專利名稱：：卷煙煙氣遺傳毒性的體外細胞微核檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及巻煙煙氣的毒性檢測分析，尤其是一種巻煙煙氣遺傳毒性的體外細胞微核檢測方法，可應(yīng)用于評價巻煙煙氣的遺傳毒性。
背景技術(shù)：
：微核試驗作為推斷化合物染色體損傷的遺傳毒性檢測方法，具有快速、簡便、經(jīng)濟等特點，在環(huán)境化合物快速篩選和大量職業(yè)暴露人群檢測方面得到廣泛應(yīng)用(曹佳，林真，余爭平.微核試驗——原理、方法及其在人群監(jiān)測和毒性評價中的應(yīng)用[M].軍事醫(yī)學出版社，北京，2000)。微核檢測的敏感性、特異性和準確性優(yōu)于其它染色體畸變分析，因此許多國家和國際組織將其規(guī)定為新藥、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品等毒理學安全性評價的必需實驗(楊穎.體外微核技術(shù)及其進展.國外醫(yī)學衛(wèi)生學分冊[J]2007，34(2):80-83)。自20世紀70年代，各國都在不斷研究微核檢測新方法，各種新技術(shù)、新手段層出不窮。目前，微核檢測方法主要集中于鏡檢法(常規(guī)微核試驗、胞質(zhì)分裂阻滯法、熒光原位雜交試驗與DNA探針、抗著絲?？贵w染色)和自動化法(圖像分析系統(tǒng)檢測和流式細胞儀檢測)。但微核檢測的每種方法都存在其不足之處鏡檢法費時費力，且存在主觀誤差；圖像分析系統(tǒng)檢測存在部分微核不能被識別，產(chǎn)生假陰性結(jié)果；以往流式細胞儀檢測微核易受凋亡小體釋放細胞核顆粒的影響，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。同時，在大規(guī)模藥物篩選和環(huán)境化合物遺傳毒性檢測方面，現(xiàn)有的微核檢測方法較難滿足當前需求。CORESTA(CooperationCentreforScientificResearchRelativetoTobacco)煙草煙氣體外毒性測試工作組建議以L5178Y小鼠淋巴瘤細胞為染毒對象，通過熒光顯微鏡方法檢測細胞微核率。該方法存在諸多不足染毒細胞凋亡，出現(xiàn)凋亡小體，干擾微核鏡下觀察，導致假陽性；微核鏡下計數(shù)1000多個細胞，工作量大；人為因素可能影響微核鏡計數(shù)結(jié)果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的正是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供了一種可以快速、準確、高通量的微核檢測新方法——一種巻煙煙氣遺傳毒性的體外細胞微核檢測方法，該方法采用EMA和SYTOX對細胞核進行染色，進而區(qū)分微核、凋亡小體及細胞核。通過流式細胞儀，結(jié)合體外細胞培養(yǎng)試驗，應(yīng)用RNase酶和熒光探針排除干擾，可滿足微核檢測的高通量需求。同時本方法能夠檢測細胞內(nèi)DNA分布。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的本發(fā)明的巻煙煙氣遺傳毒性的體外細胞微核檢測方法，以永生化人支氣管上皮細胞為靶細胞，進行染毒處理，細胞經(jīng)低滲、高滲等處理，并經(jīng)兩種熒光探針染色，流式細胞儀分析。具體步驟包括指數(shù)生長期細胞，煙氣冷凝物染毒處理，收集細胞進行處理，經(jīng)EMA探針染色，洗滌后，低滲溶液膨脹細胞，并對細胞膜打孔處理，RNaseA水解RNA，SYTOX與DNA結(jié)合，加入高滲溶液，破碎細胞膜，釋放細胞核，SYTOX與DNA結(jié)合。梯度離心(2500Xg，15min)后，進行流式細胞儀分析。在本發(fā)明中，細胞處理過程如下取5乂105個細胞于15ml聚丙烯離心管中，離心，棄上清，輕打重懸細胞。加入300ii1EMA染液，浸入碎冰，可見光源照射細胞懸浮液，持續(xù)30min。光激活結(jié)束后，加入3ml2%胎牛血清液，以錫箔紙包裹管子避光。上述溶液離心，棄上清，輕打重懸細胞；于室溫下，慢速加入500iil裂解液I，迅速渦旋，室溫放置lh;用力打入500ii1裂解液II，渦旋，室溫放置30min后，離心后，棄上清，沉淀顆粒經(jīng)PBS重懸后，流式細胞儀檢測。所用的裂解液I溶液包括以下組分每毫升溶液中含有氯化鈉0.l-lmg，檸檬酸鈉l-10mg，IGEPAL0.1-1ii1，RNaseA0.05-0.5mg，SYTOX0.25-1iimol，以去離子水配制。所用的裂解液II溶液包括以下組分每毫升溶液中含有蔗糖85.6-171.2mg，檸檬酸15-25mg，SYTOX0.25-1ymol，以去離子水配制。本發(fā)明的原理如下采用EMA對細胞進行染色。在細胞膜完整的情況下，EMA無法進入細胞，而凋亡中后期細胞及壞死細胞的細胞膜受損，EMA可進入細胞，在光激活條件下，嵌入凋亡中、后期細胞和壞死細胞的DNA，實現(xiàn)對死亡細胞核及凋亡小體的熒光標記。對細胞膜打孔，細胞膨脹，對核內(nèi)物質(zhì)(主核、微核)進行分離，進而破碎細胞膜，釋放胞內(nèi)核物質(zhì)，并采用SYTOX對有核物質(zhì)包括微核進行染色。經(jīng)梯度離心，除去線粒體及其它非特異性(碎片)顆粒。預(yù)分析的主核和微核僅具有SYTOX—種探針，而凋亡小體及假陽性細胞核含SYTOX和EMA兩種探針。通過流式細胞儀檢測區(qū)分各種核酸物質(zhì)。現(xiàn)將本發(fā)明所涉及的儀器、試劑、細胞前期培養(yǎng)、染毒以及儀器參數(shù)設(shè)置、結(jié)果處理等過程做進一步描述1.儀器準備與試劑配制。(1)主要儀器和設(shè)備流式細胞儀(BDCorporation,SanJose，CA，USA)、C02孵箱、離心機、潔凈工作臺。(2)試劑探針A(EMA，ethidiummonoazidebromide，InvitrogenCorporation)，探針B(SYT0X，InvitrogenCorporation),蔗糖(Sigma-AldrichCorporation)，擰樣酸納(Sigma—AldrichCorporation)，NaCl(Sigma—AldrichCorporation)，貯樣酸(Sigma-AldrichCorporation),RNaseA(Sigma-AldrichCorporation),Ig印alCA-630(Sigma-AldrichCorporation)，月臺牛血清(SAFCBiosciences)，PBS(Phosphatebuffersalt,磷酸鹽緩沖液)。(3)熒光探針溶液配制①EMA探針溶液EMA(l-20iig/ml)，于2%胎牛血清中配制。②裂解液I溶液每毫升溶液中含有NaCl0.l-lmg，檸檬酸鈉l-10mg，IGEPAL0.1-1ii1，RNaseA0.05-0.5mg，SYTOX0.25-1iimol，以去離子水配制。③裂解液II溶液每毫升溶液中含有蔗糖85.6-171.2mg，檸檬酸15_25mg，SYTOX0.25-1iimol，以去離子水配制。2.細胞培養(yǎng)腺病毒-12/SV40病毒永生化的人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)。在37。C、5XC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞每周傳代一次，傳代后三天換液。3.細胞染毒接種6孔板，設(shè)對照組、染毒組，每組設(shè)3平行試驗，處理組染毒劑量不能過高，保證細胞存活率^40%。4.細胞處理取5X1()S個細胞于15ml聚丙烯離心管中，離心(600Xg，5min)，棄上清，輕打重懸細胞。加入300ii1EMA染液，浸入碎冰(深度約2cm)，可見光源(熒光燈40-60W)照射細胞懸浮液(光源離液面約10-15cm)，持續(xù)30min。光激活結(jié)束后，加入3ml2%胎牛血清液(4t:預(yù)冷)，以錫箔紙包裹管子避光。上述溶液離心(600Xg，5min)，棄上清(約50yl上清液保留)，輕打重懸細胞(30min內(nèi)進行下一步操作)。于室溫下，慢速(2-3sec)加入500iU裂解液I，迅速渦旋(5sec，中速)，室溫放置lh。用力打入500iil裂解液II，渦旋(5sec，中速)，室溫放置30min后，離心(2500Xg，15min)后，棄上清，沉淀顆粒經(jīng)PBS重懸后，流式細胞儀檢測或于4t:冰箱保存(上述細胞收集、染色、裂解步驟須于l天內(nèi)完成，上機前樣品可于4t:放置2天不影響檢測)。5.流失細胞儀激發(fā)光、發(fā)射光參數(shù)設(shè)置激發(fā)光488mm發(fā)射光SYTOX-熒光-FL1channel(530/30band-passfilter)EMA-associate熒光-FL3channel(670long~passfilter)6.流失細胞儀散點圖門的設(shè)置采用流式細胞儀檢測后設(shè)置不同的門，須滿足六個門(見圖3-8)，從而篩選健康細胞的細胞核及產(chǎn)生的微核。以前向角(FSC-H)和側(cè)向角(SSC-H)為橫、縱坐標作圖(見圖3)。FSC-H和細胞顆粒度大小密切相關(guān)，用來檢測細胞的大小，通常將其設(shè)為閾值來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒物質(zhì)對被測細胞的干擾。FSC-H反映顆粒大小及分布形態(tài)，SSC-H反映顆粒物內(nèi)容物對激發(fā)光的折射，因此可用于反映細胞內(nèi)的精細結(jié)構(gòu)等。細胞核顆粒物的FSC-H與SSC-H成一定比例，低于該比例則為非核物質(zhì)(即為Rl門設(shè)置)。以SYTOX熒光強度為橫坐標，細胞計數(shù)為縱坐標作圖(見圖4)，用以觀察細胞生長狀態(tài)，雙峰處代表有G1、S、G2/M期細胞，以觀測染毒前后處于何種狀態(tài)。雙峰較易分開，且G2/M期細胞較少，細胞處于非分裂期，以指數(shù)生長期細胞進行染毒，保證結(jié)果的可靠性。顆粒寬度(FL1-W)為橫坐標，顆粒表面積為縱坐標作圖(見圖5)。細胞核物質(zhì)上述兩種參數(shù)呈比例。設(shè)置R3門，剔除不符合該比例的顆粒(二聚體細胞核或非核物質(zhì))。經(jīng)Rl及R2篩選后，剔除非核物質(zhì)，R3、R4及R5研究對象均為Rl與R2共同設(shè)門后的交集。以SYTOX熒光值為橫坐標均，分別以FSC-H及SSC-H為縱坐標作圖(見圖6，圖7)。細胞核SYTOX熒光值與FSC-H及SSC-H均呈線性比例，由R3及R4的設(shè)置，可剔除細胞核和熒光強度非線性顆粒，如芽孢類細胞核顆粒，從而保證微核計數(shù)的均一性。以EMA熒光值(圖中FL3-H)為橫坐標，SYTOX熒光值(圖中FL1-H)為縱坐標作圖(見圖8)。EMA在細胞裂解前加入，常用于凋亡中后期及壞死細胞核染色。EMA陽性粒子代表死亡細胞核或凋亡小體。設(shè)置R5門剔除上述兩種細胞核顆粒的干擾。R3、R4及R5門篩選后的交集用于微核計數(shù)。圖9中橫坐標為SYTOX熒光值，縱坐標為前向角，由此分為兩個集群，右上為細胞核質(zhì)，左下為微核。7.檢測結(jié)果處理R6和R7門內(nèi)顆粒為計算對象<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點如下1.克服了凋亡細胞對微核檢測的影響，降低了假陽性結(jié)果。2.由于采用體外細胞培養(yǎng)，克服了體內(nèi)微核檢測(動物試驗)的不確定性。3.采用6孔板細胞培養(yǎng)，流式細胞儀檢測，可滿足高通量微核檢測要求。4.經(jīng)2500Xg梯度離心，排除了線粒體、非特異性(碎片)顆粒等的干擾。因此本發(fā)明提高了檢測方法的敏感性，實驗結(jié)果的準確性，客觀性以及可靠性c圖1::染色質(zhì)染色分類示意2::本發(fā)明的工藝步驟圖。圖3::前向角-側(cè)向角散點圖。圖4::SYTOX染色細胞核柱形5::SYTOX染色細胞核的寬度_面積比例6::SYTOX熒光-前向角散點7::SYTOX熒光-側(cè)向角散點8::EMA-SYTOX熒光散點9::SYTOX熒光-前向角散點圖(對照樣品)圖10:SYTOX熒光-前向角散點圖(染毒樣品)具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合以下實例做進一步描述。實施例1對某一國產(chǎn)烤煙型品牌巻煙A進行評價。巻煙煙氣經(jīng)過有機相(乙酸乙酯)和無機相(去離子水)收集。將兩者合并，并以細胞培養(yǎng)液調(diào)整濃度為l支/ml。經(jīng)0.22ym濾膜無菌過濾，-S(TC保存?zhèn)溆谩＝臃N6孔板細胞(選擇腺病毒-12/SV40病毒永生化的人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)。在371\5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞每周傳代一次，傳代后三天換液。}，經(jīng)染毒處理后(0.002支/ml，2d)，消化并收集細胞。取約5X10s個細胞于15ml規(guī)格的聚丙烯離心管中，離心(600Xg，5min)，棄上清，輕打重懸細胞。加入300ii1EMA染液，浸入碎冰(深度約2cm)，可見光源(熒光燈40W)照射細胞懸浮液(光源離液面約10cm)，持續(xù)30min。光激活結(jié)束后，加入3ml2%胎牛血清液(4t:預(yù)冷)，然后以錫箔紙包裹管子避光。上述溶液離心(600Xg，5min)，棄上清(約50yl上清液保留)，輕打重懸細胞(30min以內(nèi)進行下一步操作)。室溫下，慢速(3sec)加入500ii1裂解液I，迅速渦旋(5sec，中速)，室溫放置lh。用力打入500iU裂解液II，渦旋(5sec)，室溫放置30min后，離心(2500Xg，15min)后，棄上清，沉淀顆粒經(jīng)PBS重懸后，流式細胞儀檢測。某一國產(chǎn)烤煙型品牌巻煙A誘導細胞微核形成率計算結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2對某一國產(chǎn)烤煙型巻煙B進行評價。巻煙煙氣經(jīng)過有機相(乙酸乙酯)和無機相(去離子水)收集。將兩者合并，并以細胞培養(yǎng)液調(diào)整濃度為l支/ml。經(jīng)0.22ym濾膜無菌過濾，-8(TC保存?zhèn)溆谩＝臃N6孔板細胞(選擇腺病毒-12/SV40病毒永生化的人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)。在371\5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞每周傳代一次，傳代后三天換液。}，經(jīng)染毒處理后(0.002支/ml，2d)，消化并收集細胞。取約5X10s個細胞于15ml規(guī)格的聚丙烯離心管中，離心(600Xg，5min)，棄上清，輕打重懸細胞。加入300ii1EMA染液，浸入碎冰(深度約2cm)，可見光源(熒光燈60W)照射細胞懸浮液(光源離液面約15cm)，持續(xù)30min。光激活結(jié)束后，加入3ml2%胎牛血清液(4t:預(yù)冷)，然后以錫箔紙包裹管子避光。上述溶液離心(600Xg，5min)，棄上清(約50yl上清液保留)，輕打重懸細胞(30min以內(nèi)進行下一步操作)。室溫下，慢速(2sec)加入500ii1裂解液I，迅速渦旋(5sec，中速)，室溫放置lh。用力打入500iU裂解液II，渦旋(5sec)，室溫放置30min后，離心(2500Xg，15min)后，棄上清，沉淀顆粒經(jīng)PBS重懸后，流式細胞儀檢測。某一國外混合型品牌巻煙B誘導細胞微核形成率計算結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求一種卷煙煙氣遺傳毒性的體外細胞微核檢測方法，其特征在于以永生化人支氣管上皮細胞為靶細胞，煙氣冷凝物染毒處理，細胞經(jīng)低滲、高滲處理，并經(jīng)兩種熒光探針染色，流式細胞儀分析。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的體外細胞微核檢測方法，其特征在于具體步驟包括指數(shù)生長期細胞，煙氣冷凝物染毒處理，收集細胞進行處理，經(jīng)EMA探針染色，洗滌后，低滲溶液膨脹細胞，并對細胞膜打孔處理，RNaseA水解RNA，SYT0X與DNA結(jié)合，加入高滲溶液，破碎細胞膜，釋放細胞核，SYTOX與DNA結(jié)合，梯度離心(2500Xg，15min)后，進行流式細胞儀分析。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的體外細胞微核檢測方法，其特征在于細胞處理過程如下取5X105個細胞于15ml聚丙烯離心管中，離心，棄上清，輕打重懸細胞，加入300ylEMA染液，浸入碎冰，可見光源照射細胞懸浮液，持續(xù)30min，光激活結(jié)束后，加入3ml2%胎牛血清液，以錫箔紙包裹管子避光，上述溶液離心，棄上清，輕打重懸細胞；于室溫下，慢速加入500ii1裂解液I，迅速渦旋，室溫放置lh;用力打入500ii1裂解液II，渦旋，室溫放置30min后，離心后，棄上清，沉淀顆粒經(jīng)PBS重懸后，流式細胞儀檢測。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外細胞微核檢測方法，其特征在于裂解液I溶液每毫升溶液中含有氯化鈉0.l-lmg，檸檬酸鈉l-10mg，IGEPAL0.1-1yl，RNaseA0.05-0.5mg，SYTOX0.25-liimol，以去離子水配制。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外細胞微核檢測方法，其特征在于裂解液II溶液每毫升溶液中含有蔗糖85.6-171.2mg，檸檬酸15-25mg，SYTOX0.25—1ymol，以去離子水配制。全文摘要一種卷煙煙氣遺傳毒性的體外細胞微核檢測方法，其特征在于以永生化人支氣管上皮細胞為靶細胞，煙氣冷凝物染毒處理，細胞經(jīng)低滲、高滲處理，并經(jīng)兩種熒光探針染色，流式細胞儀分析。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點如下1.克服了凋亡細胞對微核檢測的影響，降低了假陽性結(jié)果。2.由于采用體外細胞培養(yǎng)，克服了體內(nèi)微核檢測(動物試驗)的不確定性。3.采用6孔板細胞培養(yǎng)，流式細胞儀檢測，可滿足高通量微核檢測要求。4.經(jīng)2500×g梯度離心，排除了線粒體、非特異性(碎片)顆粒等的干擾。因此本發(fā)明提高了檢測方法的敏感性，實驗結(jié)果的準確性，客觀性以及可靠性。文檔編號C12Q1/68GK101709329SQ200910172698公開日2010年5月19日申請日期2009年11月25日優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日發(fā)明者劉興余,朱茂祥,楊陟華,潘秀頡,謝劍平申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院