6;(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1，3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性。26.治療細(xì)胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用藥物有效量的抗選自下列之多肽的抗體的步驟(a)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2^或6;(b)多肽，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6且其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c)多肽，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1，3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性。27.治療細(xì)胞增殖性疾病的方法，所述方法包括施用藥物有效量的通過權(quán)利要求13至19中任一項(xiàng)的方法選擇的化合物的步驟。28.權(quán)利要求25至27中任一項(xiàng)的組合物，其中細(xì)胞增殖性疾病是癌癥。29.治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括施用藥物有效量的選自(a)-(c)的多肽或編碼所述多肽的多核普酸的步驟(a)多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6;(b)多肽或其片段，所述多肽含有氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6且其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c)多肽或其片段，所述多肽由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1，3或5組成的多核苦酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6組成的多肽等同的生物活性。30.權(quán)利要求29的治療或預(yù)防癌癥的方法，其中所述多肽選自含有氨基酸序列SEQIDNO:80,97，108,124和164的多肽。31.誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的方法，所述方法包括，使選自(a)-(c)的多肽與抗原呈遞細(xì)胞接觸，或?qū)⒕幋a所述多肽的多核苷酸或含有所述多核苷酸的載體導(dǎo)入抗原呈遞細(xì)胞的步驟(a)多肽或其片段，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6;(b)多肽或其片段，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c)多肽或其片段，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNQ:1，3或5組成的多核苷酸雜交的多核苦酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的多肽等同的生物活性。32.權(quán)利要求31的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的方法，其中所述多肽選自含有氨基酸序列SEQIDNO:80,97,108,124和164的多肽。33.權(quán)利要求31的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的方法，其中所述方法還包括給受試者施用抗原呈遞細(xì)胞的步驟。34.治療或預(yù)防癌癥的藥物組合物，所述組合物含有藥物有效量的選自(a)-(c)的多肽或編碼所述多肽的多核苷酸作為活性成分并含有可藥用載體(a)多肽或其片段，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6;(b)多肽或其片段，其含有氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6且其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸^^取代、缺失、插入和/或添加，并且所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2,4或6組成的蛋白質(zhì)等同的生物活性；和(c)多肽或其片段，其由能在嚴(yán)緊條件下與由核苷酸序列SEQIDNO:1,3或5組成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQIDNO:2，4或6組成的多肽等同的生物活性。35.權(quán)利要求33的藥物組合物，其含有藥物有效量的含有選自氨基酸序列SEQIDNO:80,97，108,124和164的多肽。36.權(quán)利要求34的藥物組合物，其中多核普酸被摻入表達(dá)載體。全文摘要本申請?zhí)峁┝诵碌娜嘶騌NF43，該基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)顯著提高，本申請還提供了新的人基因CXADRL1和GCUD1，與相應(yīng)的非-癌組織相比，所述基因在胃癌中的表達(dá)顯著提高。所述基因和由其編碼的多肽可用于例如診斷細(xì)胞增殖性疾病，并用作開發(fā)針對所述疾病的藥物的靶分子。文檔編號C12N15/12GK101613405SQ20091016516公開日2009年12月30日申請日期2003年6月3日優(yōu)先權(quán)日2002年6月6日發(fā)明者中村佑輔,古川洋一,田原秀晃,角田卓也申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司