專利名稱：重組Ⅱ型限制性內(nèi)切核酸酶MmeI和相關(guān)內(nèi)切核酸酶以及制備這些酶的方法
本申請(qǐng)是分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2003年7月10日、申請(qǐng)?zhí)枮?3816564.3(PCT/US2003/021570)、發(fā)明名稱為“重組II型限制性內(nèi)切核酸酶MmeI和相關(guān)內(nèi)切核酸酶以及制備這些酶的方法”。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及DNA(脫氧核糖核酸)片段，該片段編碼具有兩種相關(guān)的酶功能的多肽，一個(gè)酶功能是識(shí)別DNA序列5’-TCC(Pu)AC-3’并且剪切位于這個(gè)識(shí)別序列3’端第20和第21個(gè)殘基之間的磷酸二酯鍵以及互補(bǔ)鏈上的識(shí)別序列5’-GT(Py)GGT-3’的5’端第18和19個(gè)殘基之間的磷酸二酯鍵，從而產(chǎn)生具有兩個(gè)堿基的3’粘末端(以下稱為MmeI限制性內(nèi)切酶)，而第二個(gè)酶活性是識(shí)別同樣的DNA序列，5’-TCC(Pu)AC-3’，但是通過增加一個(gè)甲基來(lái)修飾這段序列以防止內(nèi)切酶MmeI的剪切。本發(fā)明還涉及含有該DNA片段的載體、含有該DNA片段的轉(zhuǎn)化宿主，以及從這樣的轉(zhuǎn)化宿主中制備出MmeI限制性內(nèi)切酶的改進(jìn)的方法。本發(fā)明還涉及鑒定編碼具有和MmeI同樣特性但卻很可能具有獨(dú)特的DNA識(shí)別序列的酶的其它DNA片段的方法。這個(gè)方法依賴于本申請(qǐng)中所提出的MmeI酶的氨基酸序列的使用，或者由此依賴于通過這個(gè)方法鑒定出來(lái)的別的序列。本發(fā)明還涉及可以通過所述的該方法鑒定出來(lái)的其它的DNA片段，這些片段中的每一個(gè)都編碼與MmeI多肽具有顯著的氨基酸序列相似性的多肽。由這些DNA片段編碼的多肽被預(yù)測(cè)表現(xiàn)出和MmeI相似的功能。特別地，這些多肽被預(yù)測(cè)具有雙重的酶學(xué)功能在離特異性識(shí)別序列相對(duì)遠(yuǎn)的距離處以特異性的方式剪切DNA，而又修飾它們的識(shí)別序列以防止宿主DNA由于內(nèi)切酶活性而被剪切。通過這種方法鑒定出來(lái)的酶的一個(gè)實(shí)例是CstMI(參見申請(qǐng)序列號(hào)為10/616,689的美國(guó)專利申請(qǐng)，其與本申請(qǐng)同時(shí)提交)。CstMI由于其與MmeI高度顯著的氨基酸序列相似性而被認(rèn)為是一種潛在的內(nèi)切酶。CstMI識(shí)別序列5’-AAGGAG-3’，并剪切位于該識(shí)別序列3’端第20和第21個(gè)殘基之間的磷酸二酯鍵以及互補(bǔ)鏈上識(shí)別序列5’-CTCCTT-3’的5’端第18和19個(gè)殘基之間的磷酸二酯鍵，由此產(chǎn)生具有兩個(gè)堿基的3’粘末端。
限制性內(nèi)切酶是一類自然存在于原核生物中的酶。已知的限制性酶切系統(tǒng)有好幾種，其中II型內(nèi)切酶是在遺傳工程中非常有用的一類。當(dāng)這些II型內(nèi)切酶與原核生物中的其它雜質(zhì)組分分開而被純化出來(lái)以后，就可以在實(shí)驗(yàn)室中用來(lái)將DNA分子打斷成準(zhǔn)確的片段。這種特性使得DNA分子可以被特定地鑒定出來(lái)并且被分到它們的組成基因中。限制性內(nèi)切酶已經(jīng)被證明是現(xiàn)代遺傳學(xué)研究中不可或缺的工具。它們是生物化學(xué)上的“剪刀”，通過它們遺傳工程和分析得以進(jìn)行。
限制性內(nèi)切酶通過識(shí)別并結(jié)合到DNA分子上特定的核苷酸序列(“識(shí)別序列”)而起作用。一旦結(jié)合到DNA序列上，II型內(nèi)切酶就在這段序列的內(nèi)部或者是一側(cè)剪切核酸分子。不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)不同的識(shí)別序列具有親和性。大多數(shù)限制性內(nèi)切酶識(shí)別的序列長(zhǎng)度為4到6個(gè)核苷酸，雖然最近也有少數(shù)識(shí)別7或8個(gè)特異核苷酸的限制性內(nèi)切酶已經(jīng)被分離出來(lái)。絕大多數(shù)識(shí)別序列都含有一對(duì)對(duì)稱軸，而且在絕大多數(shù)情況下所有的核苷酸都是獨(dú)特地確定的。然而，有些限制性內(nèi)切酶具有簡(jiǎn)并或者不嚴(yán)格的特異性，因?yàn)樗鼈冊(cè)谒鼈兊淖R(shí)別序列中一個(gè)或者多個(gè)位置處識(shí)別多種堿基，而且有的限制性內(nèi)切酶識(shí)別非對(duì)稱的序列。HaeIII識(shí)別的序列是5’-GGCC-3’，這是具有對(duì)稱性、非簡(jiǎn)并識(shí)別序列的一個(gè)實(shí)例；HaeII識(shí)別的序列是5’-(Pu)GCGC(Py)-3’，這是典型的具有簡(jiǎn)并的或者不嚴(yán)格的識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶；而BspMI識(shí)別的序列為5’-ACCTGC-3’，這是典型的具有非對(duì)稱識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶。具有對(duì)稱性識(shí)別序列的II型內(nèi)切酶一般對(duì)稱地在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部或者與之相鄰的位置剪切，而那些識(shí)別非對(duì)稱序列的限制性內(nèi)切酶往往在距離識(shí)別位點(diǎn)一端1到20個(gè)堿基范圍內(nèi)剪切。本申請(qǐng)的酶MmeI(還有CstMI)具有的特性就是在距離所有已知的II型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列最遠(yuǎn)的位置剪切DNA。目前有多于200種獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶在幾千種已經(jīng)研究過的細(xì)菌物種中被鑒定出來(lái)。
限制性系統(tǒng)的另一個(gè)組分是甲基化修飾酶。這些酶與限制性內(nèi)切酶互補(bǔ)，它們?yōu)榧?xì)菌提供可以保護(hù)自身的DNA并與外源侵染的DNA區(qū)分開來(lái)的手段。甲基化修飾酶識(shí)別并結(jié)合到與對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶同樣的識(shí)別序列上，但它們不是打斷DNA，而是通過添加甲基基團(tuán)來(lái)化學(xué)修飾序列中的一個(gè)或者其它的核苷酸。甲基化之后，識(shí)別序列便不再會(huì)被限制性內(nèi)切酶剪切。細(xì)菌細(xì)胞的DNA借助它的甲基化修飾酶的活性而被修飾，因而它對(duì)內(nèi)源限制性內(nèi)切酶的存在變得不敏感。只有未被修飾因而也就被認(rèn)為是外源的DNA才對(duì)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和剪切敏感。甲基轉(zhuǎn)移修飾酶常常是不同于它們的同源內(nèi)切酶伴侶的另外一種酶。在某些情況下，一種單個(gè)的多肽同時(shí)具有甲基轉(zhuǎn)移修飾酶和內(nèi)切酶的功能，比如Eco57I。在這樣的情況下，會(huì)有另外一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶存在并作為限制-修飾系統(tǒng)的一部分。相反，本申請(qǐng)中的MmeI系統(tǒng)沒有另外的甲基轉(zhuǎn)移酶與內(nèi)切酶-甲基轉(zhuǎn)移酶多肽相伴。
內(nèi)切酶的命名是根據(jù)它們來(lái)源的細(xì)菌而制定的。因此，比如嗜血桿菌(Haemophilus ageyptius)合成三種不同的限制性內(nèi)切酶，它們就會(huì)被命名為HaeI、HaeII和HaeIII。這些酶識(shí)別和剪切的序列分別為5’-(W)GGCC(W)-3’、5’-(Pu)GCGC(Py)-3’和5’-GGCC-3’。另一方面，大腸桿菌(Escherichia coli)RY13只合成一種內(nèi)切酶EcoRI，它識(shí)別的序列是5’-GAATTC-3’。
雖然并不想受到理論的約束，但是一般認(rèn)為在自然界中，限制性內(nèi)切酶在細(xì)菌細(xì)胞的保障系統(tǒng)中起著保護(hù)性作用。它們可以使細(xì)菌能夠抵抗外源DNA分子比如病毒或者質(zhì)粒的侵染，不然這些分子可能會(huì)破壞或者寄生于細(xì)胞。它們是通過識(shí)別侵染DNA分子中出現(xiàn)的識(shí)別序列并在這些位置剪切DNA而達(dá)到抵抗的目的。由此產(chǎn)生的這種瓦解使得很多侵染性的基因失活，而且促使這些DNA易于進(jìn)一步被外切酶降解。
已經(jīng)有多于3000種限制性內(nèi)切酶從各種細(xì)菌株系中被分離出來(lái)。其中超過240種是識(shí)別獨(dú)特的序列，而其他種類的內(nèi)切酶則分享共同的識(shí)別特異性。識(shí)別同樣的核苷酸序列的限制性內(nèi)切酶被稱為“同裂酶(isoschizomer)”。雖然同裂酶的識(shí)別序列是一樣的，但是它們的剪切位點(diǎn)卻有可能會(huì)不同(比如XmaI和SmaI，Endow等，J.Mol.Biol.112521(1977)；Waalwijk等，Nucleic Acids Res.53231(1978))，并且在不同位點(diǎn)的剪切速率也會(huì)有所不同(XhoI和PaeR7I，Gingeras等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80402(1983))。
限制性內(nèi)切酶?jìng)鹘y(tǒng)地被分成三個(gè)主要的大類I型、II型和III型。I型限制性系統(tǒng)召集多種肽構(gòu)成復(fù)合物，其由限制性多肽、修飾性多肽和特異性或者DNA識(shí)別多肽組成。I型系統(tǒng)需要二價(jià)陽(yáng)離子、ATP和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為輔助因子。I型系統(tǒng)剪切DNA的位置隨機(jī)，最遠(yuǎn)可以在距離它們的特異性識(shí)別位點(diǎn)幾千個(gè)堿基對(duì)的位置。III型系統(tǒng)一般識(shí)別非對(duì)稱的DNA序列，而剪切則發(fā)生在距離識(shí)別序列一側(cè)20到30個(gè)堿基對(duì)的特異性位置。這樣的系統(tǒng)需要ATP作為輔助因子，同時(shí)也需要SAM和二價(jià)陽(yáng)離子。III型系統(tǒng)是由內(nèi)切酶多肽和修飾性多肽構(gòu)成的復(fù)合體組成，這樣它便可以修飾識(shí)別序列處的DNA或者剪切DNA。由于它們的修飾活性和剪切活性之間的競(jìng)爭(zhēng)，III型系統(tǒng)產(chǎn)生的是部分消化的DNA底物，因此也沒有在遺傳操作中被使用。
MmeI的DNA剪切活性不需要ATP，而且它剪切完全；因此它可以被歸為一種II型內(nèi)切酶。盡管如此，與其他II型內(nèi)切酶所不同的是，MmeI由一條結(jié)合了內(nèi)切酶和修飾活性的單個(gè)多肽組成，這使得它自身就足可以形成完整的限制-修飾系統(tǒng)。MmeI也是所有II型內(nèi)切酶中在距離特異性DNA識(shí)別序列的最遠(yuǎn)處進(jìn)行剪切的(本申請(qǐng)的CstMI也是如此)。MmeI相當(dāng)大，似乎三個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域整合在一段多肽中。這些結(jié)構(gòu)域由氨基末端結(jié)構(gòu)域、DNA修飾結(jié)構(gòu)域和羧基末端結(jié)構(gòu)域組成；氨基末端結(jié)構(gòu)域包含內(nèi)切酶DNA剪切基序(motif)，也參與DNA識(shí)別，DNA修飾結(jié)構(gòu)域與γ類N6mA甲基轉(zhuǎn)移酶最相似，羧基末端結(jié)構(gòu)域被推測(cè)參與二聚體的形成和并可能參與DNA識(shí)別。這種酶的剪切和修飾活性都需要SAM。單個(gè)MmeI多肽足可以在體內(nèi)條件下修飾攜帶基因的質(zhì)粒載體以使得在體外條件下免受MmeI的剪切，而在使用含有Mg++和SAM的內(nèi)切酶緩沖液時(shí)它也可以在體外條件下剪切沒有修飾的DNA。
對(duì)于新的II型限制性內(nèi)切酶的需要一直在持續(xù)不斷。雖然目前已經(jīng)有識(shí)別大量特異性核苷酸序列的II型限制性內(nèi)切酶可以利用，但是識(shí)別新的序列的新的限制性內(nèi)切酶對(duì)遺傳操作會(huì)提供更多的機(jī)會(huì)和能力；每一個(gè)新的獨(dú)特的內(nèi)切酶都可以使科學(xué)家利用這種內(nèi)切酶提供的所有機(jī)會(huì)來(lái)準(zhǔn)確地在DNA分子內(nèi)新的位置剪切DNA。
發(fā)明概述 根據(jù)本發(fā)明，提供了編碼新型的限制性內(nèi)切酶的新的DNA片段，這個(gè)片段可以從嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌(Methylophilus methylotrophus)(NEB#1190)中獲得。因此這種內(nèi)切酶被命名為“MmeI”，這種內(nèi)切酶 (1)識(shí)別雙鏈DNA分子中的簡(jiǎn)并核苷酸序列，如下所示 5’-TCC(Pu)AC-3’ 3’-AGG(Py)TG-5’ (其中G代表鳥嘌呤，C代表胞嘧啶，A代表腺嘌呤，T代表胸腺嘧啶，(Pu)代表一種嘌呤，A或者G，而(Py)代表一種嘧啶，C或者T)；(2)在識(shí)別序列5’-TCC(Pu)AC-3’的3’側(cè)第20個(gè)核苷酸位置后面的磷酸二酯健處和在互補(bǔ)鏈上識(shí)別序列5’-GT(Py)GGA-3’的5’側(cè)第18個(gè)核苷酸位置前面的磷酸二酯鍵處剪切DNA，產(chǎn)生一個(gè)伸出兩個(gè)堿基的3’端 5’-TCC(Pu)AC(N20)-3’ 3’-AGG(Py)TG(N18)-5’； (3)在體內(nèi)條件下使(1)中指出的識(shí)別序列甲基化以保護(hù)宿主DNA免受內(nèi)切酶MmeI活性造成的剪切。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及其它的DNA片段，這些片段中的每一個(gè)都被鑒定出編碼具有與MmeI限制-修飾多肽顯著的序列相似性的多肽。編碼MmeI多肽的DNA片段使得這些其它的潛在的內(nèi)切酶可以被鑒定出來(lái)，其中利用程序如BLAST(Altschul等，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))在數(shù)據(jù)庫(kù)例如GENBANK可獲得的序列中進(jìn)行MmeI序列的相似性搜索。這些DNA片段以及其它的將會(huì)在以后提交到數(shù)據(jù)庫(kù)中的具有與MmeI這樣的相似性的片段，都是可以編碼與MmeI類似的多肽的候選者，這些被編碼的多肽同時(shí)作為限制性內(nèi)切酶和甲基轉(zhuǎn)移酶。類似于MmeI，這些多肽可以在距離識(shí)別序列類似遠(yuǎn)的位置處剪切DNA，范圍是18到20個(gè)核苷酸或者更長(zhǎng)，這種特性是獨(dú)特的而且在某些分子生物學(xué)技術(shù)中是有用的。特別地，這些多肽含有在N6mADNA甲基轉(zhuǎn)移酶中普遍的氨基酸基序，具有在限制性內(nèi)切酶中普遍的并且位于多肽氨基末端部分的基序，這個(gè)基序由氨基酸D/E(X8～X12)D/EXK組成，而且這些多肽在保守的甲基轉(zhuǎn)移酶基序之后還具有一個(gè)由數(shù)百個(gè)氨基酸組成的區(qū)域，它與MmeI的相應(yīng)區(qū)域具有顯著的相似性，這個(gè)區(qū)域被認(rèn)為在二聚體化中起作用，也有可能是一個(gè)DNA序列識(shí)別結(jié)構(gòu)域。這樣的多肽的一個(gè)例子就是CstMI。已經(jīng)表明CstMI識(shí)別6個(gè)堿基對(duì)的非對(duì)稱序列5’-AAGGAG-3’，剪切DNA的方式和MmeI一樣5’-AAGGAGN20/N18-3’。由這些DNA片段編碼的內(nèi)切酶可以通過如下所述的用于MmeI的方法來(lái)制備。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶MmeI的方法。這個(gè)方法包括培養(yǎng)含有編碼MmeI限制性系統(tǒng)多肽的DNA片段的轉(zhuǎn)化宿主，比如大腸桿菌，收集培養(yǎng)的細(xì)胞，從中獲得無(wú)細(xì)胞抽提物(cell-free extract)，并從所述無(wú)細(xì)胞抽提物中分離和收集限制性內(nèi)切酶MmeI。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)由被鑒定為與MmeI同源的DNA序列編碼的限制性內(nèi)切酶的方法。這個(gè)方法包括培養(yǎng)含有編碼這些限制性系統(tǒng)的基因的轉(zhuǎn)化宿主，比如大腸桿菌，收集培養(yǎng)的細(xì)胞，從中獲得無(wú)細(xì)胞抽提物，并從所述無(wú)細(xì)胞抽提物中分離和收集限制性內(nèi)切酶。



圖1-顯示了MmeI剪切Lamda、T7、phiX174、pBR322和pUC19 DNA的瓊脂糖凝膠。
圖2-MmeI基因座的DNA序列(SEQ ID NO1)。
圖3-MmeI基因座的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖4-顯示了MmeI剪切pTBMmeI.1DNA和未修飾DNA底物的瓊脂糖凝膠。
圖5-顯示了MmeI剪切非甲基化、半甲基化和全甲基化的DNA底物的瓊脂糖凝膠。
圖6-將帶標(biāo)記的甲基整合到未甲基化、半甲基化和全甲基化的DNA底物中。
圖7-MmeI氨基酸序列(SEQ ID NO3到SEQ ID NO14)和來(lái)自于公共數(shù)據(jù)庫(kù)的同源多肽之間的多序列比對(duì)。
發(fā)明詳述 本發(fā)明的內(nèi)切酶的識(shí)別序列和剪切位點(diǎn)在以前已有過描述(Boyd，Nucleic Acids Res.145255-5274(1986))。然而，MmeI酶被證明從天然宿主嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌中的生產(chǎn)是困難的，這是由于這種酶的低產(chǎn)率以及嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌宿主相對(duì)比較難以大量培養(yǎng)。為了克服生產(chǎn)MmeI的這些限制，本申請(qǐng)描述了編碼MmeI基因的DNA序列的鑒定，以及在合適的宿主——在本例中是大腸桿菌——中MmeI基因的表達(dá)。對(duì)編碼MmeI的DNA片段的這種操作導(dǎo)致每克細(xì)胞所生產(chǎn)的酶的量的顯著增加以及含有MmeI酶的大量細(xì)胞的生長(zhǎng)的顯著增加。
被克隆技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員經(jīng)常采用的數(shù)種標(biāo)準(zhǔn)方法曾被應(yīng)用于克隆MmeI，結(jié)果都沒有獲得成功。特別地，甲基化酶選擇方法(Wilson等，美國(guó)專利號(hào)5,200,333)也沒有試驗(yàn)成功。嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌DNA的數(shù)個(gè)隨機(jī)文庫(kù)已在大腸桿菌中被建立起來(lái)，并且經(jīng)歷了MmeI消化的考驗(yàn)，但是沒有獲得含有MmeI甲基化酶的克隆。
還嘗試了另一種方法，但仍然失敗了。在這種方法中，特異地針對(duì)N6mA的抗體被用于篩選在lamda噬菌體替換型載體中構(gòu)建的隨機(jī)克隆文庫(kù)。這種方法成功地獲得了甲基化酶的陽(yáng)性克隆，但是所有的克隆經(jīng)過驗(yàn)證之后都發(fā)現(xiàn)是在嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌中表達(dá)另外一個(gè)限制性系統(tǒng)的甲基轉(zhuǎn)移酶，MmeII甲基化酶(識(shí)別序列為5’-GATC-3’)，而不是所要的MmeI甲基化酶活性。
成功獲得所需要的編碼MmeI限制性系統(tǒng)的DNA片段的方法包括數(shù)個(gè)步驟。首先，一種新的純化程序被發(fā)展出來(lái)以從嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌中純化出同質(zhì)的內(nèi)切酶MmeI肽。一旦成功地獲得了顯著量的這種超純的內(nèi)切酶MmeI多肽，氨基端的氨基酸序列和內(nèi)部溴化氰降解肽的氨基酸序列就可以被確定。利用所獲得的氨基酸序列，互補(bǔ)于編碼該氨基酸序列的DNA的簡(jiǎn)并DNA引物就可以被合成出來(lái)，并用于PCR擴(kuò)增MmeI基因的一部分。這部分MmeI基因的DNA序列被測(cè)定。然后整個(gè)MmeI內(nèi)切酶基因及其周圍DNA序列可以通過應(yīng)用反向PCR技術(shù)獲得。與獲得的DNA序列匹配的大量引物被設(shè)計(jì)、合成出來(lái)，并與大量不同的模板組合使用。反向PCR的模板是通過用各種限制性內(nèi)切酶消化嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌基因組DNA，然后再將這些切開的嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌DNA在低濃度下連接以獲得環(huán)狀的分子而獲得的。不同的引物嘗試與不同的模板組合，以便找到能夠產(chǎn)生特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的引物-模板組合。將這樣得到的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。一旦編碼整個(gè)內(nèi)切酶MmeI基因的DNA序列被獲得，就可以設(shè)計(jì)引物從嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌基因組DNA中特異性地?cái)U(kuò)增該基因。擴(kuò)增后的基因被插入到一個(gè)表達(dá)載體中，再克隆到大腸桿菌宿主中。宿主經(jīng)測(cè)試發(fā)現(xiàn)表達(dá)內(nèi)切酶MmeI活性和在體內(nèi)條件下修飾重組表達(dá)載體使得載體在體外條件下不被內(nèi)切酶MmeI活性剪切。
編碼內(nèi)切酶MmeI的單個(gè)多肽也在體內(nèi)條件下提供抵抗MmeI的保護(hù)這個(gè)發(fā)現(xiàn)與以前發(fā)表的關(guān)于MmeI的信息(Tucholski，Gene223293-302(1998))形成對(duì)比。特別地，這篇文獻(xiàn)教導(dǎo)內(nèi)切酶MmeI多肽不提供抵抗內(nèi)切酶MmeI剪切的保護(hù)。這篇文獻(xiàn)報(bào)道為了修飾兩條鏈上的MmeI位點(diǎn)并由此阻止內(nèi)切酶MmeI的剪切需要一個(gè)獨(dú)立的48kD的甲基轉(zhuǎn)移酶。特別地，該文獻(xiàn)教導(dǎo)內(nèi)切酶MmeI多肽只修飾識(shí)別序列上鏈(top strand)5’-TCCRAC-3’中的腺嘌呤，而這種被修飾的DNA會(huì)被內(nèi)切酶MmeI剪切。本發(fā)明的DNA片段編碼內(nèi)切酶MmeI基因，當(dāng)它單獨(dú)在大腸桿菌宿主中生長(zhǎng)的時(shí)候，可導(dǎo)致含有該內(nèi)切酶MmeI的載體產(chǎn)生對(duì)純化的內(nèi)切酶MmeI的抗性。進(jìn)一步，由這個(gè)片段產(chǎn)生的內(nèi)切酶MmeI不剪切在上鏈5’TCCRAC-3’的腺嘌呤處有修飾而在反鏈或者下鏈(bottom strand)中都沒有修飾存在的DNA片段。這個(gè)結(jié)果與Tucholski的文獻(xiàn)中的教導(dǎo)相反。另外，本申請(qǐng)的內(nèi)切酶MmeI不剪切其下鏈5’-GTYGGA-3’中的腺嘌呤殘基被修飾的DNA片斷，這也與Tucholski的文獻(xiàn)中的教導(dǎo)相反。當(dāng)上鏈和下鏈中腺嘌呤殘基都被修飾時(shí)，內(nèi)切酶MmeI不剪切該DNA。在該內(nèi)切酶MmeI基因附近沒有發(fā)現(xiàn)如Tucholski的文獻(xiàn)中所報(bào)道的另一種甲基轉(zhuǎn)移酶基因。在緊接著該內(nèi)切酶MmeI基因的3’端的位置有一個(gè)開放閱讀框，它所編碼的蛋白的大小接近于所報(bào)道的第二甲基轉(zhuǎn)移酶活性蛋白(48kD)。然而，這條潛在的多肽不具有在甲基轉(zhuǎn)移酶中發(fā)現(xiàn)的氨基酸基序，而且在克隆進(jìn)大腸桿菌后也不會(huì)提供抵抗內(nèi)切酶MmeI的保護(hù)作用。雖然Tucholski的文獻(xiàn)教導(dǎo)第二甲基轉(zhuǎn)移酶多肽在保護(hù)宿主細(xì)胞免受內(nèi)切酶MmeI活性影響中的必要性，但本申請(qǐng)表明編碼內(nèi)切酶MmeI多肽的DNA片段足可以提供這種保護(hù)作用。另外，在此所述的編碼與MmeI相似的氨基酸序列的11個(gè)DNA片段兩側(cè)都沒有可識(shí)別到的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因。這表明這些多肽本身也極有可能提供對(duì)宿主DNA的保護(hù)作用和對(duì)未修飾DNA底物的內(nèi)切酶活性，而不需要?jiǎng)e的甲基轉(zhuǎn)移酶作為該限制性修飾系統(tǒng)的一部分。這與其它的II型限制性修飾系統(tǒng)形成對(duì)比。
同一研究組(Tucholski，Gene 223293-302(1998)和Anna Podhajska，私人交流)之前報(bào)道過單個(gè)內(nèi)部溴化氰消化片段的8個(gè)殘基的氨基酸序列(序列GRGRGVGV(SEQ ID NO50))?；谶@段序列的PCR被嘗試，然而失敗了。在根據(jù)本發(fā)明確定了真實(shí)的MmeI氨基酸序列之后，發(fā)現(xiàn)上述序列與MemI沒有關(guān)系。因此，使得MmeI基因得以克隆的內(nèi)部氨基酸序列的正確測(cè)定依賴于本申請(qǐng)中描述的新的純化方法，其中可以生產(chǎn)出足夠量的足夠純的MmeI以便確定溴化氰消化的內(nèi)部片段氨基酸序列，如在本申請(qǐng)中所實(shí)施的。
在實(shí)施例II中，我們通過培養(yǎng)帶有MmeI基因的轉(zhuǎn)化宿主，比如攜帶pTBMmeI.1的大腸桿菌ER2683，并從這些細(xì)胞中回收內(nèi)切酶來(lái)獲得MmeI。攜帶有pTBMmeI.1的大腸桿菌ER2683樣品(NEB#1457)已經(jīng)在布達(dá)佩斯條約的條款和條件下于2002年7月3日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，其相應(yīng)的專利注冊(cè)號(hào)(the Patent AccessionNo.)是PTA-4521。
為了回收本發(fā)明的酶，攜帶有pTBMmeI.1的大腸桿菌(NEB#1457)可以使用任何合適的技術(shù)來(lái)培養(yǎng)。比如，攜帶有pTBMmeI.1的大腸桿菌可以在含有100μg/ml氨芐青霉素的Luria broth培養(yǎng)基中，37℃通風(fēng)有氧培養(yǎng)。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期晚期的細(xì)胞通過加入0.3mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)生長(zhǎng)4個(gè)小時(shí)，離心收集，然后立即破碎細(xì)胞或者于-70℃冷凍保存。
MmeI酶可以通過傳統(tǒng)的蛋白純化技術(shù)從攜帶有pTBMmeI.1的大腸桿菌中分離出來(lái)。比如，可以將細(xì)胞沉積物在緩沖液中重懸，然后再通過超聲、高壓分散或者酶消化來(lái)處理，使得內(nèi)切酶被提取到緩沖溶液中。完整的細(xì)胞和細(xì)胞碎片然后通過離心除去，得到含有MmeI的無(wú)細(xì)胞抽提物。然后，伴隨有其相應(yīng)的內(nèi)源性甲基化酶活性的內(nèi)切酶MmeI通過離子交換層析、親合層析、分子篩層析或者這些方法的組合從無(wú)細(xì)胞抽提物中純化出來(lái)以生產(chǎn)出本發(fā)明的內(nèi)切酶。
本發(fā)明還涉及鑒定其它的DNA片段的方法，其中每個(gè)片段都編碼具有與MmeI多肽顯著的氨基酸序列相似性的多肽。由這些DNA片段編碼的多肽被預(yù)測(cè)執(zhí)行與MmeI相似的功能。特別地，它們被預(yù)測(cè)具有雙重酶功能，既在距離特定識(shí)別序列相對(duì)遠(yuǎn)的位置處以特定的方式剪切DNA，又修飾它們的識(shí)別序列以保護(hù)宿主DNA免受它們的內(nèi)切酶活性的攻擊。一旦內(nèi)切酶MmeI的氨基酸序列根據(jù)本申請(qǐng)中描述的方法被確定出來(lái)，存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列可以與該MmeI序列相比較，從而找出那些與MmeI極為顯著相似的序列。這種方法與美國(guó)專利6,383,770(Roberts等)中描述的方法有些類似，不同的是在這里我們是尋找與內(nèi)切酶MmeI序列的相似性，而不是尋找與甲基轉(zhuǎn)移酶或內(nèi)切酶蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)匹配的序列，然后在潛在的甲基轉(zhuǎn)移酶開放閱讀框的附近檢查沒有被鑒定出的開放閱讀框。在鑒定出MmeI的氨基酸序列之前，編碼與MmeI相關(guān)的蛋白的DNA序列還沒有被包含在Roberts等如上所用的限制性和甲基轉(zhuǎn)移酶基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)中，因?yàn)檫@些序列還沒有聯(lián)系到任何已知的內(nèi)切酶功能上。在此公開的鑒定潛在MmeI樣內(nèi)切酶的方法因此要比美國(guó)專利6,383,770(Roberts等)中的方法更加具有特異性。
在數(shù)據(jù)庫(kù)如GENBANK中對(duì)可獲得的序列進(jìn)行MmeI序列的相似性搜索是利用程序如BLAST(Altschul等.Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))完成的。期望值(expectation value，E)分?jǐn)?shù)低于E＝e-10的序列被認(rèn)為是潛在的內(nèi)切酶候選者。期望值低得更多，比如低于E＝e-30的序列被認(rèn)為極有可能是類似于MmeI的內(nèi)切酶。這些候選MmeI樣肽被進(jìn)一步檢驗(yàn)以確認(rèn)它們是否符合MmeI所表現(xiàn)出來(lái)的結(jié)構(gòu)域組成。一個(gè)真正的候選者將會(huì)含有一個(gè)內(nèi)切酶折疊基序，常常是以(D/E)X8～X12(D/E)XK的形式出現(xiàn)在肽的氨基端部分(Aravind等，Nucleic Acids Res.283417-3432(2000))。一個(gè)真正的候選者將會(huì)在肽的中間部分含有與γ類N6甲基腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶類似的甲基轉(zhuǎn)移酶基序，而且在候選肽的羧基端部分含有與MmeI的羧基端部分相似的序列。這樣的BLAST搜索是在2003年6月12日進(jìn)行的，返回的如下序列與MmeI高度相似
這些蛋白中的大多數(shù)在它們的數(shù)據(jù)庫(kù)記錄中被標(biāo)記為假想(hypothetical)蛋白或者推定的(putative)蛋白。其中有許多似乎是全長(zhǎng)的多肽，比如上面的序列#2GcrY。這些候選蛋白可以按照Roberts描述的方法來(lái)表達(dá)以鑒定期望的內(nèi)切酶活性。一些內(nèi)切酶基因在用于測(cè)序的特定菌株中可能是沒有活性的(Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA982740-2745(2001))。在這樣的情況下，通過修復(fù)導(dǎo)致這些基因失活的突變來(lái)表達(dá)功能性的內(nèi)切酶被證明是可能的。MmeI的數(shù)個(gè)同源物，比如#7(SEQ ID NO14)(耐放射異常球菌(Deinococcus radiodurans)DR2267)和#8(SEQ ID NO13)(耐放射異常球菌DR0119.1)，在它們的開放閱讀框架中都有缺陷。DR2267在MmeI上由密碼子GAG編碼谷氨酸的位置處含有一個(gè)終止密碼子TAG，它可以過早地終止該開放閱讀框架。通過將這個(gè)TAG終止密碼子改變成GAG，則有可能會(huì)重新激活這個(gè)潛在的內(nèi)切酶基因。DR0119.1也是有缺陷的，因?yàn)樗霈F(xiàn)了框架漂移(frameshift)，這使得開放閱讀框架被破壞。通過使DR0119.1序列和MmeI序列之間的相似性最大化，可以將MmeI序列用作指導(dǎo)修復(fù)這種框架漂移的指南。這樣可能會(huì)很好地恢復(fù)DR0119.1內(nèi)切酶的活性。
另外一種產(chǎn)生新的潛在內(nèi)切酶的方法是通過進(jìn)行結(jié)構(gòu)域交換(domain swapping)來(lái)利用它們之間相似的結(jié)構(gòu)域。可以將MmeI蛋白的氨基端結(jié)構(gòu)域與一種MmeI樣肽的氨基端結(jié)構(gòu)域交換，比如將新的潛在基因中直至第一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶基序(基序X，“GlyAla His TyrThr Ser”)的序列與MmeI中直至同一序列的這一部分交換。當(dāng)只能獲得部分的序列或者潛在基因已經(jīng)由于多個(gè)突變而喪失了功能時(shí)，這種方法非常有效。這種方法會(huì)產(chǎn)生一個(gè)嵌合蛋白，這個(gè)蛋白可能具有內(nèi)切酶活性并在距離識(shí)別序列一定距離的位置剪切DNA，就像MmeI一樣，但是它識(shí)別的序列是新的DNA序列。也可能在數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)有的序列雖然與MmeI相比具有高度的相似性，但卻是不完全的序列。比如，上述的序列#11(SEQ ID NO9)(熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens))就是來(lái)自于數(shù)據(jù)庫(kù)中的DNA序列的一個(gè)小片段。為了由這個(gè)序列獲得像MmeI一樣有功能性的內(nèi)切酶，可以用反向PCR或者其他技術(shù)獲得與報(bào)道的片段相鄰的DNA序列，然后用該序列獲得完整的內(nèi)切酶基因。
一旦序列被鑒定出來(lái)，潛在的內(nèi)切酶就可以被表達(dá)并按照Roberts等如上描述的方法鑒定其特征。然而，在這里沒有另外獨(dú)立的甲基轉(zhuǎn)移酶基因與該內(nèi)切酶一起表達(dá)。一旦這樣一個(gè)潛在的內(nèi)切酶被克隆并在合適的宿主比如大腸桿菌中表達(dá)，那么無(wú)細(xì)胞抽提物可以被制備出來(lái)并被分析以檢測(cè)任何內(nèi)切酶活性。這樣一個(gè)內(nèi)切酶分析必須包括這些內(nèi)切酶所需要的輔助因子SAM。一旦發(fā)現(xiàn)有特異性的DNA剪切活性，則識(shí)別序列和剪切位點(diǎn)就可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定(Schildkraut，(1984)在Genet.Eng.(NY)第6卷，(Setlow J.K.，Hollaender，A.Ed.).117-140頁(yè)，Plenum Press，New York.“Screening for and Characterizingrestriction endonuclease.”)。
這樣確定的酶可以通過傳統(tǒng)的蛋白純化技術(shù)從攜帶含有DNA片段的合適載體的大腸桿菌細(xì)胞中分離出來(lái)。例如，細(xì)胞沉積物可以在緩沖液中重懸，然后再通過超聲、高壓分散或者酶消化來(lái)處理，以使內(nèi)切酶被提取到緩沖溶液中。完整的細(xì)胞和細(xì)胞碎片然后通過離心除去，得到含有所述酶的無(wú)細(xì)胞抽提物。所述內(nèi)切酶，伴隨著它對(duì)應(yīng)的內(nèi)源性甲基化酶活性，然后通過離子交換層析、親合層析、分子篩層析或者這些方法的組合從無(wú)細(xì)胞抽提物中純化出來(lái)以生產(chǎn)出本發(fā)明中的內(nèi)切酶。
這些DNA片段以及其它的將會(huì)在以后提交到數(shù)據(jù)庫(kù)中的與MmeI具有這樣的相似性的片段，都被預(yù)測(cè)編碼與MmeI類似的多肽，因?yàn)檫@些被編碼的多肽同時(shí)作為限制性內(nèi)切酶和甲基轉(zhuǎn)移酶。類似于MmeI，這些多肽可以在距離識(shí)別序列類似遠(yuǎn)的位置處剪切DNA，范圍是大約18到20個(gè)核苷酸或者更長(zhǎng)，這種特性是獨(dú)特的而且在某些分子生物學(xué)技術(shù)中是有用的。
根據(jù)這種方法鑒定出來(lái)的這樣的酶的一個(gè)實(shí)例是CstMI(參見序列號(hào)為______美國(guó)專利申請(qǐng)，與本申請(qǐng)同時(shí)提交)。因?yàn)榕cMmeI高度顯著的氨基酸序列相似性，CstMI被確定是一種潛在的內(nèi)切酶。CstMI由上述序列#2(SEQ ID NO8)編碼，這個(gè)序列在用BLAST與MmeI比對(duì)的時(shí)候給出了高度顯著的期望值e-171。CstMI識(shí)別6個(gè)堿基對(duì)的非對(duì)稱序列5’-AAGGAG-3’，而且剪切DNA的方式和MmeI一樣它剪切位于這個(gè)識(shí)別序列3’側(cè)第20和第21個(gè)殘基之間的磷酸二酯鍵，以及互補(bǔ)鏈上的識(shí)別序列5’-CTCCTT-3’的5’側(cè)第18和19個(gè)殘基之間的磷酸二酯鍵，由此產(chǎn)生一個(gè)有兩個(gè)堿基的3’粘末端。
本發(fā)明通過下面的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說明。提供這些實(shí)施例是用來(lái)幫助理解本發(fā)明，而并不作為本發(fā)明的限制。
以上和以下引用的文獻(xiàn)都在此引入作為參考。
實(shí)施例1 內(nèi)切酶MmeI的純化 嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌(NEB#1190)的單個(gè)克隆在1升培養(yǎng)基M(0.08μMCuSO4、0.448μM MnSO4、0.348μM ZnSO4、6.0μM FeCl3、18μM CaCO3、1.6mM MgSO4、9.0mM NaH2PO4、10.9mM K2HPO4、13.6mM(NH4)2SO4)中生長(zhǎng)24個(gè)小時(shí)。使用該培養(yǎng)物接種到100升的培養(yǎng)基M中。這些細(xì)胞在有氧條件下37℃過夜培養(yǎng)直至進(jìn)入穩(wěn)定期。用5份100升的發(fā)酵液收集到752克的濕細(xì)胞沉淀。
將750克嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌細(xì)胞沉淀懸浮在2.25升緩沖液A(20mMTris-HCl(pH 8.0)、50mM NaCl、1.0mM DTT、0.1mM EDTA、5％甘油)中，然后以大約12000psig通過Gaulin勻漿機(jī)，裂解物于13000×G離心40分鐘后收集上清。
將上清溶液加到已經(jīng)用緩沖液A平衡的500ml Heparin Hyper-D柱(Biosepra SA)上。用1升緩沖液A清洗柱子，然后將2升的NaCl濃度梯度為0.05M到1M的緩沖液A加到柱子上并收集分離級(jí)分。對(duì)級(jí)分進(jìn)行MmeI內(nèi)切酶活性的分析在補(bǔ)充有32μM的S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的50μl NEBufferl中與1μg的Lamda DNA(NEB)于37℃溫育15分鐘。MmeI活性是在0.3M到0.4M NaCl之間被洗脫下來(lái)。
含有MmeI活性的Heparin Hyper-D柱分離級(jí)分被匯集到一起，用(不含有NaCl的)緩沖液A稀釋到50mM NaCl濃度，然后上樣到105ml的已經(jīng)用緩沖液A平衡好的Source15Q柱(Amersham Biotech)上。用210ml的緩沖液A清洗柱子，再用1升的NaCl濃度梯度為0.05M到0.7M的緩沖液A加到柱子上進(jìn)行洗脫。級(jí)分被收集，并分析MmeI的內(nèi)切酶活性。MmeI活性在未被結(jié)合的級(jí)分中被發(fā)現(xiàn)。
將Source15Q的匯集物加載到22ml的已經(jīng)用緩沖液A平衡好的AF-Heparin-TSK柱(TosoHaas)上。用44ml的緩沖液A清洗柱子之后，接著用NaCl濃度梯度從0.05M到1M的緩沖液A線性洗脫。各級(jí)分被收集并分析內(nèi)切酶MmeI的活性。MmeI活性在NaCl濃度為0.26M到0.29M之間被洗脫下來(lái)。這些含有活性的級(jí)分被匯集到一起，然后用緩沖液B(20mM NaPO4(pH 7.0)、50mM NaCl、1.0mM DTT、0.1mMEDTA、5％甘油)中透析。
經(jīng)過透析的AF-Heparin-TSK匯集物被加載到已經(jīng)用緩沖液B平衡好的6ml的Resource15 S柱(Amersham Biotech)上。用12ml緩沖液B清洗柱子之后，再用NaCl濃度梯度從0.05M到1M的緩沖液B線性洗脫。各級(jí)分被收集并分析內(nèi)切酶MmeI的活性。MmeI活性在NaCl濃度0.14M和0.17M之間被洗脫下來(lái)。
這樣洗脫下來(lái)的匯集級(jí)分被上樣到已經(jīng)用緩沖液C(20mMTris-HCl，pH 8.0、500mM NaCl、1.0mM DTT、0.1mM EDTA、5％甘油)平衡好的2升的Superdex 75大小分離柱(Amersham Biotech)上。用緩沖液C洗脫出的500ml和1500ml之間的洗脫級(jí)分被收集起來(lái)，然后通過Mme內(nèi)切酶分析進(jìn)行分析，在4-20％梯度膠上進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳，然后再用考馬斯亮蘭對(duì)蛋白質(zhì)染色。在775ml到825ml之間洗脫出的級(jí)分對(duì)應(yīng)于MmeI活性，對(duì)應(yīng)的蛋白條帶是105kDa。這些級(jí)分被匯集在一起，然后用緩沖液D(20mM NaPO4(pH7.0)、50mM NaCl、1mM DTT、5％甘油)進(jìn)行透析。
透析之后的分離級(jí)分被上樣到已經(jīng)用緩沖液D平衡好的CeramicHTP柱(BioRad)上。用32ml緩沖液D清洗之后，再用NaPO4濃度梯度從0.02M到1M的緩沖液D線性洗脫。收集各級(jí)分并分析Mme內(nèi)切酶活性，在4-20％的梯度膠上進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳，然后再用考馬斯亮蘭對(duì)蛋白質(zhì)染色。MmeI在NaPO4濃度為0.26M和0.3M之間被洗脫下來(lái)。含有105kDa的單個(gè)同質(zhì)的蛋白條帶的數(shù)個(gè)級(jí)分中的一部分被用于蛋白質(zhì)測(cè)序。剩下的純化的MmeI級(jí)分被匯集到一起(6ml，濃度為0.36mg/ml)，然后用保存緩沖液(10mM Tris(pH 7.9)、50mMKCl、1mM DTT、0.1mM EDTA、50％甘油)透析。純化后的MmeI酶在-20℃保存。
活性測(cè)定 將1-4μl的樣品加到50μl由1×NEBuffer 1、32μM的S-腺苷-L-甲硫氨酸和1μg的DNA(Lamda、PhiX174或者pUC19DNA)組成的底物溶液中。反應(yīng)在37℃進(jìn)行15分鐘，然后加入20μl終止溶液，用1％瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。
優(yōu)化內(nèi)切酶活性 從嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌中純化出MmeI之后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定DNA剪切的最優(yōu)反應(yīng)條件。發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶活性會(huì)由于反應(yīng)緩沖液中鉀離子的存在而大大增強(qiáng)。反應(yīng)條件從4℃變化到37℃和從5分鐘變化到60分鐘都沒有明顯地改變剪切DNA的量。為了達(dá)到最大程度的剪切，要求酶濃度與DNA位點(diǎn)在化學(xué)計(jì)量上相等或接近。大大過量的酶會(huì)阻斷剪切的發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)被用于重新評(píng)估MmeI的活性和定義可行的內(nèi)切酶單位。
單位定義 一個(gè)單位(one unit)的MmeI被定義為在15分鐘內(nèi)在補(bǔ)充有80μM的S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的NEBuffer 4(20mM Tris-乙酸鹽、10mM乙酸鎂、50mM乙酸鉀、1mM二硫蘇糖醇(在25℃時(shí)pH 7.9))中于37℃完全剪切1μg的PhiX174DNA所需要的用量。
實(shí)施例II MmeI內(nèi)切酶的克隆 1.DNA純化制備嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌的總基因組DNA。5克的沉積細(xì)胞懸浮在20ml的25％蔗糖、0.05M Tris-HCl pH8.0中，其中還加入10ml的0.25M的EDTA，pH8.0。然后加入6ml的溶菌酶溶液(10mg/ml溶菌酶在0.25M的Tris-HCl中，pH8.0)，之后細(xì)胞懸浮液在4℃放置16個(gè)小時(shí)。接著25ml的裂解混合物(1％Triton-X100、0.05M Tris、62mMEDTA，pH8.0)和5ml的10％SDS被加入，然后在37℃放置5分鐘。接著用一倍體積的平衡酚∶氯仿∶異戊醇(50∶48∶2，v/v/v)提取該溶液，回收水相，再用一倍體積的氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)提取兩次。將得到的水溶液用2升的10mM Tris、1mM EDTA，pH8.0的溶液透析四次。透析過的DNA溶液用RNase(100μg/ml)在37℃消化1小時(shí)。加入1/10體積的5M NaCl和0.55個(gè)體積的2-丙醇讓DNA沉淀，并纏繞在玻璃棒上。用70％乙醇簡(jiǎn)單潤(rùn)洗DNA之后，簡(jiǎn)單地進(jìn)行空氣干燥，然后溶解在20ml的TE緩沖液(10mM Tris、1mM EDTA，pH8.0)，濃度至大約500μg/ml，4℃保存。
2.MmeI內(nèi)切酶按照上述實(shí)施例1中描述的方法純化到同質(zhì)。
3.MmeI內(nèi)切酶的氨基酸序列是針對(duì)MmeI多肽的氨基端和數(shù)段內(nèi)部溴化氰消化產(chǎn)物獲得的。對(duì)按照上述實(shí)施例1中描述的方法制備的MmeI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行電泳分析，然后根據(jù)Matsudaira(Matsudaira.J.Biol.Chem.26210035-10038，1987)的程序進(jìn)行電印跡，其中按照已有的描述做了一定的修改(Looney等，Gene 80193-208(1989))。然后用考馬斯亮蘭R-250染膜，將大約105kD的蛋白條帶切下來(lái)，然后在一臺(tái)帶有氣相傳遞的ABI Procise 494Protein/Peptide Sequencer上進(jìn)行有序的降解(Waite-Rees等，J.Bacteriol.1735207-5219(1991))。頭14個(gè)氨基端殘基的氨基酸序列被獲得，如下ALSWNEIRRKAIEF(SEQID NO15)。
MmeI內(nèi)切酶的另外一個(gè)樣品-20μl中有20μg-用溶解在200μl 88％蒸餾甲酸中的2μg溴化氰(Sigma)在室溫于黑暗處處理24個(gè)小時(shí)。這個(gè)反應(yīng)混合物被蒸發(fā)至干，然后重新懸浮在20μl的上樣緩沖液(1.5M Tris-HCl，pH8.5、12％甘油、4％SDS、0.05％Serva Blue G、0.05％酚紅)中，100℃保持5分鐘。這個(gè)樣品在Tris-Tricine系統(tǒng)中的10到20％聚丙烯酰氨梯度凝膠(Invitrogen)上進(jìn)行3個(gè)小時(shí)的電泳，然后再用10mM CAPS緩沖液(10mM 3-[環(huán)己胺基]-1-丙磺酸、10％甲醇、0.05％SDS、0.005％二硫蘇糖醇，用NaOH調(diào)節(jié)pH至11.0)將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Problott，Applied Biosystems Inc.)，轉(zhuǎn)移是在用槽式電轉(zhuǎn)儀(TE52，Hoeffer)在200伏特轉(zhuǎn)移18小時(shí)完成的。用考馬斯亮蘭R-250染膜，觀察到的主要條帶是25kD、14kD、7.5kD和6kD，以及一些更小的條帶。這些被染上的蛋白條帶從膜上被切下來(lái)，然后進(jìn)行漸次降解。這些不是氨基端片斷的片斷是來(lái)自于溴化氰在蛋白內(nèi)甲硫氨酸殘基位置處的剪切，因此其前面應(yīng)該有甲硫氨酸。25kD的肽的前29個(gè)殘基序列為 (M)KISDEFGNYFARIPLKSTXXIXEXNALQ(SEQ ID NO16)。標(biāo)記成X的殘基20、21、23和25是沒有被鑒定出的殘基。14kD片段的前40個(gè)氨基酸殘基序列為 (M)DAKKRRNLGAHYTSEANILKLIKPLLLDELWVVFXKVKN(SEQID NO17)。第36號(hào)殘基沒有鑒定出來(lái)。7.5kD肽的前25個(gè)殘基的序列對(duì)應(yīng)為(M)KSRGKDLDKAYDQALDYFSGIAER(SEQ ID NO18)。6kD片段被發(fā)現(xiàn)含有三個(gè)序列的混合物。
4.擴(kuò)增MmeI內(nèi)切酶的一部分從氨基端肽、25kD、14kD和7.5kD肽獲得的肽段序列信息被用于構(gòu)建一系列對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基密碼子的簡(jiǎn)并PCR引物。這些內(nèi)部肽片斷的順序是未知的，因此針對(duì)這些片段都制備了正向(正義鏈)和反向(反義鏈)引物，這些引物是 25kD片段殘基DEFGNYFA(SEQ ID NO19) 正向 1)5’-GARTTYGGNAAYTAYTTYGC-3’(SEQ ID NO20) 反向 2)5’-AARTARTTNCCRAAYTCRTC-3’(SEQ ID NO21) 14kD片段殘基MDAKKR(SEQ ID NO22) 正向A 3)5’-ATGGAYGCNAARAARCG-3’(SEQ ID NO23) 正向B 4)5’-ATGGAYGCNAARAARAG-3’(SEQ ID NO24) 反向 5)5’-CGNCGYTTYTTNGCRTCCAT-3’(SEQ ID NO25) 7.5kD片段殘基DKAYDQA(SEQ ID NO26) 正向 6)5’-GAYAARGCNTAYGAYCARGC-3’(SEQ ID NO27) 反向 7)5’-GCYTGRTCRTANGCYTTRTC-3’(SEQ ID NO28) 其中 Y＝T、C R＝A、G H＝A、T、C S＝G、C N＝A、C、G、T 引物1和2源自MmeI的25kD的CNBr肽段，準(zhǔn)備導(dǎo)引基因的正義鏈(1)或者反義鏈(2)。引物3到5源自MmeI的14kD的CNBr肽段，準(zhǔn)備導(dǎo)引基因的正義鏈(3和4)或者反義鏈(5)，其中引物3和4在精氨酸殘基的密碼子使用上有所不同。引物6和7源自MmeI的7.5kD的CNBr肽段，準(zhǔn)備導(dǎo)引基因的正義鏈(6)或者反義鏈(7)。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用引物組合1和5、1和7、3和2、3和7、4和2、4和7、6和2、以及6和7來(lái)進(jìn)行。MmeI基因的一部分可以在PCR反應(yīng)中被擴(kuò)增出來(lái)，反應(yīng)溶液包括 80μl 10×Thermopol緩沖液(NEB) 50μl 4mM dNTP溶液(NEB) 4μl MmeI基因組DNA(500μg/ml儲(chǔ)液) 16μl 100mM MgSO4 586μl dH2O 16μl(32個(gè)單位)

exo-DNA聚合酶(NEB) 上述混合溶液被分成每份90μl的8個(gè)等份，然后往每個(gè)等份中加入5μl的正向引物(10μM儲(chǔ)液)和5μl的反向引物(10μM儲(chǔ)液)。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95℃3分鐘，一個(gè)循環(huán)；然后95℃30秒，46℃30秒，72℃2分鐘，25個(gè)循環(huán)。
擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳分離并分析。獲得的主要的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物是450個(gè)堿基對(duì)(bp)(引物2和4)、650bp(引物5和6)和1100bp(引物2和6)的片段。這些片段的大小與7.5kD的CnBr降解片段位于最靠近蛋白氨基端的位置并距離14kD的CnBr片段大約650bp，14kD片段位于7.5kD片段和25kD片段中間而且鄰近25kD片段相一致。這些擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段經(jīng)過膠純化，并利用用于擴(kuò)增的引物進(jìn)行測(cè)序。獲得的DNA序列的翻譯與來(lái)自于純化的MmeI內(nèi)切酶的氨基酸序列匹配，這表明MmeI內(nèi)切酶基因DNA序列的一部分已經(jīng)被成功獲得了。
5.測(cè)定整個(gè)MmeI基因和鄰近DNA的DNA序列利用反向PCR技術(shù)從上面得到的1060bp的MmeI基因片段的兩端出發(fā)延伸DNA序列。為了達(dá)到這個(gè)目的，一系列與MmeI基因DNA序列匹配并用于反向PCR的引物被設(shè)計(jì)和合成出來(lái)。MmeI基因組DNA用一系列限制性內(nèi)切酶剪切之后，在低濃度條件下連接形成環(huán)狀的DNA模板。
A.MmeI基因組DNA用10種不同的限制性內(nèi)切酶消化，然后環(huán)狀連接以獲得可以利用反向PCR技術(shù)來(lái)擴(kuò)增的DNA模板。使用的限制性酶是 BspHI(T/CATGA) EcoRI(G/AATTC) HindIII(A/AGCTT) HinP1I(G/CGC) MspI(C/CGG) NlaIII(CATG/) PstI(CTGCA/G) SacI(GAGCT/C) SphI(GCATG/C) XbaI(T/CTAGA) 為了進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化，將下列試劑組合 5μl 10×為不同酶所推薦的NEBuffer(隨著酶改變) 2μl嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌基因組DNA(1μg) 43μl dH2O 1μl(10～20單位)限制性酶。
反應(yīng)在37℃溫浴1個(gè)小時(shí)。將反應(yīng)加熱到65℃(對(duì)于PstI是80℃)持續(xù)20分鐘使限制性內(nèi)切酶失活。被消化的DNA通過加入50μl的10×T4DNA連接酶緩沖液、400μd dH2O和3μl濃的T4DNA連接酶(6000單位，新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司)并在16℃溫浴16小時(shí)而被連接成環(huán)狀的片段。連接后的DNA用酚和氯仿提取，再用2-丙醇沉淀，之后重懸在100μl TE緩沖液中。
B.擴(kuò)增與MmeI內(nèi)切酶基因的1060bp片段鄰近的DNA兩對(duì)PCR引物被設(shè)計(jì)出來(lái)，一對(duì)分別靠近用簡(jiǎn)并引物直接PCR出來(lái)的1060bp序列的兩端。這些引物序列是 引物IP1 5’-GTTGGATCCCGCACAGATTGCTCAGG-3’(SEQ ID NO29) 引物IP2 5’-GTTGGATCCTACGTTAATCTGAATAAGATG-3’(SEQ IDNO30) 引物IP3 5’-GTTGGATCCTGTTAATCTGAAACGCTGG-3’(SEQ IDNO31) 引物IP4 5’-GTTGGATCCTTATACCAAAATGTGAGGTC-3’(SEQ IDNO32)。
反向PCR反應(yīng)是利用引物對(duì)IP1和IP2、IP3和IP4、以及IP1和IP3，以上述10種環(huán)狀模板為模板進(jìn)行的。為了進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，將下列試劑組合 80μl 10×Thermopol緩沖液(NEB) 50μl 4mM dNTP溶液(NEB) 40μl IP引物(正向) 40μl IP引物(反向) 16μl 100mM MgSO4 534μl dH2O 16μl(32個(gè)單位)

exo-DNA聚合酶(NEB) 上述混合液被分裝成10管，每管76μl，然后再往每管中加入4μl經(jīng)過適當(dāng)消化并環(huán)狀連接的模板。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95℃3分鐘，一個(gè)循環(huán)，然后95℃30秒，56℃30秒，72℃3分鐘，25個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析。
對(duì)于引物IP1和IP2與SphI模板和NlaIII模板，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大約是825bp。對(duì)于引物IP3和IP4與BspHI模板，得到的產(chǎn)物大約是800bp。對(duì)于引物IP1和IP3與EcoRI模板，得到的產(chǎn)物大約是1500bp。這些擴(kuò)增得到的DNA片段經(jīng)過膠純化，測(cè)序，并與前面得到的序列組裝。組裝后的序列并不含有完整的MmeI內(nèi)切酶開放閱讀框。這個(gè)組裝后的序列被用于指導(dǎo)第二輪反向PCR引物對(duì)的合成。這些引物的序列是 引物IP5 5’-TTCAGAAATACGAGCGATGC-3’(SEQ ID NO33) 引物IP6 5’-GTCAAGCCATAAACACCATC-3’(SEQ ID NO34) 引物IP7 5’-GAGGGTCAGAAAGGAAGCTG-3’(SEQ ID NO35) 引物IP8 5’-GTCCAACTAACCCTTTATGG-3’(SEQ ID NO36)。
反向PCR擴(kuò)增反應(yīng)按照上述條件進(jìn)行。采用引物IP5和IP6，可以從NlaIII模板(大約450bp)和MspI模板(大約725bp)得到產(chǎn)物，但不能從其它環(huán)狀連接模板得到產(chǎn)物。采用引物IP7和IP8，可以從EcoRI模板(大約500bp)、SphI模板(大約825bp)和BspHI模板(大約750bp)得到產(chǎn)物。這些DNA片段被測(cè)序，然后再與前面得到的序列組裝。組裝后的序列依然不含有完整的MmeI內(nèi)切酶開放閱讀框，因此要進(jìn)行又一輪引物合成和反向PCR。額外的DNA模板按照上述方法獲得，但是是用限制性酶ApoI(R/AATTY)、AseI(AT/TAAT)、BsaHI(GR/CGYC)、MfeI(C/AATTG)、SspI(AAT/ATT)和EcoRV(GAT/ATC)來(lái)消化嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌基因組DNA。第三輪中的引物的序列是 引物IP9 5’-TTCCTAGTGCTGAACCTTTG-3’(SEQ ID NO37) 引物IP10 5’-GTTGCGTTACTTGAAATGAC-3’(SEQ ID NO38) 引物IP11 5’-CCAAAATGGAACTTGTTTCG-3’(SEQ ID NO39) 引物IP12 5’-GTGAGTGCGCCCTGAATTAG-3’(SEQ ID NO40)。
反向PCR擴(kuò)增反應(yīng)如上所述地進(jìn)行。采用引物IP9和IP10，可以從NlaIII模板(大約425bp)、MfeI模板(大約750bp)、ApoI模板(大約800bp)和MspI模板(大約2100bp)得到產(chǎn)物。采用引物IP11和IP12，可以從SphI模板(大約875bp)、BspHI模板(大約925bp)和EcoRI模板(大約950bp)得到產(chǎn)物。這些DNA片段被測(cè)序，然后再與前面獲得的序列組裝。利用如下三個(gè)額外的引物，進(jìn)一步對(duì)IP9、IP10的MspI 2100bp產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序 引物S1 5’-GCTTCATTTCATCCTCTGTGC-3’(SEQ ID NO41) 引物S2 5’-TAACCGCCAAAATTAATCGTG-3’(SEQ ID NO42) 引物S3 5’-CCACTATTCATTACAACACC-3’(SEQ ID NO43)。
最終組裝成的序列(圖2)含有完整的MmeI限制性內(nèi)切酶基因，還包括基因上游1640bp的序列以及基因下游1610bp的序列。
6.在大腸桿菌中克隆MmeI內(nèi)切酶基因推定的MmeI內(nèi)切酶開放閱讀框從由各反向PCR擴(kuò)增出的DNA片段序列組裝而獲得的DNA序列中鑒定出來(lái)。開放閱讀框的起始位點(diǎn)是基于預(yù)測(cè)的開放閱讀框氨基端氨基酸序列與由MmeI內(nèi)切酶蛋白確定的序列的匹配而鑒定出來(lái)的。預(yù)測(cè)的開放閱讀框末端能夠保證編碼大約105kD的多肽，這與觀察到的天然MmeI內(nèi)切酶大小一致。從這個(gè)開放閱讀框翻譯得到的氨基酸序列含有N6mA DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的保守序列基序。然而，在鄰近MmeI內(nèi)切酶基因的區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)含有在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶中保守的序列基序的開放閱讀框，這與預(yù)測(cè)的結(jié)果是一致的。因此決定在沒有另一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶存在以保護(hù)大腸桿菌宿主DNA免受剪切的情況下，在大腸桿菌中嘗試表達(dá)MmeI內(nèi)切酶。寡聚核苷酸引物被合成出來(lái)以特異性地從嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌基因組DNA中擴(kuò)增出MmeI基因，使得它可以用克隆載體pRRS(Skoglund，Gene 881-5(1990))表達(dá)。正向引物含有方便克隆的PstI位點(diǎn)、與載體的lacZ基因處于同一閱讀框的終止密碼子、保守的大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)、ATG翻譯起始位點(diǎn)(修改了嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌使用的GTG，這是為了在大腸桿菌中更好地表達(dá))，以及與嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌DNA序列匹配的20個(gè)核苷酸 5’-GTTCTGCAGTTAAGGATAACATATGGCTTTAAGCTGGAACGAG-3’(SEQ ID NO44)。
反向引物含有方便克隆的BamHI位點(diǎn)，以及與MmeI開放閱讀框末端3’側(cè)的嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌DNA序列匹配的22個(gè)核苷酸 5’-GTTGGATCCGTCGACATTAATTAATTTTTGCCCTTAG-3’(SEQ IDNO45)。
為了在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增MmeI基因，將下列試劑組合 50μl 10×Thermopol緩沖液(NEB) 30μl 4mM dNTP溶液(NEB) 12.5μl正向引物(10μM儲(chǔ)液) 12.5μl反向引物(10μM儲(chǔ)液) 5μl MmeI基因組DNA(500μg/mI儲(chǔ)液) 387μl dH2O 3μl(6個(gè)單位)

DNA聚合酶 反應(yīng)溶液混合后分裝到5個(gè)管中，每管80μl。將MgSO4(100mM儲(chǔ)液)分別加入到各管使得終濃度分別為2mM、3mM、4mM、5mM和6mM。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為95℃30秒，60℃30秒，72℃3分鐘，24個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物用凝膠電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mg++濃度為3mM到6mM時(shí)的反應(yīng)得到了所要的2.8kb的DNA條帶。這些反應(yīng)產(chǎn)物被匯集到一起，2.8kb的條帶被膠純化。2.8kb的MmeI基因擴(kuò)增片段用BamHI和PstI內(nèi)切酶(NEB)降解，條件如下 15μl 10×BamHI反應(yīng)緩沖液(NEB) 1.5μl BSA(NEB) 50μl MmeI基因的2.8kb擴(kuò)增DNA片段 80μl dH2O 5μl BamHI內(nèi)切酶(100單位) 5μl PstI內(nèi)切酶(100單位) 反應(yīng)液混合之后在37℃溫浴1小時(shí)。按照制造商提供的說明通過Qiagen的QiaPrep spin column進(jìn)行純化，將從2.8kb的DNA片段末端剪切下來(lái)的小片段和內(nèi)切酶去除。
剪切后的MmeI基因DNA片段按照如下的程序被連接到pRRS載體中10μl經(jīng)過消化、純化的2.8kb MmeI片段與5μl事先用BamHI和PstI剪切并純化過的pRRS載體混合，加入5μl的dH2O、20μl的2×QuickLigase緩沖液(NEB)，混合，再加入2μl的QuickLigase。反應(yīng)在室溫溫育5分鐘。將5μl的連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到50μl的大腸桿菌ER2683化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，將這些細(xì)胞涂在含有100μg/ml氨芐青霉素的L-broth平板上，37℃溫育過夜。結(jié)果得到大約200個(gè)轉(zhuǎn)化子，挑出18個(gè)代表性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行如下分析來(lái)自每個(gè)克隆的質(zhì)粒通過小量制備程序被分離出來(lái)，接著用AlwNI和NdeI內(nèi)切酶消化以確定它們是否含有正確大小的插入片段。18個(gè)轉(zhuǎn)化子中有2個(gè)具有正確大小的插入片段，大約是2800bp。兩個(gè)克隆都被測(cè)試是否產(chǎn)生MmeI內(nèi)切酶活性。這些克隆在500ml含有100μg/ml氨芐青霉素的L-broth培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)。細(xì)胞通過離心收集，懸浮在10mL超聲緩沖液(20mMTris-HCl、1mM DTT、0.1mM EDTA，pH7.5)中用超聲破碎細(xì)胞。粗裂解物通過離心使之澄清，回收上清。裂解液被用來(lái)檢測(cè)內(nèi)切酶活性，將裂解液用含有20μg/ml Lamda DNA底物并補(bǔ)充有終濃度為100μM的SAM的1×反應(yīng)緩沖液NEBufferl(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)進(jìn)行一系列稀釋。反應(yīng)在37℃溫浴1小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠和1×TBE緩沖液通過瓊脂糖凝膠電泳分析。兩個(gè)克隆中有1個(gè)具有MmeI內(nèi)切酶活性。這個(gè)有活性的克隆被標(biāo)記為菌株NEB1457，可用于后續(xù)的MmeI生產(chǎn)。該克隆中表達(dá)MmeI活性的質(zhì)粒構(gòu)建物被標(biāo)記為pTBMmeI.1。
實(shí)施例III MmeI內(nèi)切酶在體內(nèi)條件下提供抗MmeI剪切的保護(hù)作用 質(zhì)粒pTBMmeI.1通過Qiagen的小量制備(miniprep)程序從NEB1457中純化出來(lái)。這個(gè)質(zhì)粒在載體骨架中具有兩個(gè)MmeI位點(diǎn)，在MmeI基因中也有一個(gè)MmeI位點(diǎn)。質(zhì)粒用MmeI消化以檢測(cè)這段DNA是否對(duì)MmeI內(nèi)切酶活性具有抗性，這種抗性意味著單個(gè)MmeI基因可以在體內(nèi)條件下甲基化DNA以保護(hù)宿主DNA免受內(nèi)切酶活性的影響。為了檢測(cè)將下列試劑混合 10μl pTBMmeI.1 miniprep DNA 15μl 10×NEBuffer4 15μl SAM(1mM儲(chǔ)液) 110μl dH2O 1μl MmeI內(nèi)切酶(15單位)。
反應(yīng)液混合之后分成三份。往第一個(gè)三分之一反應(yīng)液中加入0.5μl水，往第二個(gè)三分之一反應(yīng)液中加入0.5μl pRRS載體，往第三個(gè)三分之一反應(yīng)液中加入0.5μl PhiX174DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。pTBMmeI.1不被MmeI內(nèi)切酶活性剪切，而同在一個(gè)反應(yīng)體系中的PhiX174和pRRSDNA都被剪切，這表明pTBMmeI.1DNA中的三個(gè)MmeI位點(diǎn)對(duì)MmeI內(nèi)切酶活性都具有抗性。
實(shí)施例IV MmeI內(nèi)切酶對(duì)甲基化的靈敏性 現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道MmeI內(nèi)切酶只甲基化其識(shí)別序列中的一條鏈，并且認(rèn)為這種半甲基化并不能阻止該內(nèi)切酶繼而對(duì)該DNA的剪切(Tucholski，Gene 223(1998)293-302)。為了測(cè)試這一點(diǎn)，四種寡聚核苷酸被合成出來(lái)，從而得到兩條鏈都沒有甲基化(寡聚物1+寡聚物2)、只有上鏈被甲基化(寡聚物3+寡聚物2)、只有下鏈被甲基化(寡聚物1+寡聚物4)，或者兩條鏈都被甲基化(寡聚物3+寡聚物4)的DNA底物。這些合成的寡聚核苷酸如下 寡聚物1 5’-FAM-GTTTGAAGACTCCGACGCGATGGCCAGCGATCGGCGCCTCAGCTTTTG-3’(SEQ ID NO46) 寡聚物2 5’-FAM-CAAAAGCTGAGGCGCCGATCGCTGGCCATCGCGTCGGAGTCTTCAAAC-3’(SEQ ID NO47) 寡聚物3 5’-FAM-GTTTGAAGACTCCG(6mA) CGCGATGGCCAGCGATCGGCGCCTCAGCTTTTG-3’(SEQ IDNO48) 寡聚物4 5’-FAM-CAAAAGCTGAGGCGCCGATCGCTGGCCATCGCGTCGG(6mA)GTCTTCAAAC-3’(SEQ ID NO49)。
(MmeI識(shí)別序列以外的其它核苷酸也在其它研究中被甲基化，但由于MmeI對(duì)于這些核苷酸沒有任何序列特異性，因此確實(shí)可能影響MmeI活性的才表示出來(lái)，而其它甲基化為了簡(jiǎn)明起見而在這里略去)。雙鏈DNA是通過將100μl上鏈寡聚核苷酸(14μm儲(chǔ)液)和100μl下鏈寡聚核苷酸(14μm儲(chǔ)液)混合，加熱到85℃然后經(jīng)20分鐘緩慢冷卻到30℃而形成的。然后使用MmeI在30μl的反應(yīng)中剪切寡聚核苷酸對(duì)，反應(yīng)體積中包括1×NEBuffer4、2.5μM寡聚核苷酸、100μM的SAM和2.5單位的MmeI。作為對(duì)照，限制性內(nèi)切酶Hpy188I也被用于剪切所述寡聚DNA。Hpy188I的識(shí)別序列覆蓋了這段DNA中MmeI識(shí)別序列的前5個(gè)核苷酸，5’-TCNGA-3’，而且Hpy188I的活性會(huì)被這段DNA中任一條鏈上的腺嘌呤甲基化所阻斷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MmeI按照預(yù)想的一樣剪切沒有甲基化的DNA。與以前的教導(dǎo)(Tucholski，Gene 223293-302(1998))相反，MmeI并不剪切只有上鏈被甲基化的半甲基化DNA5’-TCCG(N6Ma)C-3’。當(dāng)只有下鏈被甲基化的時(shí)候，MmeI確實(shí)會(huì)剪切該DNA。當(dāng)兩條鏈都被甲基化的時(shí)候，MmeI不剪切DNA。(圖5)這個(gè)發(fā)現(xiàn)與觀察到的單個(gè)MmeI酶在體內(nèi)條件下保護(hù)宿主DNA免受剪切的能力以及MmeI只甲基化其識(shí)別序列上鏈的觀察一致。我們通過用帶有氚標(biāo)記的H3-SAM甲基化上述寡聚核苷酸對(duì)，再洗去沒有整合的SAM并對(duì)DNA進(jìn)行放射性活性計(jì)數(shù)，從而確認(rèn)MmeI酶只甲基化其識(shí)別序列的上鏈。未甲基化的寡聚DNA和上鏈沒有甲基化、下鏈甲基化的DNA都具有比背景高10倍以上的計(jì)數(shù)量，而下鏈沒有甲基化、上鏈甲基化的DNA和兩條鏈都甲基化的DNA具有接近背景的計(jì)數(shù)量(圖6)。這些發(fā)現(xiàn)表明MmeI是一種新型的不需要另外單獨(dú)的甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)修飾宿主DNA以提供抗該內(nèi)切酶活性的保護(hù)作用的限制性修飾系統(tǒng)，就像IIG型(也稱為IV型)的酶如Eco57I一樣。
實(shí)施例V DNA測(cè)序和分析 DNA測(cè)序DNA測(cè)序是在ABI373或ABI377自動(dòng)測(cè)序儀上用雙鏈模板進(jìn)行的。擴(kuò)增的DNA片段和各個(gè)克隆用上述合成的引物或者載體上的通用引物進(jìn)行測(cè)序。
計(jì)算機(jī)分析獲得的DNA序列的計(jì)算機(jī)分析是用GeneticsComputer Group程序(Deverenx等，Nucleic Acids Res.12387-395(1984))進(jìn)行的，而數(shù)據(jù)庫(kù)相似性搜索是通過因特網(wǎng)在美國(guó)國(guó)立生物信息中心的網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上用BLASTX和BLASTP算法(Altschul等，J.Mol.Biol 215403-410(1990)和Gish等，Nature Genet.3266-722(1993))實(shí)施的。
序列表
<110>新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(New England Biolabs，Inc.)
<120>重組II型限制性內(nèi)切核酸酶MmeI和相關(guān)內(nèi)切核酸酶
以及制備這些酶的方法
<130>CPUSZ50007
<140>
<141>
<150>US 60/395,431
<151>2002-07-12
<160>50
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>6010
<212>DNA
<213>嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌(Methylophilus methylotrophus)
<220>
<221>misc_feature
<222>(800)..(800)
<223>n是a，c，g或t
<400>1
gaattccaga taggtagtcc tttggtactt ccatcccaac cagtgtcacg ttccgcgcca 60
aaccaatcgg ttaaagtgta agaaagtctt gcactgaagt agctgtagga caaaccgaag 120
ttaacctctg tggtatccca gcgaccacct ttaggtgttt gacggaagcc tgctgcgtca 180
cctgccaagt tatatttctt ccatgaacca cctgggtaca ggtagctgat caaaccagca 240
gtccaaccca agccttcaat agcaggaata gttccgttat acccaccata aatatcaatt 300
tcggcagttg catcagggaa ggtatttggt gtcacgtttg aaccccatgc accgacataa 360
aagccgctgt catgagtaat atcaataccg ccttgaacgg caggtttgtg ccagttttgt 420
gaaataccac gagcatagta atctgaaaca aatccaacgt ttgcagtagc agcccaggct 480
gatttttctt ctttagcctc ttcagctgcg tatgaaactt gggcaaaaga taatgtgctt 540
aacactgctg tgagcaatat agattgacgc attatgagtc ctctctctgt gaaatctttg 600
attaagttgt tgtaaacgag aatgaaacaa caaccacaaa gcaaagcacg tgccaaacta 660
taaataacat tataatcaat tatttaaaat atatttataa tctaaaatat taaattaatt 720
atttaataaa ctgtttttta ttgatttaac tctaaaacat atgggtgcaa ccaccctttt 780
tactcactga taatgctaan atagccaaca aaggagcctt caccatgctg atttcaaatg 840
aaaaaattca ggaattatct ttaaaaatca aacaactaat cgaatcaagc cccatttcag 900
agctaaataa caacttgcat gcactaattc agggcgcact caccaaaatg gaacttgttt 960
cgcgtgaaga attcgatatc caatctgcat tattagcgcg cacgcaagag caattaaaac1020
gtcttgaaga aaaaatcagc cagcttgaag aagggcaggc atccagaaag taaaaattaa1080
tttacaattg ttagcattcc attattgagg agtgcgctat gagtctggcg gtgttataca1140
gtcgcgcgtt aagcggcatg gaggcgccag aagtggtggt agaagtccac ttggcgaatg1200
gactacccag ctttaccatt gttgaaacat attgaaactt taagccttag cattttttca1260
aatatacaaa tgccccaagc tggtgcatta agaagaatgt aacaactccc tgcagactag1320
gaataacttc atgatttaac gaacatccct gagtttcaaa gtcgaatctt ctcgtgttgc1380
aaatttctac agcttccttt ctgaccctct tgcaccaaat tgcactatgg cgctaataaa1440
tcttctgcta tccaataatg tccaactaac cctttatgga ctcttaaaaa agatttaata1500
aatgattaag atgaattcaa ggaatttgat gcctggaaat atggcaaaag caaaaaggca1560
gcccagtgct gacttttttg ttttaacatt ggcccatata tccaatttca aataatttaa1620
aaattatcgg gagctaatct gtggctttaa gctggaacga gataagaaga aaagctattg1680
agttttctaa aagatgggaa gacgcctcag atgaaaacag tcaagccaaa ccctttttaa1740
tagatttttt cgaagttttt ggaataacta ataagagagt tgcaacattt gagcatgctg1800
tgaaaaagtt cgccaaggcc cataaggaac aatctcgagg attcgtagat ttgttttggc1860
ctggcattct tcttattgaa atgaaaagca gaggtaaaga cctcgacaaa gcgtatgacc1920
aggcacttga ttacttttct ggcattgcag aaagagactt acccagatac gttttagttt1980
gcgacttcca gcgtttcaga ttaacagacc taataacaaa agagtcagtt gaatttcttt2040
taaaggactt ataccaaaat gtgaggtctt ttggttttat agctggttat caaactcaag2100
taatcaagcc acaagaccct attaatatta aggcggctga acggatgggt aagcttcatg2160
acaccctgaa gttggttgga tatgagggac acgctttaga actttatcta gtgcgtttac2220
ttttttgctt attcgcagaa gacacaacta tttttgagaa aagtttattc caagaatata2280
tcgagacaaa gacgctagag gacggcagtg accttgcaca tcatatcaat acactttttt2340
atgttctcaa taccccagaa caaaaaagat taaagaatct agacgaacac cttgctgcat2400
ttccatatat caatggaaaa cttttcgagg agccacttcc gccagctcag tttgataaag2460
caatgagaga ggcattgctt gacttgtgct cattagattg gagcaggatt tcaccagcaa2520
tatttggaag tttattccaa agcattatgg atgctaaaaa gagaagaaat cttggggcac2580
actacaccag cgaagcaaat attctcaagt taatcaagcc attgtttctt gacgagctct2640
gggtagagtt cgagaaagtt aaaaataata aaaataaatt actagcgttc cacaaaaaac2700
taagaggact tacatttttc gaccctgcat gcggttgcgg aaattttctt gtaatcacat2760
accgagaact aagactttta gaaattgaag tgttaagagg attgcataga ggtggtcaac2820
aagttttgga tattgagcat cttattcaga ttaacgtaga ccagtttttt ggtatcgaaa2880
tagaggagtt tcccgcacag attgctcagg ttgctctctg gcttacagac caccaaatga2940
atatgaaaat ttcagatgag tttggaaact actttgcccg tatcccacta aaatctactc3000
ctcacatttt gaatgctaat gctttacaga ttgattggaa cgatgtttta gaggctaaaa3060
aatgttgctt catattagga aatcctccat ttgttggtaa aagtaaacaa acaccgggac3120
aaaaagcgga tttactatct gtttttggaa atcttaaatc cgcttcagac ttagacctag3180
ttgctgcttg gtatcccaaa gcagcacatt acattcaaac aaatgcaaac atacgctgtg3240
catttgtctc aacgaatagt attactcaag gtgagcaagt atcgttgctt tggccgcttc3300
tgctctcatt aggcataaaa ataaactttg ctcacagaac tttcagctgg acaaatgagg3360
cgtcaggagt agcggcggtt cactgcgtaa ttatcggatt tgggttgaag gattcagatg3420
aaaaaataat ctatgagtat gaaagtatta atggagaacc attagctatt aaggcaaaaa3480
atattaatcc atatttgaga gacggggtgg atgtgattgc ctgcaagcgt cagcagccaa3540
tctcaaaatt accaagcatg cgttatggca acaaaccaac agatgatgga aatttcctat3600
ttactgacga agaaaaaaac caatttatta caaatgagcc atcttccgaa aaatacttca3660
gacggtttgt gggcggggat gagttcataa acaatacaag tcgatggtgt ttatggcttg3720
acggtgctga catttcagaa atacgagcga tgcctttggt cttggctagg ataaaaaaag3780
tccaagaatt cagattaaaa agctcggcca aaccaactcg acaaagtgct tcgacaccaa3840
tgaagttctt ttatatatct cagccggata cggactatct gttgatacct gaaacatcat3900
ctgaaaacag acaatttatt ccaattggtt ttgttgatag aaatgtcatt tcaagtaacg3960
caacgtatca tattcctagt gctgaacctt tgatatttgg cctgctttca tcgaccatgc4020
acaactgctg gatgagaaat gtaggaggaa ggttagaaag tcgttataga tattctgcca4080
gcctggttta caacacgttt ccatggattc aacccaacga aaaacaatcg aaagcgatag4140
aagaagctgc atttgcgatt ttaaaagcta gaagcaatta tccaaacgaa agtttagctg4200
gtttatacga cccaaaaaca atgcctagtg agcttcttaa agcacatcaa aaacttgata4260
aggctgtgga ttctgtctat ggatttaaag gaccaaacac agaaattgct cgaatagctt4320
ttttgtttga aacataccaa aagatgactt cactcttacc accagaaaaa gaaattaaga4380
aatctaaggg caaaaattaa ttaatgtatt taacattaaa ccaccctgat ttatttcgaa4440
tagttcaaat gcttccatgt ggactaatcg ccttcaatca tattaaaaaa ccgacgctag4500
taataaaaac ttccaaagag gccatattaa ccgccaaaat taatcgtgaa tttaaaatat4560
atctttatca aaccacatcg gcttgtgttc tagtaagtgc attttttgac gattctgata4620
gtccactatt cattacaaca ccaattgttc gagatgacca acactcctta gacttgttaa4680
gatttttaat caacaatgat tttacgattt gcttctttga tgaactgaac cgagaatttc4740
tttccgttaa cgcaactggt aatttagtct ctatctttga gagcattcac ttgatgccac4800
tgccgagccc agaggaagcc cacaatgcat tgaatgaagc ggaattttgg ttcagtttac4860
gctcagctgc tgatgatgaa tcatctatcc aggtttcttt attggataat ctatttcctg4920
acgattttgt aatttatgac ctatcctcaa acaaaaacga tatgacatca ttggttagag4980
aaactaaacc aggatactat caggaagcag atattgcaaa gttactaaca agagctttta5040
gtttggaaag catttatcag aatccagtga aaacaagcga ttcaaaagag ttggcagacg5100
ttgtggtatt cggccaaaag gaaattttaa taattcaagc taaagatagt gaaaacaatc5160
agaaacaagt tttagaggtt tcgttagaca agaaatgcgc aaagtcttca aagaaacttt5220
ctgaagcttt ggcacaactc accgacacta tcttaacaat atccaataca ccaatagttg5280
atgttcgggt tggtaagaaa aaatgcactc tgaactttga gggaaagcag cttattggta5340
tcgtcgttgt taaagagctt tttaatgata tttacgataa atacagtcaa aaagtttttg5400
agcatgtaga gttgtctaaa gcacccattg tcttctttga ctatccagaa tttgcaagaa5460
tgacatttca ttgtaattct gaggaattat tactttatgc tttgcatagg atatttagtt5520
ctgcaataga aaatggaatg tataaacgat tgagatttac tcaacctatc ataactgatg5580
gtcatgacag ctacttcagg atacaaaaca ggccccattc tgatgaggcc tatttaattt5640
gcacagagga tgaaatgaag ctctcaaata agtttaaaga ctaaatttat attttcctca5700
gtatcttaaa aacaatattc attaaattgg aaagcccgca atgattgttg cagtatcaat5760
gcgggcatca gtatccagct cttgcaatac acggaagtat caagaagcga atcaggattc5820
taaccatacc tttttaattg caacaatcta atttccataa catgtgtagc tacatcgaaa5880
aaaagacctc gaagaggttg caagagcgtc cagctcgcgg catcaaaaga ccctagtctt5940
ttgacaaggg ggagccaaaa aactgaggtg gaggagcttg ccgacgaagc caggaagccc 6000
cagcgtccgg 6010
<210>2
<211>919
<212>PRT
<213>嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌(Methylophilus methylotrophus)
<400>2
Met Ala Leu Ser Trp Asn Glu Ile Arg Arg Lys Ala Ile Glu Phe Ser
1 5 10 15
Lys Arg Trp Glu Asp Ala Ser Asp Glu Asn Ser Gln Ala Lys Pro Phe
20 25 30
Leu Ile Asp Phe Phe Glu Val Phe Gly Ile Thr Asn Lys Arg Val Ala
35 40 45
Thr Phe Glu His Ala Val Lys Lys Phe Ala Lys Ala His Lys Glu Gln
50 55 60
Ser Arg Gly Phe Val Asp Leu Phe Trp Pro Gly Ile Leu Leu Ile Glu
65 70 75 80
Met Lys Ser Arg Gly Lys Asp Leu Asp Lys Ala Tyr Asp Gln Ala Leu
85 90 95
Asp Tyr Phe Ser Gly Ile Ala Glu Arg Asp Leu Pro Arg Tyr Val Leu
100 105 110
Val Cys Asp Phe Gln Arg Phe Arg Leu Thr Asp Leu Ile Thr Lys Glu
115 120 125
Ser Val Glu Phe Leu Leu Lys Asp Leu Tyr Gln Asn Val Arg Ser Phe
130 135 140
Gly Phe Ile Ala Gly Tyr Gln Thr Gln Val Ile Lys Pro Gln Asp Pro
145 150 155 160
Ile Asn Ile Lys Ala Ala Glu Arg Met Gly Lys Leu His Asp Thr Leu
165 170 175
Lys Leu Val Gly Tyr Glu Gly His Ala Leu Glu Leu Tyr Leu Val Arg
180 185 190
Leu Leu Phe Cys Leu Phe Ala Glu Asp Thr Thr Ile Phe Glu Lys Ser
195 200 205
Leu Phe Gln Glu Tyr Ile Glu Thr Lys Thr Leu Glu Asp Gly Ser Asp
210 215 220
Leu Ala His His Ile Asn Thr Leu Phe Tyr Val Leu Asn Thr Pro Glu
225 230 235 240
Gln Lys Arg Leu Lys Asn Leu Asp Glu His Leu Ala Ala Phe Pro Tyr
245 250 255
Ile Asn Gly Lys Leu Phe Glu Glu Pro Leu Pro Pro Ala Gln Phe Asp
260 265 270
Lys Ala Met Arg Glu Ala Leu Leu Asp Leu Cys Ser Leu Asp Trp Ser
275 280 285
Arg Ile Ser Pro Ala Ile Phe Gly Ser Leu Phe Gln Ser Ile Met Asp
290 295 300
Ala Lys Lys Arg Arg Asn Leu Gly Ala His Tyr Thr Ser Glu Ala Asn
305 310 315 320
Ile Leu Lys Leu Ile Lys Pro Leu Phe Leu Asp Glu Leu Trp Val Glu
325 330 335
Phe Glu Lys Val Lys Asn Asn Lys Asn Lys Leu Leu Ala Phe His Lys
340 345 350
Lys Leu Arg Gly Leu Thr Phe Phe Asp Pro Ala Cys Gly Cys Gly Asn
355 360 365
Phe Leu Val Ile Thr Tyr Arg Glu Leu Arg Leu Leu Glu Ile Glu Val
370 375 380
Leu Arg Gly Leu His Arg Gly Gly Gln Gln Val Leu Asp Ile Glu His
385 390 395 400
Leu Ile Gln Ile Asn Val Asp Gln Phe Phe Gly Ile Glu Ile Glu Glu
405 410 415
Phe Pro Ala Gln Ile Ala Gln Val Ala Leu Trp Leu Thr Asp His Gln
420 425 430
Met Asn Met Lys Ile Ser Asp Glu Phe Gly Asn Tyr Phe Ala Arg Ile
435 440 445
Pro Leu Lys Ser Thr Pro His Ile Leu Asn Ala Asn Ala Leu Gln Ile
450 455 460
Asp Trp Asn Asp Val Leu Glu Ala Lys Lys Cys Cys Phe Ile Leu Gly
465 470 475 480
Asn Pro Pro Phe Val Gly Lys Ser Lys Gln Thr Pro Gly Gln Lys Ala
485 490 495
Asp Leu Leu Ser Val Phe Gly Asn Leu Lys Ser Ala Ser Asp Leu Asp
500 505 510
Leu Val Ala Ala Trp Tyr Pro Lys Ala Ala His Tyr Ile Gln Thr Asn
515 520 525
Ala Asn Ile Arg Cys Ala Phe Val Ser Thr Asn Ser Ile Thr Gln Gly
530 535 540
Glu Gln Val Ser Leu Leu Trp Pro Leu Leu Leu Ser Leu Gly Ile Lys
545 550 555 560
Ile Asn Phe Ala His Arg Thr Phe Ser Trp Thr Asn Glu Ala Ser Gly
565 570 575
Val Ala Ala Val His Cys Val Ile Ile Gly Phe Gly Leu Lys Asp Ser
580 585 590
Asp Glu Lys Ile Ile Tyr Glu Tyr Glu Ser Ile Asn Gly Glu Pro Leu
595 600 605
Ala Ils Lys Ala Lys Asn Ile Asn Pro Tyr Leu Arg Asp Gly Val Asp
610 615 620
Val Ile Ala Cys Lys Arg Gln Gln Pro Ile Ser Lys Leu Pro Ser Met
625 630 535 640
Arg Tyr Gly Asn Lys Pro Thr Asp Asp Gly Asn Phe Leu Phe Thr Asp
645 650 655
Glu Glu Lys Asn Gln Phe Ile Thr Asn Glu Pro Ser Ser Glu Lys Tyr
660 665 670
Phe Arg Arg Phe Val Gly Gly Asp Glu Phe Ile Asn Asn Thr Ser Arg
675 680 685
Trp Cys Leu Trp Leu Asp Gly Ala Asp Ile Ser Glu Ile Arg Ala Met
690 695 700
Pro Leu Val Leu Ala Arg Ile Lys Lys Val Gln Glu Phe Arg Leu Lys
705 710 715 720
Ser Ser Ala Lys Pro Thr Arg Gln Ser Ala Ser Thr Pro Met Lys Phe
725 730 735
Phe Tyr lle Ser Gln Pro Asp Thr Asp Tyr Leu Leu Ile Pro Glu Thr
740 745 750
Ser Ser Glu Asn Arg Gln Phe Ile Pro Ile Gly Phe Val Asp Arg Asn
755 760 765
Val Ile Ser Ser Asn Ala Thr Tyr His Ile Pro Ser Ala Glu Pro Leu
770 775 780
Ile Phe Gly Leu Leu Ser Ser Thr Met His Asn Cys Trp Met Arg Asn
785 790 795 800
Val Gly Gly Arg Leu Glu Ser Arg Tyr Arg Tyr Ser Ala Ser Leu Val
805 810 815
Tyr Asn Thr Phe Pro Trp Ile Gln Pro Asn Glu Lys Gln Ser Lys Ala
820 825 830
Ile Glu Glu Ala Ala Phe Ala Ile Leu Lys Ala Arg Ser Asn Tyr Pro
835 840 845
Asn Glu Ser Leu Ala Gly Leu Tyr Asp Pro Lys Thr Met Pro Ser Glu
850 855 860
Leu Leu Lys Ala His Gln Lys Leu Asp Lys Ala Val Asp Ser Val Tyr
8658 70 875 880
Gly Phe Lys Gly Pro Asn Thr Glu Ile Ala Arg Ile Ala Phe Leu Phe
885 890 895
Glu Thr Tyr Gln Lys Met Thr Ser Leu Leu Pro Pro Glu Lys Glu Ile
900 905 910
Lys Lys Ser Lys Gly Lys Asn
915
<210>3
<211>932
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>GenBank號(hào)gi|28373198|ref|NP_783835.1
<400>3
Met Pro Thr Arg Gln Gln Ala Ala Arg Glu Phe Val Lys Thr Trp Ser
1 5 10 15
Ser Asp Lys Lys Gly Arg Glu Asp Ala Asp Arg Gln Thr Phe Trp Asn
20 25 30
Asp Leu Leu Gln Arg Val Tyr Gly Ile Asp Asn Tyr Tyr Asp Tyr Ile
35 40 45
Thr Tyr Glu Lys Asp Val Gln Val Lys Ala Asp Gly Lys Val Thr Thr
50 55 60
Arg Arg Ile Asp Gly Tyr Ile Pro Ser Thr Lys Ile Met Val Glu Met
65 70 75 80
Lys Gly Lys Asn Ile Lys AspLeu Ser Lys Pro Ile Thr Gln Ser Gly
85 90 95
Gly Asp Glu Leu Thr Pro Phe Glu Gln Ala Lys Arg Tyr Ala Asn Phe
100 105 110
Leu Pro Asn Ser Glu Gln Pro Arg Trp Ile Leu Val Ser Asn Phe Asn
115 120 125
Glu Ile Asp Ile His Asp Met Glu Arg Pro Leu Asp Glu Pro Lys Val
130 135 140
Ile Lys Leu Glu Asp Leu Pro Lys Lys Val Lys Ser Leu Glu Phe Met
145 150 155 160
Val Asp Ala Asn Gln Gln Gln Val Ile Asp Glu Lys Gln Leu Ser Val
165 170 175
Asp Ala Gly Asn Leu Val Ala Lys Ile Tyr Asn Glu Leu Thr Asn Ala
180 185 190
Tyr Ala Ala Gly Arg Gly Ile Asp Val Asn Glu Pro Arg Ile Gln Arg
195 200 205
Ser Leu Asn Met Leu Ile Val Arg Leu Val Phe Leu Leu Tyr Ala Asp
210 215 220
Asp Ser Asn Leu Phe Gly Lys Glu Asp Ile Phe Gln Ala Phe Ile Glu
225 230 235 240
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785 790 795 800
Arg Phe His Glu Val Trp Ala Leu Ala Ala Gly Ser Trp His Gly Ser
805 810 815
Gly Asn Asp Pro Arg Tyr Thr Ile Ser Thr Thr Phe Glu Thr Phe Pro
820 825 830
Phe Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asn Ile Ala Ala Val Asp Tyr Glu Gly
835 840 845
Asp Pro Arg Ala Gln Ala Ile Ala Ala Ala Ala Ala Glu Leu Asn Arg
850 855 860
Leu Arg Glu Ala Trp Leu Asn Pro Pro Asp Leu Val Arg Ile Glu Pro
865 870 875 880
Glu Val Val Pro Gly Tyr Pro Asp Arg Val Leu Pro Val Ser Pro Glu
885 890 895
Ala Gly Ala Glu Leu Lys Lys Arg Thr Leu Thr Asn Leu Tyr Asn Gln
900 905 910
Arg Pro Ala Trp Leu Asp Met Ala His Gln Arg Leu Asp Ala Ala Val
915 920 925
Ala Ala Ala Tyr Gly Trp Pro Asp Gly Leu Thr Asp Asp Glu Ile Leu
930 935 940
Glu Arg Leu Phe Ala Leu Asn Gln Glu Arg Ala Ala Ala Gly Arg
945 950 955
<210>13
<211>909
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>GenBank號(hào)gi|15807788|ref|NP_285443.1
<400>13
Met His Pro Gln Glu Phe Ala Asp Thr Trp Ser Arg Arg Ala Leu Lys
1 5 10 15
Ala Thr Glu Arg Asp Ser Tyr Val Gln His Trp Leu Asp Leu Cys Gln
20 25 30
Leu Leu His His Glu Ala Pro Gly Ala Asp Pro Asp Tyr Lys Phe Glu
35 40 45
Arg Arg Val Thr Lys Val Gly Thr Lys Asp Lys Gly Phe Ala Asp Val
50 55 60
Phe Lys Lys Ala His Phe Ile Thr Glu Tyr Lys Arg Pro Gly Ser Asp
65 70 75 80
Leu Gly Ala Ala Leu Gln Gln Ala Thr Leu Tyr Ser Arg Asp Leu Gly
85 90 95
Asn Pro Pro Leu Leu Leu Thr Ser Asp Phe Gln Arg Ile Glu Ile Asn
100 105 110
Thr Ala Phe Thr Gly Thr Ser Pro Lys Ser Tyr Leu Ile Thr Leu Asp
115 120 125
Asp Ile Ala Glu Asn Arg Val Val Gly Gly Asn Asp Val Pro Ala Leu
130 135 140
Gln Ile Leu His Ser Ala Leu His Gln Pro Tyr Asp Leu Asp Pro Arg
145 150 155 160
Leu Phe Arg Glu Arg Ile Thr Thr Asp Ala Thr Arg Gln Val Gly Leu
165 170 175
Val Ala Arg Arg Leu Gly Glu Arg Glu Gly Arg Thr Arg Ala Ala His
180 185 190
Met Met Met Arg Val Val Phe Ala Leu Phe Ala Glu Asp Thr Gly Met
195 200 205
Leu Glu Arg Gly Ile Val Thr Arg Leu Leu Glu Arg Ala Arg Ala Pro
210 215 220
Pro Gly Glu Asp Gln Leu Tyr Phe Gln Asp Leu Phe Gly Ala Met Lys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Glu Phe Trp Gly Thr Asp Ile Arg His Phe Asn Gly Gly
245 250 255
Leu Phe Asp Ser Glu Asp Ala Leu Ala Leu Thr Ser Glu Asp Ala Ala
260 265 270
Ala Leu Ile Ile Ala Ala Lys Leu Asp Trp Ser Glu Val Glu Pro Ser
275 280 285
Ile Phe Gly Thr Leu Phe Glu Asn Ser Leu Asp Val Asp Thr Arg Ser
290 295 300
Arg Arg Gly Ala His Tyr Thr Ser Val Asn Asp Ile Glu Arg Ile Val
305 310 315 320
Asp Arg Val Val Met Glu Pro Leu Trp Ala Glu Trp Asp Ala Leu Arg
325 330 335
Leu Ser Leu Pro Glu Leu Lys Lys Asn Val Arg Leu Glu Arg Leu Phe
340 345 350
Ala Phe Gln Asp Arg Leu Thr Ala Val Arg Ile Leu Asp Pro Ala Cys
355 360 365
Gly Ser Gly Asn Phe Leu Phe Val Ala Leu Lys Lys Leu Leu Asp Leu
370 375 380
Glu Tyr Gln Val Arg Met Ala Ala Val Met Asn Asp Ile Gly Glu Phe
385 390 395 400
Glu Met Pro Pro Leu Val His Pro Gln Gln Met Leu Gly Ile Glu Ile
405 410 415
Glu Thr Phe Ala His Glu Leu Ala Ser Ile Thr Leu Trp Met Gly Tyr
420 425 430
Phe Gln Trp Lys Arg Ala His Gly Gly His Trp Glu Thr Pro Ile Leu
435 440 445
Gln Arg Leu Asp Asn Ile Gln Asn Arg Asp Ala Leu Leu Asn Pro Asp
450 455 460
Gly Thr Glu Ala Thr Trp Pro Arg Ala Asp Phe Ile Val Gly Asn Pro
465 470 475 480
Pro Phe Leu Gly Asp Lys Met Met Arg Ser Gln Leu Gly Glu Ala Tyr
485 490 495
Thr Thr Gln Leu Arg Glu Thr Phe Lys Asp Arg Leu Pro Gly Gln Ser
500 505 510
Asp Leu Val Cys Tyr Trp Pro Glu Lys Ala Arg Ala Leu Ile Glu Ala
515 520 525
Gly Val Thr Thr Arg Ala Gly Phe Val Thr Thr Asn Ser Ile Arg Gly
530 535 540
Gly Lys Asn Arg Val Val Leu Glu Arg Ile Lys Ala Thr Gly Asp Leu
545 550 555 560
Phe Met Ala Trp Pro Asp Glu Pro Trp Gln Gln Asn Gly Ala Ala Val
565 570 575
Arg Val Ser Leu Phe Gly Phe Asp Asn Gly Thr Glu Thr Leu Arg Thr
580 585 590
Leu Asn Asp Gly His Val Gly Val Ile Asn Ala Asp Leu Asn Ala Gly
595 600 605
Thr Asp Val Lys Gln Ala Gln Lys Leu Pro Glu Asn Ala Gly Val Ser
610 615 620
Phe Ile Gly Thr Gln Lys Gly Gly Ala Phe Asp Ile Pro Gly Asp Leu
625 630 635 640
Ala Arg Ser Trp Leu Ser Val Pro Asn Pro Asp Arg Val Ser Asn Ala
645 650 655
Asp Val Leu Lys Pro Trp Val Asn Gly Met Asp Leu Thr Arg Arg Pro
660 665 670
Ser Gly Arg Trp Ile Ile Asp Phe Ala Gln Met Asp Glu Gly Glu Ala
675 680 685
Arg Gln Tyr Leu Gln Pro Met Ala Tyr Val Glu Gln Lys Ile Arg Pro
690 695 700
Glu Arg Ala Thr Asn Ser Asp Arg Pro Ser Arg Glu Arg Trp Trp Leu
705 710 715 720
His Gln Arg Ser Arg Pro Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ile Glu Leu Asp
725 730 735
Arg Phe Ile Gly Ile Pro Arg Val Ala Lys His Leu Leu Pro Val Trp
740 745 750
Leu Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Ser Gln Val Val Val Ile Ala Arg
755 760 765
Asp Asp Asp Phe Ile Phe Gly Val Leu Ala Ser Thr Ile His Arg Ser
770 775 780
Trp Ala Arg Met Gln Gly Thr Tyr Met Gly Val Gly Asn Asp Leu Arg
785 790 795 800
Tyr Thr Pro Ser Thr Cys Phe Glu Thr Phe Pro Val Pro Ala Pro Thr
805 810 815
Asp Glu Gln Arg Ala Glu Ile Glu Lys Trp Ala Lys Tyr Ile Val Gln
820 825 830
Leu Arg Glu His Leu Leu Asn Gln Asp Ala Lys Gly Thr Leu Thr Gly
835 840 845
Ile Tyr Asn Gln Leu Glu Lys Leu Arg Asn Ser Pro Asp Ala Ala His
850 855 860
Pro Val Ser Ala Leu Ala Thr Ala His Asp Lys Leu Asp Gln Ala Val
865 870 875 880
Ala Thr Ala Tyr Gly Trp Glu Trp Pro Leu Asn Glu Asp Gln Val Leu
885 890 895
Glu Arg Leu Leu Ala Leu Asn Leu Glu Arg Cys Pro Ala
900 905
<210>14
<211>955
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>GenBank號(hào)gi|15807258|ref|NP_295988.1
<220>
<221>misc_feature
<222>(920)..(920)
<223>Xaa可以是任何天然發(fā)生的氨基酸
<400>14
Met Pro Gln Thr Glu Thr Ala Gln Arg Met Glu Asp Phe Val Ala Tyr
1 5 10 15
Trp Arg Thr Leu Lys Gly Asp Glu Lys Gly Glu Ser Gln Val Phe Leu
20 25 30
Asp Arg Leu Phe Gln Ala Phe Gly His Ala Gly Tyr Lys Glu Ala Gly
35 40 45
Ala Glu Leu Glu Tyr Arg Val Ala Lys Gln Gly Gly Gly Lys Lys Phe
50 55 60
Ala Asp Leu Leu Trp Arg Pro Arg Val Leu Ile Glu Met Lys Lys Arg
65 70 75 80
Gly Glu Lys Leu Ala Asn His Tyr Gln Gln Ala Phe Asp Tyr Trp Leu
85 90 95
Lys Leu Val Pro Asp Arg Pro Arg Tyr Ala Val Leu Cys Asn Phe Asp
100 105 110
Glu Leu Trp Val Tyr Asp Phe Asn Gln Gln Leu Asp Glu Pro Met Asp
115 120 125
Arg Leu Arg Ile Glu Glu Leu Pro Glu Arg Tyr Thr Val Leu Asn Phe
130 135 140
Met Phe Glu Gln Glu Arg Ala Pro Leu Phe Gly Asn Asn Arg Val Asp
145 150 155 160
Val Thr Arg Glu Ala Ala Asp Ser Val Ala Lys Val Leu Asn Ser Val
165 170 175
Ile Ala Arg Gly Glu Asp Arg Ala Arg Ala Gln Arg Phe Leu Leu Gln
180 185 190
Cys Val Met Ala Met Phe Ala Glu Asp Phe Glu Leu Ile Pro Arg Gly
195 200 205
Phe Phe Thr Glu Leu Ala Asp Asp Ala Arg Ala Gly Arg Gly Ser Ser
210 215 220
Phe Asp Leu Phe Gly Gly Leu Phe Arg Gln Met Asn Thr Ser Glu Arg
225 230 235 240
Ala Arg Gly Gly Arg Phe Ala Pro Ile Pro Tyr Phe Asn Gly Gly Leu
245 250 255
Phe Arg Ala Val Asp Pro Ile Glu Leu Asn Arg Asp Glu Leu Tyr Leu
260 265 270
Leu His Lys Ala Ala Leu Glu Asn Asn Trp Ala Arg Ile Gln Pro Gln
275 280 285
Ile Phe Gly Val Leu Phe Gln Ser Ser Met Asp Lys Lys Glu Gln His
290 295 300
Ala Lys Gly Ala His Tyr Thr Ser Glu Ala Asp Ile Met Arg Val Val
305 310 315 320
Leu Pro Thr Ile Val Thr Pro Phe Gln Arg Gln Ile Glu Ala Ala Thr
325 330 335
Thr Gln Lys Glu Leu Arg Ala Ile Leu Asp Glu Leu Ala Ser Phe Gln
340 345 350
Val Leu Asp Pro Ala Cys Gly Ser Gly Asn Phe Leu Tyr Val Ala Tyr
355 360 365
Arg Glu Leu Arg Arg Leu Glu Ala Arg Ala Leu Leu Arg Leu Arg Asp
370 375 380
Leu Ser Ala Pro Gly Thr Ala Leu Pro Pro Ala Arg Val Ser Ile Arg
385 390 395 400
Gln Met His Gly Leu Glu Tyr Asp Pro Phe Gly Val Glu Leu Ala Lys
405 410 415
Val Thr Leu Thr Leu Ala Lys Glu Leu Ala Ile Arg Glu Met His Asp
420 425 430
Leu Leu Gly Asn Thr Gly Leu Asp Phe Asp Gln Pro Leu Pro Leu Asp
435 440 445
Asn Leu Asp Asp Arg Ile Val Gln Gly Asp Ala Leu Phe Thr Pro Trp
450 455 460
Pro Arg Val Asp Ala Ile Val Gly Asn Pro Pro Phe Gln Ser Lys Asn
465 470 475 480
Lys Leu Gln Arg Glu Met Gly Ala Ala Tyr Val Lys Lys Leu Arg Ala
485 490 495
His Tyr Pro Asp Val Pro Gly Arg Ala Asp Tyr Cys Val Tyr Trp Ile
500 505 510
Arg Lys Ala His Asp Gln Leu Gly Ser Gly Gln Arg Ala Gly Leu Val
515 520 525
Gly Thr Asn Thr Ile Arg Gln Asn Asp Ser Arg Val Gly Gly Leu Asp
530 535 540
Tyr Val Val Gln His Gly Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Gly Thr Gln
545 550 555 560
Val Trp Ser Gly Asp Ala Ala Val His Val Ser Ile Val Asn Trp Val
565 570 575
Lys Gly Pro Ala Glu Gly Pro Lys His Leu Ala Trp Gln Val Gly Asp
580 585 590
His Arg Thr Ser Pro Trp Gln Ser Thr Glu Leu Pro Val Ile Asn Ser
595 600 605
Ala Leu Ser Ala Gly Thr Asp Val Thr Gln Ala Gln Lys Leu Arg Val
610 615 620
Asn Met Asn Ser Gly Ala Cys Tyr Gln Gly Gln Thr His Gly His Lys
525 630 635 640
Gly Phe Leu Leu Asp Gly Leu Glu Ala Gly Gln ret Leu Ser Ala Glu
645 650 655
Arg Lys Asn Ala Glu Val Ile Phe Pro Tyr Leu Thr Gly Asp Glu Leu
660 665 670
Leu Arg Thr Ser Pro Pro His Pro Thr Arg Tyr Val Ile Asp Phe Gln
675 680 685
Pro Arg Asp Val Phe Gly Ala Arg Ala Tyr Lys Leu Pro Phe Ala Arg
690 695 700
lle Glu Arg Glu Val Leu Pro Thr Arg Gln Ala Ala Ala Ala Glu Glu
705 710 715 720
Glu Ala Arg Asn Ala Glu Val Leu Ala Ala Asn Pro Lys Ala Lys Thr
725 730 735
Asn Lys His His Arg Asn Phe Leu Asn Gln Trp Trp Ala Leu Ser Tyr
740 745 750
Gly Arg Ser Glu Met Ile Glu Lys Ile Ser Ser Leu Ser Arg Tyr Ile
755 760 765
Val Cys Ser Arg Val Thr Lys Arg Gln Val Phe Glu Phe Leu Asp Asn
770 775 780
Gly Ile Arg Pro Ser Asp Gly Leu Gln Ile Phe Ala Phe Glu Asp Asp
785 790 795 800
Tyr Ser Phe Gly Val Ile Gln Ser Ser Val His Trp Gln Trp Leu Ile
805 810 815
Ala Arg Gly Gly Thr Leu Thr Ala Arg Leu Met Tyr Thr Ser Asp Thr
820 825 830
Val Phe Asp Thr Phe Pro Trp Pro Asp Pro Thr Leu Ala Gln Val Arg
835 840 845
Ala Val Ala Ala Ala Ala Val Lys Leu Arg Glu Leu Arg Asn Lys Val
850 855 860
Met Arg Glu Gln Gly Trp Ser Leu Arg Asp Leu Tyr Arg Thr Leu Asp
865 870 875 880
Met Pro Gly Lys Asn Pro Leu Arg Asp Ala Gln Glu Arg Leu Asp Ala
885 890 895
Ala Val Ser Ala Ala Tyr Gly Leu Pro Ala Gly Ala Asp Met Leu Asp
900 905 910
Phe Leu Leu Ala Leu Asn Ala Xaa Val Ala Ala Ala Glu Ala Arg Gly
915 920 925
Ala Ala Val Thr Gly Pro Gly Leu Pro Ala Gly Leu Asn Thr Ala Asp
930 935 940
Phe Val Thr Ala Asp Ala Val Arg Pro Leu Gly
945 950 955
<210>15
<211>14
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>MmeI的前14個(gè)氨基端殘基
<400>15
Ala Leu Ser Trp Asn Glu Ile Arg Arg Lys Ala Ile Glu Phe
1 5 10
<210>16
<211>29
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>25kD肽的前29個(gè)殘基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>X＝Xaa(任何氨基酸)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>X＝Xaa(任何氨基酸)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(23)..(23)
<223>X＝Xaa(任何氨基酸)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>X＝Xaa(任何氨基酸)
<400>16
Met Lys Ile Ser Asp Glu Phe Gly Asn Tyr Phe Ala Arg Ile Pro Leu
1 5 10 15
Lys Ser Thr Xaa Xaa Ile Xaa Glu Xaa Asn Ala Leu Gln
20 25
<210>17
<211>40
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>由14kD片段獲得的前40個(gè)氨基酸殘基
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(36)..(36)
<223>X＝Xaa(任何氨基酸)
<400>17
Met Asp Ala Lys Lys Arg Arg Asn Leu Gly Ala His Tyr Thr Ser Glu
1 5 10 15
Ala Asn Ile Leu Lys Leu Ile Lys Pro Leu Leu Leu Asp Glu Leu Trp
20 25 30
Val Val Phe Xaa Lys Val Lys Asn
35 40
<210>18
<211>25
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>7.5kD肽的前25個(gè)殘基
<400>18
Met Lys Ser Arg Gly Lys Asp Leu Asp Lys Ala Tyr Asp Gln Ala Leu
1 5 10 15
Asp Tyr Phe Ser Gly Ile Ala Glu Arg
20 25
<210>19
<211>8
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>25kD片段引物
<400>19
Asp Glu Phe Gly Asn Tyr Phe Ala
1 5
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>正向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>R＝A或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Y＝T或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n是a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>Y＝T或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>Y＝T或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>Y＝T或C
<400>20
garttyggna aytayttygc 20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>反向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>R＝A或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>R＝A或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n是a.c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>R＝A或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>Y＝T或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>R＝A或G
<400>21
aartarttnc craaytcrtc 20
<210>22
<211>6
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>14kD片段引物
<400>22
Met Asp Ala Lys Lys Arg
1 5
<210>23
<211>17
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>正向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Y＝T或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n是a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>R＝A或G
<220>
<22I>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>R＝A或G
<400>23
atggaygcna araarcg 17
<210>24
<211>17
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>反向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Y＝T或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n是a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>R＝A或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>R＝A或G
<400>24
atggaygcna araarag 17
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>反向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>n是a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>Y＝T或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>Y＝T或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>n是a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>R＝A或G
<400>25
cgncgyttyt tngcrtccat 20
<210>26
<211>7
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>7.5kD片段引物
<400>26
Asp Lys Ala Tyr Asp Gln Ala
1 5
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>正向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Y＝T或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>R＝A或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>n是a，c，g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>Y＝T或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>Y＝T或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>R＝A或G
<400>27
gayaargcnt aygaycargc 20
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>反向引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Y＝T或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>R＝A或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>R＝A或G
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>n是a，c.g或t
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>Y＝T或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
<223>R＝A或G
<400>28
gcytgrtcrt angcyttrtc 20
<210>29
<211>26
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物IP 1
<400>29
gttggatccc gcacagattg ctcagg 26
<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物IP 2
<400>30
gttggatcct acgttaatct gaataagatg 30
<210>31
<211>28
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物IP 3
<400>31
gttggatcct gttaatctga aacgctgg 28
<210>32
<211>29
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物IP 4
<400>32
gttggatcct tataccaaaa tgtgaggtc29
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物IP 5
<400>33
ttcagaaata cgagcgatgc20
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物IP 6
<400>34
gtcaagccat aaacaccatc20
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物IP 7
<400>35
gagggtcaga aaggaagctg20
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物IP 8
<400>36
gtccaactaa ccctttatgg20
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物IP 9
<400>37
ttcctagtgc tgaacctttg20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物IP 10
<400>38
gttgcgttac ttgaaatgac20
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物IP 11
<400>39
ccaaaatgga acttgtttcg20
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物IP 12
<400>40
gtgagtgcgc cctgaattag 20
<210>41
<211>21
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物S1
<400>41
gcttcatttc atcctctgtg c 21
<210>42
<211>21
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物S2
<400>42
taaccgccaa aattaatcgt g 21
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>引物S3
<400>43
ccactattca ttacaacacc 20
<210>44
<211>43
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>與嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌(M.methyltrophus)DNA序列匹配的20個(gè)核苷酸
<400>44
gttctgcagt taaggataac atatggcttt aagctggaac gag43
<210>45
<211>37
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>與嗜甲醇營(yíng)養(yǎng)菌(M.methyltrophus)DNA序列匹配的22個(gè)核昔酸
<400>45
gttggatccg tcgacattaa ttaatttttg cccttag 37
<210>46
<211>48
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>寡聚核苷酸1
<400>46
gtttgaagac tccgacgcga tggccagcga tcggcgcctc agcttttg48
<210>47
<211>48
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>寡聚核昔酸2
<400>47
caaaagctga ggcgccgatc gctggccatc gcgtcggagt cttcaaac48
<210>48
<211>48
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>寡聚核昔酸3
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>A＝6-甲基腺嘌呤
<400>48
gtttgaagac tccgacgcga tggccagcga tcggcgcctc agcttttg48
<210>49
<211>48
<212>DNA
<213>未知
<220>
<223>寡聚核昔酸4
<220>
<221>misc_feature
<222>(38)..(38)
<223>A＝6-甲基腺嘌呤
<400>49
caaaagctga ggcgccgatc gctggccatc gcgtcggagt cttcaaac48
<210>50
<211>8
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>單個(gè)內(nèi)部CnBr消化片段
<400>50
Gly Arg Gly Arg Gly Val Gly Val
1 權(quán)利要求
1.分離的DNA，其編碼結(jié)合了內(nèi)切核酸酶活性和修飾活性的限制性酶，并具有編碼保守氨基酸基序的核苷酸序列，所述保守基序是(D/E)X8-X12(D/E)XK，并且此時(shí)，在利用圖3的氨基酸序列的Blast搜索中，所述編碼的氨基酸序列的期望值(e)分?jǐn)?shù)低于E＝e-10。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明，提供一種編碼重組Ⅱ型限制性內(nèi)切酶MmeI的DNA(脫氧核糖核酸)片段。這種酶具備兩種相關(guān)的酶學(xué)功能；一個(gè)是識(shí)別DNA序列5’-TCC(Pu)AC-3’的內(nèi)切酶活性，并在如箭頭標(biāo)記的地方剪切DNA5’-TCCRAC(N20)↓-3’和3’-AGGYTG(N18)↑-5’，另一個(gè)酶活性是識(shí)別同樣的DNA序列5’-TCC(Pu)AC-3’，但是通過增加甲基的方式來(lái)修飾該序列以防止MmeI內(nèi)切酶活性的剪切。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101693898SQ20091017407
公開日2010年4月14日 申請(qǐng)日期2003年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月12日
發(fā)明者R·D·摩根, T·巴蒂亞, T·戴維斯, L·洛沃什科 申請(qǐng)人:新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司