專利名稱：：一種制備枯草芽孢桿菌的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種制備枯草芽孢桿菌的方法。
背景技術：
：世界范圍每年全世界要生產農藥200多萬噸，其主要是化學農藥，長期使用化學農藥，病原物和害蟲易產生抗藥性，有些化學農藥已被^t實有致癌、致畸、致突變的問題，同時，化學農藥殘留也制約著農產品的質量。近年來，生物農藥迅速崛起。生物農藥是指以細菌、真菌、病毒、線蟲1960年代，其開發(fā)在1970年代曾掀起過高潮，但由于當時生物技術、手段、水平相對較低，生物農藥本身對工藝、貯藏、運輸要求又高，及隨后擬除蟲菊酯的崛起造成生物農藥的開發(fā)步入低潮。近年來，隨著人類對生存環(huán)境質量的要求越來越高，無公害、無污染、無殘留、成本低、且不易產生抗性的生物農藥又重新受到關注。生物技術尤其是4敖生物:技術的進步更為這類農藥的開發(fā)提供了便利。目前生物農藥銷售額達$3億，約占整個農藥市場的1%,且年產值每年上升10%~20%。其中，微生物農藥是公認的"無公害農藥"，防治對象不易產生抗藥性、不傷害天敵，繁殖快，是綜合防治農林病蟲害的主要手段。隨著全球化學農藥公害問題日趨嚴重，近年來的微生物農藥研究備受重視。對枯草芽孢桿菌的研究應用也成熱點。枯草芽孢桿菌，英文名(&ci]2ussubm")，是芽孢桿菌屬的一種。因廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。它通過營養(yǎng)竟爭進行生長繁殖從而占據生存空間的方式來阻止植物病原菌的生長，能在植物表面迅速形成一層高密保護膜，使病原菌得不到生存空間，從而保護作物免受病原菌危害；枯草芽孢桿菌菌體生長過程中產生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質，抑制病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長，從而達到預防與治療的目的?？捎糜诠卟『Α?分病、灰霉病、水稻稻痘病、香蕉葉斑病、橡膠樹白粉病和炭疽病等多種作物種傳和土傳病害。因該制劑防病機理獨特，以菌治菌，所以可用于多種作物病害的防治，均收到優(yōu)異的效果。目前，市場上常見的是枯草芽孢桿菌可濕性粉劑，多用常規(guī)發(fā)酵方法如液體深度發(fā)酵制備，即只采用液體培養(yǎng)基對微生物進行培養(yǎng)繁殖，之后經過過濾、干燥等工藝得到枯草芽孢桿菌母粉，其含枯草芽孢桿菌孢子數大多為200億個活芽孢/克，用于防治農作物病蟲害用量大，成本高。
發(fā)明內容本發(fā)明針對現(xiàn)有技術制備的枯草芽孢桿菌可濕性粉劑中孢子數太少的缺陷，提出一種新的制備枯草芽孢桿菌的方法。該方法制備的枯草芽孢桿菌孢子數可達1x10"個活芽孢/克以上。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術方案一種制備枯草芽孢桿菌的方法，包括以下步驟步驟1:將第一液體培養(yǎng)基調pH值為6.5~7.5，高溫滅菌后冷卻至室溫，接種活化的枯草芽孢桿菌菌種，培養(yǎng)2040小時，得液體菌種備用；步驟2:將第二液體培養(yǎng)基高溫滅菌后冷卻至室溫，按培養(yǎng)基體積的3%接種步驟l所得液體菌種，攪拌并通氣，在無菌狀態(tài)培養(yǎng)2435小時，得種子液備用；步驟3:將麩皮60%-70%、稻草粉20%-30%、玉米粉10%-20°/。混合均勻配制成固體培養(yǎng)基，經高溫滅菌后，降溫至室溫，在無菌狀態(tài)接種步驟2所得種子液并進行培養(yǎng)；步驟4:將步驟3的培養(yǎng)基在無菌狀態(tài)進行固體發(fā)酵培養(yǎng)72~90小時，干燥后，即得到本發(fā)明所述高濃度枯草芽孢桿菌。步驟1所述第一液體培養(yǎng)基優(yōu)選為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基或牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基，步驟1中最佳培養(yǎng)溫度為28~30°C。步驟2所述通氣的通氣量優(yōu)選為1:1。步驟2所述第二液體培養(yǎng)基為培養(yǎng)細菌的常規(guī)培養(yǎng)基，如玉米粉大豆粉培養(yǎng)基或玉米粉大豆粉葡萄糖培養(yǎng)基，所述玉米粉大豆粉培養(yǎng)基中玉米粉與大豆粉重量比l:2-3，所述玉米粉大豆粉葡萄糖培養(yǎng)基中玉米粉大豆粉葡萄糖的重量比為1:2:1。步驟2中接種濃度優(yōu)選為0.6x109個芽孢/毫升。步驟2中最佳培養(yǎng)pH值為7.5~8.5。步驟3的接種量優(yōu)選為培養(yǎng)基重量的3%~10%。步驟4所述干燥優(yōu)選在室溫或低溫進行。步驟1得到的液體菌種中活芽孢濃度約為1.Oxl(T個活芽孢/毫升。本發(fā)明所述方法采用液固兩相聯(lián)合發(fā)酵工藝，即在液體中培養(yǎng)種子液，達到適宜濃度后再接種到固體培養(yǎng)基上，無需過濾步驟，接種過程在發(fā)酵罐內完成，不接觸外界環(huán)境，不易污染，得到的母粉易于加工和保存，制備的枯草芽孢桿菌含量約1x1()H個活芽孢/克。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明還具有以下特點1.生產工藝簡單，無三廢。2.裝置投資少，生產成本低，僅為液體深度發(fā)酵的三分之一。3.生產過程節(jié)能，無脫水、噴霧、干燥過程，能量消耗低。4.發(fā)酵過程中所產生的抗菌物仍保留在粉體中，有助于枯草芽孢桿菌防治蟲害。下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。實施例1:菌種培養(yǎng)按配方配制馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基，調整pH值為7.5,分裝入6個500mL三角瓶中，每瓶100mL,121。C滅菌30分鐘，冷卻至室溫。取枯草芽孢桿菌菌種，用接種環(huán)自斜面試管培養(yǎng)基菌種中，挑^^一環(huán)，接種到三角瓶中，置200轉/分搖床上，28。C培養(yǎng)40小時，顯微鏡鏡檢，菌種生長旺盛，無雜菌形態(tài)，濃度為lXl(T個活芽孢/毫升，備用。種子罐培養(yǎng)種子罐容積為200升，按玉米粉大豆粉水的重量比為1:2:150配制玉米粉大豆粉培養(yǎng)基120升，調整pH值為7.5,120~13(TC蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至室溫，經鏡檢正常后，在火焰保護接種1.2升液體菌種，接種濃度為0.6xl(T個芽孢/毫升，在28。C培養(yǎng)24小時，進氣量為1:1,取樣，鏡檢菌體生長情況，菌體生長旺盛，無雜菌，濃度為活芽孢約lx101。個/毫升，待用。固體高溫滅菌接種罐接種罐容積為2000升，按配方麩皮63%,稻草粉23%,玉米粉14%配制培養(yǎng)基。將上述固體培養(yǎng)基裝罐，裝料系數為60%,開啟攪拌，通過螺旋槳葉的軸向混合，使固體培養(yǎng)基混合均勻，通蒸汽滅菌，溫度125。C,保溫30分鐘，降溫至35。C。將種子罐種子懸浮液按接種量要求放入接種罐中，開啟攪拌，使液體種子液和固體培養(yǎng)基充分混合潤濕，完成接種。固體發(fā)酵培養(yǎng)將接種好的固體培養(yǎng)基放入專用托盤中，移至固體培養(yǎng)室(經過化學滅菌或紫外滅菌)，調整培養(yǎng)室的溫度為35°C,并開啟排風設備，培養(yǎng)三天。即得到高濃度的枯草芽孢桿菌，測定芽孢數在1.2xl0"個活芽孢/克。實施例2:菌種培養(yǎng)按配方配制牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基，調整pH值為7.0，分裝入6個500mL三角瓶中，每瓶100mL，125。C滅菌30分鐘，冷卻至室溫。取BS-0898菌種，用接種環(huán)自斜面試管培養(yǎng)基菌種中，挑取一環(huán)，接種到三角瓶中，置200轉/分搖床上，28。C培養(yǎng)20小時，顯微鏡鏡檢，菌種生長旺盛，無雜菌形態(tài)，備用。種子罐培養(yǎng)容積為200升，按玉米粉大豆粉水重量比1:3:200配制玉米粉大豆粉培養(yǎng)基120升，調整pH值為8.5，12013(TC蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至室溫，經鏡檢正常后，在火焰保護接種1.2升液體菌種，接種濃度為0.6x109個芽孢/毫升，在3(TC培養(yǎng)30小時，進氣量為1:1,取樣，鏡檢菌體生長情況，菌體生長旺盛，無雜菌，待用。固體高溫滅菌接種罐接種罐容積為2000升，按配方麩皮60°/。，稻草粉20%,玉米粉20。/。配制固體培養(yǎng)基。將上述固體培養(yǎng)基裝罐裝料數60%，開啟攪拌，通過螺旋槳葉的軸向混合，使固體培養(yǎng)基混合均勻，通蒸汽滅菌，溫度125。C,保溫30分鐘，降溫至35。C。將種子罐種子懸浮液按接種量要求放入接種罐中，開啟攪拌，使液體種子液和固體培養(yǎng)基充分混合潤濕，完成接種。固體發(fā)酵培養(yǎng)將結種子的固體培養(yǎng)基放入專用托盤中，移至固體培養(yǎng)室(經過化學滅菌或紫外滅菌)，調整培養(yǎng)室的溫度為35°C，并開啟排風設備，培養(yǎng)78小時。干燥，粉碎固體發(fā)酵的粉體，即得到高濃度的枯草芽孢桿菌，測定芽孢數在1.1x1()U個活芽孢/克。實施例3:菌種培養(yǎng)按配方配制液體牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基，調整pH值為6.5,分裝入6個500mL三角瓶中，每瓶100mL，121。C滅菌30分鐘，冷卻至室溫。取枯草芽孢桿菌菌種，用接種環(huán)自斜面試管培養(yǎng)基菌種中，挑取一環(huán)，接種到三角瓶中，置200轉/分搖床上，3(TC培養(yǎng)々0小時，顯微鏡鏡4企，菌種生長旺盛，無雜菌形態(tài)，備用。種子罐培養(yǎng)種子罐容積為200升，按重量比玉米粉大豆粉葡萄糖水為1:2:1:200配制玉米粉大豆粉葡萄糖培養(yǎng)基120升，調整pH值為7.8,12013(TC蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至室溫，經鏡檢正常后，在火焰保護接種1.2升液體菌種，接種濃度為0.6x109個芽孢/毫升，在28。C培養(yǎng)26小時，進氣量為l:1,取樣，鏡纟企菌體生長情況，菌體生長旺盛，無雜菌，待用。固體高溫滅菌接種罐接種罐容積為2000升，按配方麩皮60%,稻草粉25%,玉米粉15%配制培養(yǎng)基。將上述固體培養(yǎng)基裝罐，裝料系數為60%,開啟攪拌，通過螺旋槳葉的軸向混合，使固體培養(yǎng)基混合均勻，通蒸汽滅菌，溫度125。C,保溫30分鐘，降溫至35。C。將種子罐種子懸浮液按接種量要求放入接種罐中，開啟攪拌，使液體種子液和固體培養(yǎng)基充分混合潤濕，完成接種。固體發(fā)酵培養(yǎng)將接種好的固體培養(yǎng)基放入專用托盤中，移至固體培養(yǎng)室(經過化學滅菌或紫外滅菌)，調整培養(yǎng)室的溫度為35°C，并開啟排風設備，培養(yǎng)80小時。即得到高濃度的枯草芽孢桿菌，測定芽孢數在1.2x1011個活芽孢/克。實施例4:菌種培養(yǎng)按配方配制馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，調整pH值為6.8，分裝入6個500mL三角瓶中，每瓶100mL，121。C滅菌35分鐘，冷卻至室溫。取BS-0898菌種，用接種環(huán)自斜面試管培養(yǎng)基菌種中，挑取一環(huán)，接種到三角瓶中，置200轉/分搖床上，30。C培養(yǎng)20小時，顯微鏡鏡檢，菌種生長旺盛，無雜菌形態(tài)，備用。種子罐培養(yǎng)容積為200升，按玉米粉大豆粉葡萄糖水的重量比為1:2:1:200配制玉米粉大豆粉葡萄糖培養(yǎng)基120升，調整pH值為7.5,120~130。C蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至室溫，經鎮(zhèn):4企正常后，在火焰保護接種1.2升液體菌種，接種濃度須為0.6x109個芽孢/毫升，在3(TC培養(yǎng)35小時，進氣量為1:1,取樣，鏡檢菌體生長情況，菌體生長旺盛，無雜菌，待用。固體高溫滅菌接種罐接種罐容積為2000升，按配方麩皮65%,稻草粉25%,玉米粉10。/。配制固體培養(yǎng)基。將上述固體培養(yǎng)基裝罐裝料數60°/。，開啟攪拌，通過螺旋槳葉的軸向混合，使固體培養(yǎng)基混合均勻，通蒸汽滅菌，溫度125。C,保溫30分鐘，降溫至35t:。將種子罐種子懸浮液按接種量要求放入接種罐中，開啟攪拌，使液體種子液和固體培養(yǎng)基充分混合潤濕，完成接種。固體發(fā)酵培養(yǎng)將結種子的固體培養(yǎng)基^:入專用托盤中，移至固體培養(yǎng)室(經過化學滅菌或紫外滅菌)，調整培養(yǎng)室的溫度為35°C，并開啟排風設備，培養(yǎng)90小時。千燥，粉碎固體發(fā)酵的粉體，即得到高濃度的枯草芽孢桿菌，測定芽孢數在1.3x10"個活芽孢/克。實施例5:菌種培養(yǎng)按配方配制馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，調整pH值為7.2,分裝入6個500mL三角弁瓦中，每并瓦100mL,130。C滅菌40分鐘，冷卻至室溫。取BS-0898菌種，用接種環(huán)自斜面試管培養(yǎng)基菌種中，挑取一環(huán)，接種到三角瓶中，置200轉/分搖床上，29。C培養(yǎng)20小時，顯微鏡鏡檢，菌種生長旺盛，無雜菌形態(tài)，備用。種子罐培養(yǎng)容積為200升，按玉米粉大豆粉水的重量比1:2.5:175配制玉米粉大豆粉培養(yǎng)基120升，調整pH值為7.5，120~13(TC蒸汽滅菌30分鐘，冷卻至室溫，經鏡檢正常后，在火焰保護接種1.2升液體菌種，接種濃度須為0.6x109個芽孢/毫升，在3(TC培養(yǎng)32小時，進氣量為1:1，取樣，鏡檢菌體生長情況，菌體生長旺盛，無雜菌，待用。固體高溫滅菌接種罐接種罐容積為2000升，按配方麩皮70%，稻草粉20%,玉米粉10%配制固體培養(yǎng)基。將上述固體培養(yǎng)基裝罐裝料數60%，開啟攪拌，通過螺旋槳葉的軸向混合，使固體培養(yǎng)基混合均勻，通蒸汽滅菌，溫度125。C,保溫3Q分鐘，降溫至35°C。將種子罐種子懸浮液按接種量要求放入接種罐中，開啟攪拌，使液體種子液和固體培養(yǎng)基充分混合潤濕，完成接種。固體發(fā)酵培養(yǎng)將結種子的固體培養(yǎng)基放入專用托盤中，移至固體培養(yǎng)室(經過化學滅菌或紫外滅菌)，調整培養(yǎng)室的溫度為35°C,并開啟排風設備，培養(yǎng)三天。干燥，粉碎固體發(fā)酵的粉體，即得到高濃度的枯草芽孢桿菌，測定芽孢數在1.2x10"個活芽孢/克。實施例6:本發(fā)明所述方法制備的枯草芽孢桿菌的檢測檢測方法為常規(guī)的微生物定量測定方法，詳述如下(1)鑒別試驗將制備的枯草芽孢桿菌在32。C培養(yǎng)24h后，菌落直徑l-2mm，菌落為乳白色或微黃色，粘稠，圓形，不透明，表面粗糙，有褶皺，無光澤，邊緣不整齊，中央顏色深于邊緣部分。挑去單菌落進行革蘭氏染色后鏡;險，菌抹為革蘭氏陽性，有鞭毛，有芽孢，芽孢呈橢圓或柱狀，多為兩端均勻染色，具備典型的枯草芽孢桿菌菌落特征，則證實為枯草芽孢桿菌活芽孢。(2)定量測定試驗方法提要利用稀釋平板法，將稀釋后芽孢懸浮液定量接種于培養(yǎng)基中，待枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)基內長出菌落，計數菌落數，以測定樣品的單位重量芽孢數。試劑和溶液1)牛肉膏；2)蛋白胨；3)瓊脂，生化試劑；4)氯化鈉，分析純；5)蒸餾水。儀器1)培養(yǎng)皿直徑90mm,高16mm~17mm,底部應完全平底的雙石乘；2)量筒100mL;3)玻璃試管18mmxl80mm;—4)移液管lmL;5)三角并瓦200mL;6)玻璃珠5號；7)超聲波振蕩器；8)恒溫水浴鍋；9)恒溫箱；10)滅菌鍋。培養(yǎng)基及制備方法細菌培養(yǎng)基(LB):稱取胰蛋白胨10g,酵母膏5g,瓊脂15g,蒸餾水IOOOmL?；旌铣傊獾纳鲜銎渌煞荩{節(jié)pH值比最終的pH值高O.2~0.4,加入瓊脂，調節(jié)pH值，滅菌后pH值為7.4~7.5，在115。C12rC滅菌30min。枯草芽孢桿菌懸液的制備精確稱取樣品lg(精確至G.00Q2g),按無菌操作法放入裝有25粒5號玻璃珠的三角燒瓶(250mL)中，量取無菌蒸餾水lOOmL加入三角燒瓶(250mL),塞上棉花塞，于超聲波振蕩器振蕩20min后靜止片刻，即為10—2芽孢懸浮液(第一次稀釋)，吸取上述10—2芽孢懸浮液1.OmL，注入第2個帶同樣玻璃珠的三角燒瓶(250mL)中，加99mL無菌蒸餾水，塞上棉花塞，同上振蕩20min，即l(T芽孢懸浮液(第二次稀釋)；依此稀釋至10—9芽孢懸浮液。另外從10—9芽孢懸浮液中吸取1.0mL注入18mmxl80mm的試管，力口9.OmL的無菌蒸餾水，搖勻，10—9和10—"兩種芽孢懸浮液平衡比較用。測定步驟將加熱融化并冷卻至50。C左右的培養(yǎng)基，放在水浴鍋內52。C保溫待用，將1(T和10—"兩種芽孢懸浮液，按無菌搡作各吸取l.OmL注入滅菌過的培養(yǎng)皿，每種濃度重復5個培養(yǎng)皿。分別注入融化的培養(yǎng)基20mL,當培養(yǎng)基倒入含有菌液的培養(yǎng)皿后，立即迅速旋轉，-使充分混合攤布均勻，；改置30min,制成平板，倒置于32。C恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3d,待長出菌落時，取出平板，進行鑒別試驗及結果計算。菌落計數及結果計算對平板上的枯草芽孢桿菌菌落數進行計數，將計數平均結果按下列公式計算。供檢樣品的成菌單位CFU(個/g)按式(1)計算CFU=sxh式中CFU—lg菌劑所含成菌落單位(相當于芽孢個數)，個/g;s—同稀釋后5個培養(yǎng)皿的菌落平均數，個；h:—樣品的稀釋倍數；計算求出CFU，即為供檢測樣品成菌但為數。允許誤差兩次平行測定結果之相對差，應不大于5，0%，取其算術平均值作為測定結果。pH值的測定pH值的測定按GB/T1601進行。水分按GB/T1600中的卡爾.費休法進行。固體不溶物試驗按HG/T2467.1-2003中4.6進行測定。產品的檢驗及驗收符合GB/T1604的有關規(guī)定。極限數值的處理，采用修約值比較法。檢測結果如表l、表2所示。表l、本發(fā)明制備的枯草芽孢桿菌項目指標<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2、本發(fā)明實施例所制備的枯草芽孢桿菌檢測數據<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例7:本發(fā)明所述方法制備的枯草芽孢桿菌的藥效試驗于2008年7-8月在海南省文昌市進行200億活芽孢/克枯草芽孢桿菌可濕性粉劑的田間藥效試驗，通過葉面噴霧本發(fā)明實施例1制備的枯草芽孢桿菌防治水稻稻疸病(穗莖瘟)，共施藥兩次，施藥制劑量為900克/公項，1200克/公項、1500克/公項。藥前發(fā)病率分別為0.67%、0.78%、0.80%,病情指數分別為0.07、0.09、0.09。第二次施藥后14天調查，發(fā)病率分別為3.45%、2.60%、1.98%，病情指數分別為0.71、0.29、0.22，空白對照的發(fā)病率為15.10%,病情指數為6.23，該藥劑防效達到88.60%、95.34%、96.46%。參照上述試驗方案，同年在廣東省和湖北省對實施例2-5制備的枯草芽孢桿菌進行的田間藥效試-驗，防效均達到80%以上，增產率達到7.60°/。。權利要求1、一種制備枯草芽孢桿菌的方法，包括以下步驟步驟1將第一液體培養(yǎng)基調pH值為6.5～7.5，高溫滅菌后冷卻至室溫，接種活化的枯草芽孢桿菌菌種，培養(yǎng)20～40小時，得液體菌種備用；步驟2將第二液體培養(yǎng)基高溫滅菌后冷卻至室溫，按培養(yǎng)基體積的3％接種步驟1所得液體菌種，攪拌并通氣，在無菌狀態(tài)培養(yǎng)24～35小時，得種子液備用；步驟3將麩皮60％-70％、稻草粉20％-30％、玉米粉10％-20％混合均勻配制成固體培養(yǎng)基，經高溫滅菌后，降溫至室溫，在無菌狀態(tài)接種步驟2所得種子液并進行培養(yǎng)；步驟4將步驟3的培養(yǎng)基在無菌狀態(tài)進行固體發(fā)酵培養(yǎng)72～90小時，干燥后，即得到本發(fā)明所述高濃度枯草芽孢桿菌。2、根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟1所述第一液體培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基或牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基。3、根據權利要求l所述方法，其特征在于，步驟1至4所述培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為28°C~30°C。4、根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟2所述通氣的通氣量為1:1~1.5。5、根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟2所述第二液體培養(yǎng)基的配方為玉米粉大豆粉水的重量比為1:2-3:150-200,或玉米粉大豆粉葡萄糖水的重量比為1:2:1:200。6、按照權利要求1所述方法，其特征在于，步驟2中所述接種濃度為0.6xl(T個芽孢/毫升。7、按照權利要求1所述方法，其特征在于，步驟3的接種量為所述培養(yǎng)基重量的3%~10%。8、按照權利要求1所述方法，其特征在于，步驟4所述干燥在0°O50'c進行。9、按照權利要求l所述方法，其特征在于，步驟l-3中所述高溫滅菌為120130。C滅菌30-40分鐘。全文摘要本發(fā)明公開一種制備枯草芽孢桿菌的方法，采用液固兩相聯(lián)合發(fā)酵工藝，即在液體中培養(yǎng)種子液，達到適宜濃度后再接種到固體培養(yǎng)基上，無需過濾步驟，不易污染，制備的枯草芽孢桿菌濃度在1×10¹¹個活芽孢/克以上。本發(fā)明所述方法步驟簡單，裝置投資少，生產成本低，無三廢。本發(fā)明所述方法制備的枯草芽孢桿菌濃度高，病蟲害防治效果好，可應用于防治水稻稻瘟病、蔬菜灰霉病、白粉病、橡膠樹白粉病，具有良好的應用前景。文檔編號C12N1/20GK101654665SQ200910175148公開日2010年2月24日申請日期2009年9月23日優(yōu)先權日2009年9月23日發(fā)明者勇劉,劉國忠,張潔巖,新李申請人:海南利蒙特生物農藥有限公司