專利名稱：：醛脫氫酶基因的制作方法醛脫氫酶基因本發(fā)明涉及從GluconobacteroxydansDSM4-025屮獲得的編碼醛脫氫酶的新的DNA、含心所述DNA的表達(dá)載體和含有所述表達(dá)載體的重組微生物。此外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)重組醛脫氫酶蛋白質(zhì)的方法，以及用重組醛脫氫酶蛋白質(zhì)或者用含有所述表達(dá)載體的重組微牛物從L-山梨糖酮來牛產(chǎn)L-抗壞血酸(維牛素C)和/或2-酮基-L-古洛糖酸(2-keto-L-guionicacid,2-KGA)的方法。維生素C是人類必不可少的營養(yǎng)因子之.、通過Roichstoin方法，人們已對(duì)其進(jìn)行了大約60年的商業(yè)合成。合成的維生素C還可用于動(dòng)物飼料，即使畜牧動(dòng)物能在體內(nèi)合成維生素C。雖然所述的Reichstein方法對(duì)維生素C的工業(yè)生產(chǎn)來說有許多的優(yōu)點(diǎn)，但其仍然有一些人們不欲看到的問題,例如，能量消耗過高以及其屮使ltj了相當(dāng)大的量的有機(jī)溶劑和無機(jī)溶劑。因此，在過去的數(shù)十年中，人們已研究了多種通過用酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化來制造維生素C的方法，這些方法更為經(jīng)濟(jì)、環(huán)保。本發(fā)明涉及經(jīng)過分離的編碼醛脫氫酶的核酸分子，所述核酸分子包含與SEQIDNO:1的核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸。本文中使用的"SNDH"表示醛脫氫酶(aldehydedohydrogonaso)。木文巾使用的"核酸分子"包括DNA和RNA，除非另有指明，其包括雙鏈核酸分子、單鏈核酸分子以及它們的核苷。其中還包括雜交體，例如DNA-RNA雜交體、DNA-RNA-蛋白質(zhì)雜交體、RNA蛋白質(zhì)雜交體和DM-蛋白質(zhì)雜交體。本文中使用的"突變"指在目標(biāo)核-伊酸序列中的單個(gè)堿基對(duì)的改變、插入或缺失。本文中使用的"誘變"表不在DM中產(chǎn)生突變的方法。"隨機(jī)"誘變后，突變的具體位置是不確定的，其可能發(fā)牛于微牛物染色休上的仟何位置，所述突變是化學(xué)處理或輻射等手段所導(dǎo)致的物理損傷的結(jié)果。本文中使用的"啟動(dòng)子"指-殺DNA序列，其通常被描述為基因的5'區(qū)域，處丁'鄰近起始密碼子的位置。其鄰近基岡的轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子區(qū)域得以起始。如果啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，那么所述轉(zhuǎn)錄的速率能響應(yīng)誘導(dǎo)劑而增加。相反，如果啟動(dòng)子是組成性啟動(dòng)子的話，那么所述轉(zhuǎn)錄的速率則不受誘導(dǎo)劑的調(diào)控。本文中使用的"百分比相同(percentidentical)"指與作為比較的核苷酸或氨基酸序列中的相同核苷酸或氨基酸相匹配的核苷酸或氨基酸在目標(biāo)核苷酸或氨基酸序列中所占的百分比，所述比較是通過后面例舉的序列分析程序來進(jìn)行的。本發(fā)明包括經(jīng)過分離的編碼醛脫氫酶的核酸分子,所述核酸分子包含一段多核苷酸，所述多核苷酸與選自由(a)SEQIDN0:1中第258-2084位核苷酸、(b)SEQIDNO:1中第351-2084位核苷酸、(c)SEQIDNO:1中第258-1955位核苷酸和(d)SEQIDNO:1.中第351-1955位核苷酸所構(gòu)成的組的多核苷酸至少95%相同。在本發(fā)明的另一個(gè)方面,提供了經(jīng)過分離的編碼醛脫氫酶的核酸分子，所述核酸分子包含選自由(a)編碼叮"SEQIDN0:2中氨基酸序列的多肽的多核-皆酸、(b)編碼由SEQIDN():2中第32-6()9位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核苷酸、(c)編碼tilSEQIDNO:2中第i-566位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核苷酸和(d)編碼由SEQIDNO:2中第32-566位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核-皆酸所構(gòu)成的組的多核苷酸。本發(fā)明中還包括如下蛋O質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有SND:H活性，并且是通過在....匕述氨基酸序列中取代、缺失、插入或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸從上述蛋白質(zhì)得到的。作為本發(fā)明的另一個(gè)方面，功能衍生物被定義為在本發(fā)明氨基酸序列的基礎(chǔ)上，通過增加、插入、缺失和/或取代此類序列中的-^個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而獲得的，其中，此類衍生物仍然具有SNDH活性，這可用木領(lǐng)域內(nèi)已知的或木文中特別描述的檢測(cè)方法檢測(cè)出來。此類功能衍生物可以通過本領(lǐng)域內(nèi)己知的化學(xué)肽合成方法來制造，或者可以依靠現(xiàn)有技術(shù)屮已知的方法在本文公布的:[)NA序列的基礎(chǔ)上通過歪組手段來制得。在蛋白質(zhì)和肽中進(jìn)行的大體上不改變此類分子活性的氨基酸交換在現(xiàn)丫]技術(shù)中是己知的。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，nj以發(fā)生如K感興趣的保守替代不例性替代，Ala到Val/Leu/Ile、Arg到Lys/Gln/Asn、Asn到Gln/His/Lys/Arg、Asp到Glu、Cys到Ser、Gln到Asn、(;Iu到Asp、(;ly到Pro/Ala、His到Asn,/GIn/Lys/Arg、He到Leu/Vai/Met/AIa/Phe/norLcu、Lys到Arg'/Gln/Asn、Mct到Lou/Pho/Ilo、Pho到Lou/ValZllo,/Ala,/Tyr、Pro到Ala、Ser到Thr、Thr到Ser、Trp到Tyr/Phe、Tyr到Trp/:Phe/Thr/Ser和Val到]:le/Leu/Met/Phe/Ala/norLeu是可行的。Ala到Val、Arg到Lys、Asn到Gln、Asp到Glu、Cys到Ser、Gln到Asn、Glu到Asp、Gly到Ala、:His到Arg、:[le到Leu、Leu到:[le、Lys到Arg、Met到Leu、Phe至ULeu、Pro至UAla、Ser至UThr、Thr至USer、Trp至UTyr、Tyr至UPhe禾UVal至ULeu的替代作為優(yōu)選的例了是nj行的。如果此類替代導(dǎo)致了生物活性的改變,那么，til上述不例性替代引起的更大的變化就會(huì)被引入，產(chǎn)物將被篩選。另外，本發(fā)明涉及編碼具有SNDH活性的多肽的多核苷酸以及其互補(bǔ)鏈，所述多肽如包括序列表中公開的SEQIDN0:2所示，或包括上述序列的DNA序列或其片段，以及在標(biāo)準(zhǔn)條件下能與此類序列雜交但編碼具有完全一樣的氨基酸序列的DNA序列。因此，本發(fā)明提供了經(jīng)過分離的編碼具有醛脫氫酶活性的多肽的核酸分子，其中，所述核酸分子的互補(bǔ)體能在標(biāo)準(zhǔn)條件下與上述核酸分子雜交。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了經(jīng)過分離的編碼PJf醛脫氫酶活性的多肽的核酸分子，其中，所述核酸分子能在標(biāo)準(zhǔn)條件下與下列核酸分T的互補(bǔ)鏈雜交(i)編碼醛脫氫酶的核酸分了，其包含與SEQNO:1的核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸；(11)編碼醛脫氫酶的核酸分子，其包含-一段多核苷酸,所述多核苷酸與選自由(a)SBQII)中第258-2084位核苷酸、(b)卿H)中第351-2084位核昔酸、(c)SEQIDNO:1中第258-1955位核,酸和(d)SEQIDN0:1中第351-1955位核苷酸所構(gòu)成的組的多核苷酸至少95%相同；以及(iii)編碼醛脫氫酶的核酸分子，其包含選自由(a)編碼具有SEQIDN〔)2中氨基酸序列的多肽的多核苷酸、(b)編碼由SEQIDNO:2屮第32-609位氨棊酸所構(gòu)成的多肽的多核苷酸、(c)編碼由SEQIDNO:2中第1-566位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核苷酸和(d)編碼由SEQIDNO:2中第32-566位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核苷酸所構(gòu)成的組的多核苷酸。用于雜交的"標(biāo)準(zhǔn)條件"在上下文中表示本領(lǐng)域的技術(shù)人員為了探測(cè)特異性雜交信號(hào)通常所用的條件，或者優(yōu)選地,是本領(lǐng)域技術(shù)人員所用的所謂嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。因此，本文中使用的術(shù)語"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"指序列間95%相NJ以及優(yōu)選97%相同的情況下雜交就會(huì)發(fā)生的條件。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件例如是如下的條件用經(jīng)過地高辛(digoxygenin，DIG)標(biāo)記的DNA探針(通過DIG標(biāo)記系統(tǒng)構(gòu)建；RocheDiagnosticsGmbII，468298Mannheim,Germany)，在包含50%甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸一:鈉)、0,2%-卜二烷基硫酸鈉、0,1%N-十二烷基肌氨酸和2%封閉試劑(RocheDiagnosti.esGmbH)的溶液中，于42T培養(yǎng)過夜，然后于大約60T在0.ixSSC中洗雜交膜。本發(fā)明還涉及重組載體，即表達(dá)載體，所述載體包含上述核酸分子。本發(fā)明的表達(dá)載體能在合適的宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用。用T表達(dá)本發(fā)明核酸分子的優(yōu)選載體是選自由PQE、pUC、p:BluescriptII、pACYC177、pACYC184、pVK1.0()和RSFl()l()所構(gòu)成的組的載體或其衍生物。用于表達(dá)本發(fā)明核苷酸序列的合適的宿主細(xì)胞是選自由細(xì)菌、酵母和植物細(xì)胞所構(gòu)成的組的重組微生物。優(yōu)選地，所述微生物選自由Gluconobacter、Ace-tobacter、Pseudomonas、Acinetobacter、Klebsiella禾口Escherichia所.構(gòu)成的纟辻。此類亍尤選德j(牛物的---個(gè)例子是E,coli。更優(yōu)選的宿主細(xì)胞屬于Gluc翻bactei"呵d盡，最優(yōu)選為G.oxydans國4025(剛MBP-3812)，其已按照《布達(dá)佩斯條約》的規(guī)定，于1987年3月17I——I*皮f呆藏到德國Braunsch沐oig的DoutschoSa咖lungvonMikroorgaiiismonundZellkulturen(I)SMZ)。微生物"Gluconobacteroxydans"還包括由《國際原核生物命名法規(guī)》(IiitermatiomilCodeofNomenclatureofProkaryotes)所定義的，此物禾中的具有相同物理-化學(xué)屬性的同物異名體(synonym)或基原異名體(basonym)。因此，本發(fā)明涉及經(jīng)上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組微生物,或包含整合到其染色體DNA中的上述核酸分子的重組微牛物。若千種不同的宿主/載體組合可被用于克隆本發(fā)明的雙鏈核苷酸序列。鑒于E.coli是優(yōu)選的宿主細(xì)胞，故而通常用TE.coli的任何載體都可用丁-本發(fā)明。此類載體包括但不限于能表達(dá)帶有組氨酸標(biāo)簽重組蛋白的pQE載體(QI麵K.K.，日木東京)、pBR322或其衍生物包括pUC18禾npBluescriptII(StratageneCloningSystems,California,USA)、pACYC177和pACYC184及其衍生物，以及從廣宿主范圍的質(zhì)粒例如RK2和RSF1010所獲得的載體。因此，用于本發(fā)明的表達(dá)載體是從pQE質(zhì)粒、pUC質(zhì)粒、pBluescriptII、pACYC177、pACYC184及其衍生質(zhì)粒和廣宿主范圍的質(zhì)粒，例如pVKl()()和:RSFl()l()獲得的。本文中使用的"表達(dá)載體"指在轉(zhuǎn)化到合適的宿主之后，能提a被克隆到該載體中的基因的表達(dá)的克隆載體。被克隆的基因通常處T(即，可操作地連接到)某些控制序列例如啟動(dòng)子序列的控制下。啟動(dòng)子序列可以是組成型的或者誘導(dǎo)型的。本文中使用的"克隆載體"指質(zhì)?；蚴删wDNA或其它能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制的DNA序列，其特征是具有單個(gè)或少量的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，可以以確定的方式在這些位點(diǎn)上對(duì)此類DNA序列進(jìn)行切割而所述載體不會(huì)丟失必要的生物學(xué)功能，還可以向所述載體中導(dǎo)入DM片段以使所述DNA片段得以被復(fù)制及克隆。所述克隆載體可以進(jìn)一步地含有適于用來鑒定經(jīng)所述克隆載休轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的標(biāo)志(marker)。此類標(biāo)志提供了例如對(duì)四環(huán)素或?qū)Π逼S青霉素的抗性。本文中使用的"重組載體"包括任何含有被克隆的目的基因的克隆載體或表達(dá)載體。本文中使用的"表達(dá)"指從結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)生多肽的過程。該過程涉及所述基因向mRNA的轉(zhuǎn)錄和此類mRNA到多肽的翻譯。本文中使用的"重組微生物"包括重組宿主，其可以是任何在表達(dá)載體或克隆載體上含有被克隆的目的基因的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。該術(shù)語還包括經(jīng)過遺傳工程改造的在染色體或基因組上含有冃的基因的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。本文中使用的"宿主"包括任何是可復(fù)制的表達(dá)載體或克隆載體的受體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。木文巾作為術(shù)語使用的"宿主"還包括經(jīng)過遺傳工程改造的在其染色體或基因組上含有目的基因的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，所述遺傳工程改造是通過公知技術(shù)進(jìn)行的。此類宿主的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。為構(gòu)建挑帶〈j重組DM例如重組載體的重組微生物，可以使用若干種基因轉(zhuǎn)移方法，其包括但不限十轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合(conjugalmating)或電穿孔。此類方式都是分了生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)公知的。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以用于Gluconobacter、AceLobacter、Pseudomonas、Acinet.obacter、Kiebsie1Ia或Kscherichia。轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)也可用于K.coIi。接合系統(tǒng)可以廣泛地使用丁'革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌，包括E,coli、P,putida和Gluconobactor。在TO89/06,688巾公開了一個(gè)接合的例子。接合可以發(fā)生于液體培養(yǎng)基巾或固體表面上。用于生產(chǎn)SNDII的合適的受體實(shí)例包括Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas、Acinetobact.er、Klebsiella或Escherichia的微生物?？梢韵騦tj于接合的受體屮加入選擇性標(biāo)志，例如對(duì)對(duì)萘啶酸或利福平的抗性。天然抗性也可以使用，例如,對(duì)多粘菌素B的抗性可用f很多種Gluconobacter。優(yōu)選的用于本發(fā)明的載休是廣宿主范閨的載休，例如粘粒載休，例如pVKi00及其衍生物和RSF1()1()。應(yīng)當(dāng)對(duì)載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性詳加考慮，這是為了使被克隆的核酸分子能穩(wěn)定有效地表達(dá)，也是為丫使攜帶有所述被克隆的分子的宿主細(xì)胞能被有效地培養(yǎng)。含有轉(zhuǎn)座元件例如Tn5的核酸分子也可以被用于將目的DNA導(dǎo)入到優(yōu)選宿主中，尤其是導(dǎo)入到染色體上。含有從優(yōu)選宿主分離出來的任何DNA和本發(fā)明的核苷酸序列的核酸分子也可用于將本發(fā)明的核苷酸序列導(dǎo)入到優(yōu)選宿主屮，尤其是導(dǎo)入到染色體....匕?？捎萌魏蝹鹘y(tǒng)方法將此類核酸分子轉(zhuǎn)移到優(yōu)選的宿主中，所述傳統(tǒng)方法例如是轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合或電穿孔，它們是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，對(duì)它們的使用要考慮到宿主細(xì)胞和核酸分了的性質(zhì)。用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法，將包括本發(fā)明提供的SNDH基因的核苷酸序列連接到合適的含有調(diào)控區(qū)域的載體上，以制造出合適的表達(dá)載體，所述調(diào)控區(qū)域例如是啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子，所述調(diào)控區(qū)域在上述宿主細(xì)胞中是可操作的。為有效表達(dá)從G,oxydansDSM:4025中分離出的目的基丙/核苷酸序列，可以使用若干種啟動(dòng)子；例如所述基因原來的啟動(dòng)子，抗生素抗性基因例如Tn5的卡那霉素抗性基因、pB:R322的氨芐青霉素抗性某因的啟動(dòng)子，E.coli的beta-半乳糖苷酶(lac)、trp-、tac-、trc-啟動(dòng)子，lambda噬菌體的啟動(dòng)子和任何能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的啟動(dòng)了。就此目的而言，宿主細(xì)胞可選自由細(xì)菌、酵母和植物細(xì)胞所構(gòu)成的組。優(yōu)選地,所述宿.4^:細(xì)fl包JSf1GluconobacLer、AcetobacLer、Pseudomonas、Ac丄neLobacter、KlebsiellaJi^Hscherichia屬。為完成表達(dá)，在宿主細(xì)胞(其中導(dǎo)入了編碼序列，以提供本發(fā)明的重組細(xì)胞)中可操作的其它調(diào)控元件，例如Shine-Dalgarno(SD)序列(例如，AGGM;G，包括在宿主細(xì)胞中可'操作的天然序列和合成序列)和轉(zhuǎn)錄終止子(反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，包括任何在宿主細(xì)胞中可操作的天然序列和合成序列)可以和上述啟動(dòng)子一起使用。為表達(dá)處f周質(zhì)空間(periplasmicspace)的多肽，例如本發(fā)明的SNI)H:蛋白質(zhì)，優(yōu)選要聯(lián)合通常含有i5至50個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，所述信號(hào)肽是完全疏水的。編碼信號(hào)肽的I)NA可以選自在冃的宿主細(xì)胞中可操作的任何天然序列或合成序列。在由本發(fā)明的SNDH所表達(dá)的蛋白質(zhì)中，也發(fā)現(xiàn)'廣含有SEQIDNO:2第1-31位氨基酸殘基的推斷出的信號(hào)肽(SEQIDNO:4)。除非另有指明，本文中所有通過對(duì)經(jīng)過純化的SNDII蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序測(cè)定出的氨某酸序列都是用fi動(dòng)氨某酸測(cè)序儀(例如470A型，Perkin-ElmerA卯liedBiosyst.ems)來測(cè)定的。除非另外指明，本文中所有通過對(duì)I)NA分了進(jìn)行測(cè)序測(cè)定出的核苷酸序列都是用自動(dòng)DNA測(cè)序儀(例如ALFexpressII型，AmershamPha擺c丄aBiotech)來測(cè)定的，所有由本文中所確定的l)NA分子編碼的多肽的氨基酸序列都是通過對(duì)按照上文所述測(cè)定的DNA序列進(jìn)行翻譯來預(yù)測(cè)的。因此，如本領(lǐng)域內(nèi)所己知的那樣，對(duì)任何通過該自動(dòng)手段來測(cè)定的DNA序列而pf，木文巾測(cè)定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯(cuò)誤。典型地，通過自動(dòng)操作測(cè)定的核苷酸序列與被用來測(cè)序的DM分子的實(shí)際核苷酸序列至少約90%相同，更典型地，至少約95%到至少約99,9%相同?？赏ㄟ^其它手段更精確地測(cè)定所述的實(shí)際序列，所述手段包括本領(lǐng)域中公知的手工DNA測(cè)序方法。如本領(lǐng)域中還已知的那樣，如果測(cè)定出的核苷酸序列較之實(shí)際序列存在單個(gè)插入或缺失，在該核苷酸進(jìn)行翻譯時(shí)就會(huì)導(dǎo)致移碼(frameshiR)，因此，由測(cè)定出的核苷酸序列所編碼的預(yù)測(cè)氨基酸序列從插入或缺失點(diǎn)開始，就將完全不同于被用于測(cè)序的I),分子實(shí)際編碼的氨基酸序列。本發(fā)明提供了經(jīng)過分離的編碼所述酶(SNDH)的核酸分子。為對(duì)經(jīng)過分離的核酸分子進(jìn)行操作而設(shè)計(jì)的方法和技術(shù)在木領(lǐng)域內(nèi)是公知的。用于對(duì)核酸分子進(jìn)行分離、純化及克隆的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是己知的，描述了真核和原核宿主細(xì)胞的用途及其中核酸和蛋白質(zhì)表達(dá)的方法和技術(shù)也是已知的。簡言之，用于本發(fā)明的SNDH基因、含Yj所述基因的DNA分子、重組表達(dá)載體和重組微生物nj以通過下列步驟獲得(I)從G,oxydansDSM4025中分離染色休DM,在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞例如E,c;ol丄中用所述染色體I),構(gòu)建基因文庫；(2)通過菌落雜交、噬菌斑雜交或Southern雜交，PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))克隆，western印記分析或木領(lǐng)域內(nèi)已知的其它技術(shù)，從所述染色體DNA巾克隆出SNDH基岡；(3)通過傳統(tǒng)方法，測(cè)定根據(jù)上文所述得到的SNDII基因的核苷酸序列，以選出含有所述s冊(cè):h基因的dm分子，構(gòu)建出其屮能有效表達(dá)sn:[)h:基因的革:組表達(dá)載體；(4)構(gòu)建攜帶心SNDH基因的重組微生物，這是通過用于將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的適當(dāng)方法來進(jìn)行的，所述方法例如是轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和/或電穿孔,其中宿主細(xì)胞因此成為了本發(fā)明的重組微牛物。下面將舉例來詳細(xì)闡述本發(fā)明的上述方面中所使用的材料和技術(shù)可以用本領(lǐng)域內(nèi)公知的工序來對(duì)染色體總DNA進(jìn)行純化，典型地，通過下列詳細(xì)說明的任何方法，可以將目的基岡從染色體總DNA克隆到質(zhì)?；蚴删w載體中去(i)從經(jīng)過純化的蛋白質(zhì)或其肽段來測(cè)定部分的氨基酸序列。此類整個(gè)的蛋白7質(zhì)或肽段可以通過對(duì)整個(gè)蛋O質(zhì)的分離來制備，或者通過在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后對(duì)所述凝膠進(jìn)行肽酶處理來制備。til此獲得的蛋白質(zhì)或其片段被用f蛋白質(zhì)測(cè)序儀，例如AppliedB丄osystems的自動(dòng)氣相測(cè)序儀470A。用DM合成儀，例如AppliedB丄osyslems的自動(dòng)l)NA測(cè)序儀381A，可利用氨基酸序列來設(shè)計(jì)及制備寡核苷酸探針和/或引物。所述探針可被用T從帶有目標(biāo)基因的菌株的基因文庫中分離帶有目標(biāo)基因的克隆，這是通過Southern雜交、菌落雜交或噬菌斑雜交來進(jìn)行的。(ii)或者，為著從基因文庫中選擇出表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的克隆的目的，可以應(yīng)用免疫方法以及為目標(biāo)蛋白質(zhì)而制備的抗體。(iii)用一組引物，即根據(jù)上述測(cè)定的氨基酸序列合成的兩條寡核苷酸，通過PGR方法，nj以從染色體總DNA中擴(kuò)增出目標(biāo)基因的DNA片段。然后,用上面獲得的PCR產(chǎn)物作為探針，通過Southern雜交、菌落雜交或噬菌斑雜交，可以從構(gòu)建的基因文痄中分離出攜帶有整個(gè)冃標(biāo)基因的克隆,所述基因文庫例如是在B.coH中構(gòu)建的。通過PCR制造的DNA也是本發(fā)明的-'個(gè)目的，所述PCR中，使用的弓|物是通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，在木文中公開的DM序列的基礎(chǔ)i:來設(shè)計(jì)的。用經(jīng)過純化的SNDII蛋白質(zhì)、經(jīng)過純化的重組SNDII蛋白質(zhì)例如E.coli中表達(dá)的加上了組氨酸標(biāo)簽的SNDH或其肽段作為抗原，可以制備出上面提到的抗體。—曰.獲得了攜帶:ff目的基因的克隆，就可以通過公知的方法,例如M13噬菌體開展雙脫氧鏈終止法來測(cè)定目標(biāo)基因的核苷酸序列。:圖1描述丫本發(fā)明的編碼具有醛脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因。其中給出丫SNDH基岡和ORF-A基岡的限制性圖譜，其巾，所述()RF指開放閱讀框，信號(hào)序列指推斷出的SNDH基因的信號(hào)序列。圖2描述了克隆到粘粒pVSN5屮的S冊(cè):H和ORF-A基因的限制性圖譜，以及向pUC質(zhì)粒中插入的不同大小的DNA克隆的限制性圖譜，所述pUC質(zhì)粒例如是pUCSNP4、pUCSNP9、pUCSN19和pUCSN5。在pVSN5的物理圖譜中，灰色箭頭表不SNDH基因。圖3顯示了將來自pVSN5的包括完整SNDH基因的8,Okb的P"I片段克隆到pUC丄8質(zhì)粒中的策略，結(jié)果產(chǎn)生了pUCSNP4和pUCSNP9。注意除了插入方向不同，pUCSNP4和pUCSNP9都是-'樣的。圖4以圖表方式顯示了通過使用自殺性載體質(zhì)粒對(duì)G()MTR1SN::Km(SND:H-破壞型)進(jìn)行的構(gòu)建，所述fi殺性載體質(zhì)粒帶有己用卡那霉素盒(kanamycincassette,Km)破壞掉的SNDH某因。在所述載體質(zhì)粒和作為親本菌株的G()MTR1的染色體DNA之間的相應(yīng)位置發(fā)生同源重組，獲得了破壞型的菌株。"G.0,"表示Gluconobac-teroxydans。圖5展不了pVSN117、pVS漏6和pVSNl14的插入DNA的物理圖譜。質(zhì)粒pVSN117的插入DNA編碼C-未端缺失型的SNDH基因(SEQIDNO:丄的第258-1955位核苷酸，即SEQII)N():2的第1-566位氨基酸)，該基因表達(dá)僅55ld)a的蛋白質(zhì)。質(zhì)粒pVSNl()6和pVSNl14具有編碼完整SNDH基因的插入DNA。如圖2所示，木發(fā)明的基岡編碼了具有578個(gè)氨基酸殘基(SEQI:DN():5，由SEQIDNO:2的第32-609〗酸組成)的SNDII酶和具有31個(gè)氨基酸殘基的推斷出的信號(hào)肽(SEQIDNO:4，由SEQIDNO:2的第1-31位氨基酸組成)。在核伊酸序列的方面，SNDH基因的編碼區(qū)域包含SEQIDN():l的第258-2087位核苷酸，其包括推斷出的信號(hào)肽的編碼序列(SEQIDNO:i的第258-350位核苷酸)和終!h密碼子(SEQIDNO:i的第2085-2087位核苷酸)。因此，沒有終止密碼子的核苷酸序列是S,H)N():l的第258-2084位的核苷酸序列，此外，沒有信3肽的情況下，所述核苷酸序列包含SEQIDN0:l的第351-2084位核苷酸。本發(fā)明中公開的核酸分子可以用于重組微生物中，用于生產(chǎn)2-KGA和./或維生素C?？稍谟醒鯒l件下，于補(bǔ)充有適當(dāng)營養(yǎng)物的水性培養(yǎng)某屮，培養(yǎng)選fiGluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas、Acinetobacter、Klebsiella或Escherichia的重組微生物。所述培養(yǎng)nj以進(jìn)行f4.0至9,()之間的p:HK，優(yōu)選為6.0至8,0。培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)將用到的pH、溫度和營養(yǎng)培養(yǎng)基而變化，其優(yōu)選是大約i至5天。用于開展培養(yǎng)的優(yōu)選溫度范閨是大約i:rc至大約36。c，更優(yōu)選是大約18。c至大約3:rc。通常要求所述培養(yǎng)基中含有——F述營養(yǎng)物可被吸收的碳源，例如甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌糖醇、半乳糖醇、:[)-核糖、d-果糖、d-葡萄糖和蔗糖，優(yōu)選為:[)-山梨糖醇、d-甘露醇和廿油；以及可被消化的氮源，例如有機(jī)物質(zhì)，例如蛋白胨、酵母提取物、面包酵母、尿素、氨^酸和玉米漿。若千無機(jī)物質(zhì)也可用作氮源，例如硝酸鹽和銨鹽。此外，培養(yǎng)基屮通常還含(J允機(jī)鹽，例如硫酸鎂、磷酸鉀和碳酸鈣?；?p開展于合適的裝置中，例如發(fā)酵罐、瓶或試管中。重組微生物或者是經(jīng)含有上述核酸分了的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的，或者包含整合到其染色休DNA上的本發(fā)明核酸分子。在對(duì)2-KGA和/或維生素C的生產(chǎn)中，一種作為底物的合適的糖類化合物是L-山梨糖酮。針對(duì)2-KGA和維生素C的代謝途徑始自D-山梨糖醇，經(jīng)過L-山梨糖到L-山梨糖酮，L-山梨糖酮然后再轉(zhuǎn)化為2-KGA和/或維生素C。岡此，用于全部兩種產(chǎn)物的直接底物是L-山梨糖酮。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了從L-山梨糖酮來生產(chǎn)2-KGA和/或維生素C的方法，所述方法包括(a)在合適的培養(yǎng)基上，繁殖或培養(yǎng)重組微生物，所述微生物是經(jīng)含W本發(fā)明核酸分了的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化得到的，或者所述微生物中包含整合到其染色體:[)NA....匕的本發(fā)明核酸分子；禾卩(b)從所述培養(yǎng)基中回收及分離2-KGA和/或維牛素C。本發(fā)明的一種實(shí)施方式提供了從L-山梨糖酮生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的方法，所述方法包括(a)在合適的培養(yǎng)基上，繁殖或培養(yǎng)重組生物，其中，本發(fā)明中的核酸分子通過異源方式被導(dǎo)入到了所述的重組生物巾；和(b)從所述培養(yǎng)基巾回收及分離2-KGA和/或維生素C。本發(fā)明提供了歪組的S冊(cè):H。技術(shù)人員可以通過將本發(fā)明提供的SNI)H:某因?qū)氲剿拗骷?xì)胞中來增加SNDH酶的產(chǎn)量，所述宿主細(xì)胞包括G,oxydansDSM4025。技術(shù)人員也nj以通過使用本發(fā)明的SND:H基因在宿主細(xì)胞中更有效地生產(chǎn)SNI)H:蛋白質(zhì)，所述宿主細(xì)||3&自由Gluconobacter、AcetobacLer、Pseudomonas、AcineLobacter、Klebsiellajg^Bscherichia所構(gòu)成的組?？梢匀?...匕文所述來對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)。下面簡耍描述.'下用T在培養(yǎng)之后從微生物中對(duì)重組SNDH進(jìn)行分離和純化的實(shí)施方式通過離心或過濾從液體培養(yǎng)液巾收獲細(xì)胞。用水、生理鹽水或具有適當(dāng)P:H的緩沖溶液來洗收獲得到的細(xì)胞。洗過的細(xì)胞被懸浮于緩沖溶液中，使用均質(zhì)機(jī)、超聲波裂解儀9(sonicator)或Frenchpress來使細(xì)胞破裂，或者用溶菌酶來獲得破裂細(xì)胞的溶液。從破裂細(xì)胞的無細(xì)胞提取物中分離和純化出重組的SND:H，優(yōu)選從所述微生物的細(xì)胞液部分來開展分離和純化。重組SNDH可固定于固休載休上，用作固相酶反應(yīng)。本發(fā)明進(jìn)一步地涉及從L-山梨糖酮生產(chǎn)2-KGA的方法，所述方法包括(a)在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)屬TGluconobacteroxydansDSM4025的微生物，其中，所述微生物中，編碼SEQIDN():2所展示的醛脫氫酶的基岡已被破壞掉；和(b)從所述培養(yǎng)基巾回收或分離2-KGA。所述破壞可以發(fā)生在基因中的任何能導(dǎo)致所編碼的酶失去功能的地方。因此，本發(fā)明提供了從合適的糖類化合物經(jīng)過L-山梨糖酮來生產(chǎn)2-KGA的方法，所述方法包括(a)在合適的培芥基上令屬于GluconobacteroxydansDSM4025的微生物繁殖，其中，所述微生物中，編碼醒脫氫酶的基因已被破壞掉,所述醛脫氫酶由卜'列物質(zhì)編碼(丄)與SEQIDN0:i的核苷酸序列至少95X相同的多核苷酸；(丄丄)與選自由(a)SEQIDNO:1中第258-2084位核苷酸、(b)S卜:QII)NO:1中第35卜2()84位核苷酸、(c)SKQH)NO:1中第258-1955位核苷酸和(d)SEQIDNO:1中第351-1955位核苷酸所構(gòu)成的組的多核苷酸至少95%相同的多核苷酸；以及(iii)選自由(a)編碼具有SEQIDNO:2中氨基酸序列的多肽的多核苷酸、(b)編碼由SEQIDN0:2中第32-609位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核苷酸、(c)編碼由SEQIDNO:2屮第1-566位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核苷酸和(d)編碼由SEQIDN0:2中第32-566位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核-伊酸所構(gòu)成的組的多核.伊酸。從所述培養(yǎng)基中進(jìn)一步回收和分離得到的2-KGA。在---------種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過經(jīng)典誘變?cè)谛輧?nèi)及休外來破壞SNDH基因的方法，所述經(jīng)典誘變中使用了UV輻射等手段或通過任何的突變?cè)噭┑幕瘜W(xué)處理,所述試劑例如是N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(N-mothyl-N，-nitro-N-nitrosoguanidino，NTG)、ICR170或吖啶橙。在另--------種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過DM重組技術(shù)在體內(nèi)及體外來破壞SNDII某因的力'法,例如插入轉(zhuǎn)座子或通過PCR進(jìn)行定點(diǎn)誘變。在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過發(fā)酵從合適的底物來生產(chǎn)2-KGA的方法，其中使用了上述破壞型(disruptant)，所述底物即糖類化合物,其選自由L-山梨糖酮、D-葡萄糖、D-山梨糖醇和L-山梨糖所構(gòu)成的組。該方法開展于適當(dāng)?shù)难b置中，例如發(fā)酵罐、瓶或試管中。此外，本發(fā)明提供了用上述破壞型的無細(xì)胞提取物從合適的底物，例如L-山梨糖酮、D-葡萄糖、L-山梨糖和D-山梨糖醇,來生產(chǎn)2-KGA的方法，所述方法是通過在合適的裝置例如生物反應(yīng)器I:進(jìn)行培養(yǎng)來進(jìn)行的。本發(fā)明提供了重組的SNDIL此外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)醛脫氫酶的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)包含編碼醛脫氫酶的核酸分子的繭組微生物，所述核酸分子包含(i)與SEQIDN0:1的核苷酸序列至少95%相同的多核-伊酸；(ii)與選自由(a)SEQIDNO:1中第258-2084位核苷酸、(b)SEQIDNO:1中第351-2084位核苷酸、(c)SEQIDNO:1中第258-i955位核苷酸和(d)SEQIDNO:i中第35i-i955位核苷酸所構(gòu)成的組的多核苷酸至少95%相同的多核苷酸；以及(iii)選自由(a)編碼具有SBQII)NO:2中氨基酸序列的多肽的多核—ff酸、(b)編碼由SEQIDNO:2中第32-609位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核——ff酸、(c)編碼由SEQIDNO:2中第1-566位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核苷酸和(d)編碼由SEQIDNO:2中第32-566位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核苷酸所構(gòu)成的組的多核苷酸；其中，所述微生物被培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)基上，和(b)其中，從所述培養(yǎng)基中冋收和分離所述醛脫氫酶。實(shí)施例1:對(duì)SNDH:的N-末端氨基酸進(jìn)行測(cè)序SNDH蛋白質(zhì)75kDa亞基N-水端的部分氨基酸序列被測(cè)定。將大約iOug經(jīng)過SI)S處理的由75Id)a亞基組成的純化的S誦用于SDS-PAGK，蛋A質(zhì)條帶被電轉(zhuǎn)印(oloctroblot)到PVDF膜上。將印到膜上的蛋白質(zhì)浸泡T消化緩沖液(100mM磷酸鉀緩沖液、5mM二硫蘇糖醇、10mMEDTA，pH為8.0)巾，并和5.04Pg的焦谷氨酸氨基肽酶(SIGMA,USA)--起在30t被培養(yǎng)24小時(shí)。掊芥完成后，用去離子水洗膜，用fi動(dòng)氨基酸測(cè)序儀(ABI490型，PerkinElmerCorp,，Conn,，LSA)對(duì)其進(jìn)行N-末端氨某酸測(cè)序。結(jié)果獲得了如SEQIDNO:3中所示的所述N-末端氨基酸序列的14個(gè)殘基。實(shí)施例2:通過PCR克隆部分SNDH基因使用G.oxydansDSM4025(FERMBP-38丄2)的染色休DM和簡并寡核苷酸引物Pll(S卜:QII)NO:6)和P12(SKQH)NO:7)，通過PCR來對(duì)SNI)H基因的部分片段進(jìn)行擴(kuò)增。全部兩組引物都是簡并DM混合物，并且具有Gluconobactor的密碼子使用偏好。所述PCR是用熱穩(wěn)定taq聚合酶(窗ARAExTaq，TakaraShuz.oCo,，Ltd,，Seta3-4-1，()tsu，Shiga,520-2193，Japan)禾口熱循環(huán)儀(GeneAmpPCRSystem2400-R，PEBiosystems，850LincolnCentreDrive,FosterCity，CA94.404，USA)來開展的。反應(yīng)混合物(25u1)由緩沖液中的200uM的dNTPs、50pmo1的每種引物(簡并度為24-48)、5ng的染色體DNA和1.25個(gè)單位的I)NA聚合酶組成，所述緩沖液是由供給商提供的。反應(yīng)先進(jìn)行了5個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在94t:進(jìn)行30秒的變性歩驟、在37t:進(jìn)行30秒的退火歩驟、在70T進(jìn)行i分鐘的合成步驟；然后再進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在94,C進(jìn)行3()秒的變性歩驟、在5()。C進(jìn)行30秒的退火步驟、在70"C進(jìn)行1分鐘的合成步驟。結(jié)果特異性地?cái)U(kuò)增出了.'條41bp的DNA片段，并將該片段克隆到載體pCR2,1-T()P()(:[nvitrogen，1600FaradayAvenueCarlsbad，California92008，USA)中，以獲得重組的質(zhì)粒pMTSN2。通過雙脫氧鏈終止法(F,Sangeretal，Proc,Natl,Acad,Sci,USA，74，5463-54.67,1977)來驗(yàn)證被克隆的41bp的DNA片段的核-伊酸序列，所述DM片段編碼了成熟的SNDH蛋O質(zhì)N-末端的部分氨基酸序列。實(shí)施例3:對(duì)SNDH:基因的完全克隆(丄)構(gòu)建G.oxydtmsDSM4025的基因文庫從已在M瓊脂培養(yǎng)基上于27。C生長了4天的細(xì)胞來制備(;.oxydansDSM4025的染色體DNA，所述培養(yǎng)基含有5,0%的D-甘露醇、1.75%的玉米漿、5,0%的面包酵母、0,25%的M:gS()47H2()、0,5%的CaC()3(應(yīng)用級(jí))、0.5%的尿素和2,()%的瓊脂(pH7,0)。在20P1反應(yīng)混合物中，用4個(gè)單位的EcoRI來對(duì)所述染色體DNA(4ug)進(jìn)行部分的消化。使用1%的瓊脂糖凝膠,通過電泳對(duì)一部分(8ul)樣品進(jìn)行分離,所述樣品屮含有經(jīng)部分消化的DNA片段。15至35kb范圍內(nèi)的片段被切下來，用QIAEXII(QIAGENInc.，28159AvenueStanford,Valencia,CA91355，USA)通過化學(xué)法融膠來回收所述的片段。回收得到的目的DNA片段被懸浮于I-W中。另--一方面，用EcoRI對(duì)2ug的粘粒載休pVKi00進(jìn)行完全的消化，并用細(xì)菌的堿性磷酸酶O:.coliC75)(TakaraShuzo)處理來對(duì)其5，端去磷酸化。用連接試劑盒(TakaraShuzo)，在36u1的反應(yīng)混合物中將經(jīng)過處理的pVKlOO(220ng)與15-35kb的EcoRI片段(1ug)連接起來。對(duì)經(jīng)連接的DNA進(jìn)行乙醇沉淀，再將其溶于適當(dāng)體積的TE緩沖液(10mM的Tris-IIC1pll8,0、ImM的EDTA)中，然后用于體外包裝(Gig鄰ackIIIColdPackagingExtract,Stratagene，11011NorthTorreyPinesRoad,LaJolla，CA92037，USA)，以感染用f基因組文庫的宿主菌株E.coliVCS257。結(jié)果獲得了總共400,000-670,000個(gè)含有大約25kb的插入DNA片段的克隆。(2)通過菌落雜交對(duì)S隨H基因進(jìn)行完全克隆將用T篩選上述粘粒文庫的探針構(gòu)建出來，通過菌落雜交方法進(jìn)行篩選，以探測(cè)攜帶有完全的SNI)H:基岡的克隆。通過PC:R-DIG標(biāo)記方法(RocheMolecularSystemsInc.，1145AtlanticAvenue,Alabama,CA94501,USA)，擴(kuò)增并標(biāo)記了編碼SNDIIN-末端氨基酸序列的41bp的:[)NA片段。用質(zhì)粒pM:TSN2DNA作為模板，使用寡核苷酸DNA弓l物P13(SEQIDNO:8)和P14(SEQIDNO:9)，用熱穩(wěn)定taq聚合酶(TAKARAExTaq,TakaraShuzoCo,，Ltd,)和熱循環(huán)儀(GeneAmp:PCRSystem2400-R，PEBiosystems)來開展:PCR。反應(yīng)進(jìn)行了25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在94t:進(jìn)行30秒的變性歩驟、在55。C進(jìn)行30秒的退火歩驟、在7(rC進(jìn)行l(wèi)分鐘的合成步驟。按照供給商(RocheMolecularSystemsInc.，USA)提供的方法，使用經(jīng)過DIG標(biāo)記的探針,通過菌落雜交和化學(xué)發(fā)光探測(cè),來開展對(duì)所述粘粒文庫(大約1，000個(gè)克隆)的篩選。結(jié)果分離出了3個(gè)陽性克隆，其中一個(gè)被命名為pVSN5，其在pVK100載體中攜帶有人約25kb的插入DNA。由此將這25kbDNA插入片段的不同人小的片段再進(jìn)一歩地亞克隆到PUC1.8載體屮(圖2)，結(jié)果分別是:(1))-胞含S誦某因....匕游部分(N-末端部分)的3.2kb的EcoRI片段產(chǎn)生了pUC'SN19,(2)用包含SNDH基因下游部分(C-末端部分)的7.2kb的EcoRI片段產(chǎn)生了pUCSN5，(3)用包含完整或完全的SNDH基因的i.8kb的PsLI片段產(chǎn)牛了pUCSNP4和pUCSNP9。注意pUCSNP4和pUCSNP9中的插入是同樣的，但方向相反。(3)對(duì)SNDH進(jìn)行核——ff酸測(cè)序?qū)|(zhì)粒pUCSN19、pUCSN5和pUCSNP4的包括SNI)H:基丙或基丙片段的區(qū)域進(jìn)行核苷酸測(cè)序。測(cè)定出的核苷酸序列(3，408bp的SEQIDNO:1)顯示SNDII基因的0諫，827bp，SEQII)N():1.的第258-2084位核苷酸)編碼了具有609個(gè)氨棊酸殘某的多肽(SEQIDNO:2)。如圖1所示，在SNDH0RF的下游發(fā)現(xiàn)了額外的0RF，即0RF-A。0RF-A(l，lOlbp，SEQIDNO:1的第2214-3312位核苷酸)編碼了具有367個(gè)氨基酸的多肽。SNDH基因的ORF中，推斷出的氨基酸序列可能包括一段信號(hào)肽類似序列(3丄bp的S卜:QII)N():4)，其含有(i)很多疏水殘基，(ii)靠近N-末端的帶止電荷的殘基和(iii)用T信5序列切割位點(diǎn)的Ala-Xaa-Ala單元。推測(cè)出的SNDH基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Shine-Dalgarno，SD，sequence)是位于起始密碼子k游的6bp(在SEQIDNO:1的第247-252位核苷酸位置上的AGGAGA)。此外，在SEQIDNO:2的第530-534位發(fā)現(xiàn)了被定義為血紅素(heme)c結(jié)合位點(diǎn)的單元(Cys-Xaa-Xaa-Cys-His)。上述遺傳分析顯示，SNDH:蛋0質(zhì)可被認(rèn)為是--一種醌血紅素蛋O(quinohemopro-tein)。用GCG(GeneticsComputerGroup,Madison，WI,USA)的FASTA程序?qū)NDH:基因進(jìn)行的同源搜索顯示:SEQIDNO:5的Arg227、Asn228、Gln230、Gly246和Asp25i與Oubrieet.al.[丄MoLBiol.289:319-333(1999)]描述的A.calcoaceticus的(;I)H-B蛋白的推測(cè)活性位點(diǎn)的若干高度保守的殘基相應(yīng)。實(shí)施例4:在E,col]'「1---i表達(dá)SNDH,將質(zhì)粒pUCSNP4和pUCSNP9(圖3)轉(zhuǎn)進(jìn)E,coliJM109中，以驗(yàn)證SNDII蛋白質(zhì)的12表達(dá)和活性，所述質(zhì)粒含'"8.0kb的PstI片段，拔中包括完整的即完全的SNDH基因。用高效液相色譜系統(tǒng)(HPLC)在264nm的波K處，測(cè)一:依靠酶的活性生產(chǎn)出的維生素C的量，所述HPLC由UV探測(cè)器(TOSOHUV8000;Tosoh，Japan)、雙泵(TOSOHCCPE;Tosoh)、積分器(ShimaduzC-R6A;Shimadzu，Japan)和柱子(YMC-PackpoIy柳ineII;4.6mm內(nèi)徑[i.d.]xl5cm,YMC，USA)組成。用重組E.coli的胞質(zhì)部分來進(jìn)行的從L-山梨糖酮到維生素C的轉(zhuǎn)化活性被檢測(cè)出來(表1)。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，可選地，所述培養(yǎng)基中補(bǔ)充有10uM的PQQ和1.OmM的CaC:l"所述胞質(zhì)部分是通過對(duì)50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)屮的無細(xì)胞提取物進(jìn)行超離心(100，000xg，45分鐘)來制備的。反應(yīng)混合物(100u1)由125ug的重組E.coli的胞質(zhì)部分、5()mM的L-山梨糖酮、1.OmM:的吩嗪硫酸甲酯(phenazinemesosulfate，PMS)組成，根據(jù)情況可以添加或不添加丄.0uM的PQQ和i.OmM的GiCl2作為輔助因子。酶反應(yīng)在3(rC進(jìn)行30分鐘。在含有l(wèi)()uM的PQQ和1.OmM的CaCi2的LB培養(yǎng)基....匕培養(yǎng)的細(xì)胞中的holo-SNDH,在沒有輔助因子PQQ和CaCl2的如前文定義的反應(yīng)條件下，確實(shí)能生產(chǎn)出維生素C。通過添加輔助岡子，用pUCSNP4和pUNSNP9表達(dá)的apo-SNDH顯示出了與holo-酶差不多一樣的活性。表1:歪組SNDH:的活性測(cè)量微生物培養(yǎng)基中有PQQ.和CaCl2特定活性(mU/mg蛋白質(zhì))有PQQ禾QCaCl2'無PQQ和CaCl2￡,co/!'JM109/pUCSNP4+0,1870,224且co//JM109/pUCSNP4+0,1980,252co歴薩pUCS鵬+O扁O扁且co//JM109/pUCSNP4-0,155O纖且co/i'JM109/pUCSNP4-0,176O扁co//JM109/pUCSNP4-O扁O細(xì)G.OTwrf朋sDSM4025-0.0260,026—個(gè)單位(U)的酶被定義為在上面定義的反應(yīng)中能產(chǎn)生1,Omg的維生素C的酶的量。實(shí)施例5:構(gòu)建和培養(yǎng)G.oxydans齒株的SNI)H某因破壞型圖4.M示/構(gòu)建SNDH基因目標(biāo)載體G0MTR1SN::Km(SNDH破壞型)的計(jì)劃。首先，通過將自殺型載體pSUP2()2和8.()kb的PstI片段連接起來，來構(gòu)建質(zhì)粒pSUPSN，所述PstI片段含有來6質(zhì)粒pUCSNP4的SNDII基因(參考文獻(xiàn)見Simonetal.，Abroadhostrangemobilizationsyst.emforinvit.rogeneticengineering:transposonmutagenesisinGramnegativebacteria,Biotechnology，1，784-791，1983)。接著，將卡那霉素抗性基因盒(Km盒)插入到被克隆到質(zhì)粒pSU:PSN中的SNDH:基因的:Eco:RI位點(diǎn)，以獲得質(zhì)粒GOMTRiSN::Km(KmrTcr)。然后，將質(zhì)粒GOMTRiSN::Km導(dǎo)入G0MTRi，以獲得無SNDH的突變休13(Km''Rif，cs),所述G0MTR1是抗利福平的，旦:是從G,oxydansDSM4025野生型菌株中自發(fā)得到的。在含有50mlT培養(yǎng)液和i00ug/ml的利福平的200ml瓶中，于30°C培養(yǎng)(;()MTRl過夜，所述T培養(yǎng)液由3()g力的TrypticaseSoyBroth(BBL;BectonDickinsonandCompany,Cockoysvillc,MD21031，USA)和3g'/L的酵母提取物(Difco;BcctonDickinsonMicrobio:Log5rSystems,BectonDickinsonandCompany,Sparks,MI)21152，USA)組成。在含有2mlLB培養(yǎng)基和50ug/ml卡那霉素的試管中，將E.coli:HBl()l(p:RK201))[D.H:,Figurski，Proc,Natl,Acad,Sci,USA,76，1648—1652，1979]和E,coliJM109(pSUPSN::Km)化/p過夜。通過離心將G0MTR1、E.coliHB101(pRK2013)和E.coli.jm()9(pSUPSN::Km)的培養(yǎng)細(xì)胞單獨(dú)收集起來，分別以10:1:l的比例來混合每種細(xì)胞在LB培養(yǎng)基中的懸浮液。然后將上述細(xì)胞懸浮液以同樣的休積混合，將混合物涂到瓊脂培養(yǎng)基上放置的().45Jim的硝酸纖維素膜上(PR()TRAN，Schleicher&SchueHGmbH,Postfach4，D-37582Dasscl，Germany)，以將來自E.coli供體的自殺性質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移到作為受體的(;()MTRl巾，所述瓊脂培養(yǎng)基由5.()%的D-甘露醇、0.25%的MgS()47:H2()、1.75%的玉米漿、5,0%的面包酵母、0,5%的尿素、0,5%的CaC03和2,0%的瓊脂組成。在27。C培養(yǎng)1天后，ltjT培養(yǎng)液對(duì)含有轉(zhuǎn)移接合子(transconjugant)的細(xì)胞適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行懸浮和稀釋，并將其涂到含Yfi00ug,Zml的利福平和50ug,Zml卡那霉素的篩選用瓊脂平板上。最終獲得了若I'.具有被Km盒破壞掉的SNI)H:基因的轉(zhuǎn)移接合了(KnfRifTcs)。在含有8,0X的L-山梨糖、0,25X的MgS04*7H20、i,75%的玉米漿、5,0%的面包酵母、().5%的尿素、().5%的CaC()3和2.()%的瓊脂的瓊脂平板上，于27。C將G()MTR1和破壞型G0MTR1SN::Km培養(yǎng)4天。將.'接種環(huán)的細(xì)胞接種到500mlErlcnmoyor瓶中的50ml種子培養(yǎng)基中，并在旋轉(zhuǎn)式搖床k以180rpm在3(rC培養(yǎng)1天，所述種子培養(yǎng)基巾含有4%的D-山梨糖醇、0,4%的酵母提取物、0.05%的甘油、0.25%的MgS04頃7II20、1,75%的玉米漿、0.1%的尿素和1.5%的CaC(Vj-l:j由此制備出的種子培養(yǎng)物去接種50()mlErlenmeyer瓶中的50ml主培養(yǎng)基，所述主培養(yǎng)基由12.0%的卜山梨糖、2.0%的尿素、0.05%的甘油、0,25%的MgS04*7:H20、3,0%的玉米漿、0,'1%的酵母提取物和1,5%的CaC()3組成。培養(yǎng)在30°C以i80rpm進(jìn)行4天。如實(shí)施例4中所述來開展活性試驗(yàn)。用HPLC在340nm的波長處，測(cè)*依靠酶的活性生產(chǎn)出的2-K(;A的量，所述HPLC由UV探測(cè)器(T()S()H畫()()();T,h)、雙象(T0S0HCCPE;Tosoh)、積分器(ShimaduzC-R6A;Shimadzu)和柱子(YMC-PackProC18，YMC)組成。如表2所示，SNDH基肉破壞型對(duì)2-KGA的生產(chǎn)效率要高于其親木茼株G()MTR1。每molL-山梨糖對(duì)2-KGA的轉(zhuǎn)化率差異為人約3%。表2:具有被破壞的SNDH雄閑的G,oxydans菌株對(duì)2-KGA的生產(chǎn)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*摩爾轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生的2-KGA的摩爾數(shù)/消耗的L-山梨糖的摩爾數(shù)實(shí)施例6:將攜帶有SNDH某閔的質(zhì)粒導(dǎo)入(;，oxydans:DSM4025的SND:H某閔破壞豐如圖5所示,j-tj廣宿主范圍的載體pVK100來構(gòu)建若千種S冊(cè):H的表達(dá)質(zhì)粒。此類質(zhì)粒在pVK100的HindIII位點(diǎn)ftYj-不同的插入DNA,具體情況如下所述pVSN117的插入DNA含有不完全的SNDH基因，所述不完全的SNDH基因編碼結(jié)束fSEQIDNO:5的G:ly535(S:EQIDN〔)2的第566位氨基酸殘基)的多肽，即C-水端缺失的SNDH基因，該基因表達(dá)僅55kDa的蛋白質(zhì)。分別地，質(zhì)粒pVS1()6和pVSNl14的插入l)NA都含有完全的S隨H基因。通過接合轉(zhuǎn)移方法將此類質(zhì)粒，入G0MTR1SN::Km菌株。在含有10,0%的L-山梨糖、0,25%的MgS(),:;7:H2()、1,75%的干.米漿、5.()%的面包酵母、0.5%的尿素、0.5%的CaC03和2.0%的瓊脂的瓊脂平板上，于27E對(duì)具有如圖5所示的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移接合子進(jìn)行4天的培養(yǎng)。酶反應(yīng)混合物由80ugGluconobacter虛組菌—株的無細(xì)胞提取物、25mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、50mM的L-山梨糖酮和0.05mM的PMS組成。酶反應(yīng)在3()i:進(jìn)行30分鐘，其中，作隨有l(wèi)()()()rpm的振蕩。按照實(shí)施例4來進(jìn)行活性試驗(yàn)。結(jié)果被展示于表3中。表3:用不同的SNI)H構(gòu)建體來生產(chǎn)維生素C宿主細(xì)胞載體DNA產(chǎn)生的維生素C(mg/L)GOMTR腦::KmPVK1000,0PVSN117473,2PVS扁6845,3PVS皿4860,2序列表〈11()>羅奇維生素股份公司〈120〉編碼醛脫氫酶的基因及其用途〈130>21424〈140>〈141)〈160>9〈170〉PatentlnVer,3,1〈2丄0〉丄〈211雇)8〈212>DNA<213>氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)〈220〉〈221>cds<222>(258),.(2087)〈220>〈221>CDS〈222>(2214),.(3317)〈400>1GCGACTGGCAGCAGCGCAACTATGACCACTATGGCCTGCCGCCCTATTGG50ATCTAACTGATCCAGTAAGCCACCATCAGCCGGCCCCTGCGGGGGCCGGC丄ootttttgcgct腦ccccgccga(;(;tgct(;tcg'i直ctaaggtcacatct150TTACTTCCACATCCGCCCTTGTCAGTTCTGACGTGACAAATTGTCGCGGT200CATGCTGCTGAATGCGGATGCCM;TCCCAGATCCAAGCCCGACGC雄GA250GACGTAGATGTTACCCAAATCATTGMACATAAGMTGGCGCCATGCGCC300TTGTCGCAGCCTCGACCCTTGCGCTGATGATCGGCGCGGGTGCCCATGCG350C'AGGTAMCCCGGTC'GAAGTGCCGGTGGGCGCGAACGAGACC'TTTAC'CTC400GCGCGTGCTGACCACCGGCCTGTCGAACCCTTGG(扁TCACCTGGGGCC450CCGACAATATGCTGTGGGTGACCGAGCGATCTTCCGGCGAAGTGACGCGC500(;TCGACCCCAATACCGGCGAGCA(;固;TCCT(;CTGACCCT(;ACC(;ATTT550CAGCGTCGATGTGCAACACCAGGGCCTACTTGGCCTCGCGCTGCATCCTG600AGTTTATGCAAGAGAGCGGCAACGACTACGTCTATATCGTCTACACTTAT650AACACCGGCACCGAAGAAGCGCCCGATCCGCATCMAAGCTGGTGCGTTA700TGCCTATGACGCTGCCGCGCAGCAGCTGGTCGATCCGGTTGATCTGGTCG750C'AGGCATTCCCGCAGGCAAC'GACC'ACAATGGCGGTCGC'ATCAAATTC'GCC■CCCGATGGCCAACACATCTTTTACACGCTGGGCGAGCMGGCGCGAACTT850TGGCGGTAACTTCCGCCGTCCGAACCACGCGCAACTGCTGCCGACGCAAG■A(認(rèn);(;TCGACGC(;(;(濕TTG(;(;TCGCCTATTCGGGCAA(;ATCCT'(;CGC950GTGAACCTTGACGGCACGATCCCCGAAGACAACCCCGAGATCGAGGGCGT1000GCGTM雄TATCTTTACCTATGGCCACCGTMCCCGCAGG(應(yīng)CACCT1050TTGGCCCCGACGGCACCATTTATGCCACCGAACACGGCCCCGATACGGAT1100GACGAGCTGAACATCATCGCCGGCGGTGGCAACTATGGGTGGCCGAATGT1150GGCCGGCTATCGCGATGGCAMTC'CTATGTCTACGCTGATTGGAGC'C'AAG1200CGCCCGCTGACCAGCGTTACACCGGTCGCGCCGGTATCCCCGACACCGTG1250CCGCAATTCCCCGAGCTGGAATTCGCGCCCGAGATGGTCGATCCGCTGAC1300AACCTATTGGACGGTGGAT'AAT(;AT'隨ATTTCACC(;CCAATTGCGGCT1350GGATCTGTAATCCGACGATCGCGCCTTCGTCTGCCTATTACTATGCGGCG1400GGCGAGAGCGGTATCGCGGCTTGGGATMTTCGATCCTGATCCCGACGCT1450GMACATGGCGGCATCTATGTGCAGCACCTCAGCGATGATGGCCMTCTG1500tcgacggcctgcccgagctgtggttcagc'accc'agaac'cgctatcgc'gat1550atcgagatcagccccgataaccatgtttttgtg(扁ccgacaactttgg1600cacctcggcgcagaaatatggcgagaccggctttaccaacgtgctgcata1650acccc(;gcgcgatccttgtctttagctatgtc(;(濕(;gat(;ct(;c(;ggt17()()cagaccggaatgatgaccgcgcccgcaccgcagacgcaatacacgcaagt1750gcccgccgagggtgcaggcgcgggcgcgactgaggttgcggatgtcgatt1800acgacacgctgttcaccgaaggccagaccctttatggcagcgcatgtgcc1850gcgtgccatggtgccgctggccaaggtgcgcagggcccgacctttgtggg1900c'gtgcc'ggatgtgac'gggtgacaaggactaccttgccc'gcac'catcatcc1950acggttttggcta窗gccgtcgtttgcgactcggctggatgacgaggag2000gttgccgccatcgcgacctttatccgcaacagctggggcaatgacgaagg2050CATCCT(墓cc()(;c隨;(；CCGCTGCCACCC(;CTGAATGCTGTAAAAAC21()()caccctcgcctgcacatcaggcgggggtatttcatttattttcacatctg2150cctttgacatgtgccgc窗cacggt碰tgcggcccttcggctgttctg2200ggtctaagcgggtgtgttgcccgatmgagagacggttcagtccctcccg2250ccctatttagggcccatttaggcagaatagttttgactcatcaaaatatc2300gccgcgcctctggcc'gcggc'cctttcgcaacgtggatatgaaacgctgac2350cgccgtgcagcaagctgtgcttgcgcccgaggctgatggccgcgacctgc2400tggtgtcggcacagaccggttcgggtaagacggtggcctttggtatcgca2450(;tcgc(;cccgaccttttgggcgac(濕atatcctgccgct(;aacacgcc25()()gcctgttgcgctgttcatcgcccccacgcgcgagcttgcgctgcaagttg2550ctcag(直tgacctggctttac(雄雄caggtgcccagatcgcgacc2600tgcgtcggcggtatggattaccgcaccgagcgccgcgcccttgcacgtct2650gccgcaaatcgttgtcggcacgcccggccgtctgcgcgaccatatcgacc2700gtggcggccttgacc'tgtcc'gaattgcgc'gtgaccgtgctggacgaagcg2750gatgagatgctcgacctcggcttcc(扁tgatctgcmtatatcttgca2800agccgcgcccgaagatcgccgcacgctgatgttctcggccaccgtgccgc2850(;隨;attgaaaaactggcccgc(;acttccaaaatgacgccctgcgtctg29()()gaaacccgtggcgaggccaagcagcacaacgacatcagctaccaagcttt2950gtcggtcaccatgc(扁tcgc(扁acgcc組t:['caac雄ctgcgtt3000tttatgmtcgcgcacggcgatcatcttctgcaagacccgcgccmtgtg3050aatgatctgctgtcgcggatgagcggtcgtggcttccgcgtggtggccct3100gtcgggcgagctgtc'gcaac'aggaacgcaccaacgcgc'tgcaagcgc'tgc3150gtgatggccgcgccmcgtttgt雄gcgaccgacgtcgcggcgcgcggc3200attgacttgccgggcctcgagctggtgatccactacgatctgccgaccaa3250tgccgaaaccctgctgcaccgctcgggccgtaccggccgcc(;ggt(扁a33()()gggcgtctcggcgctgatcgtcacccccggcgatttcaaaaaagcgcagc3350gtttgctgagctttgccamgtgaccgcgga雄GG(扁ggcgccttcg3400gccgaaga3408<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>LeuTrpPheSerThrGinAsnArgTyrArgProAspAsnHisValPheValAlaThrAspAlaGinLysTyrGlyGluThrGlyPheThrProGlyAiaHeLeuValPheSerTyrValGlyGinThrGlyMotMotThrAlaProAlaThrGinValProAlaGluGlyAlaGlyAlaAlaAspValAspTyrAspThrLeuPheThrTyrGlySerAlaCysAlaAlaCysHisGlyAlaGinGlyProThrPheValGlyValProLysAspTyrLeuAlaArgThrlielieHisProSerPheAlaThrArgLeuAspAspGluAlaThrPheHeArgAsnSerTrpGlyAsnThrProAlaGluAlaAlaAlaThrArg609〈210>3〈211>14〈212>PR:T〈213〉氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)<M()()>3Gln[Xati/Gly]Asn[Pro/Lys]ValGluValProValGlyAlaAsnGluThr丄4〈21()>4<211>31〈212>:PRT〈213>氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)〈220>〈221>SIGNAL<222>(1),,(31)〈400〉4MetLeuProLysSerLeuLysHisLysAsnGlyAlaMetArgLeu15ValAlaAlaSorThrLouAlaLouMotlieGlyAlaGlyAlaHis30Ala31〈210>5〈211)578〈212>PRT<213>氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)〈220〉〈22DCHAIN<222>(1),,(578)〈400>5GinValAsnProValGluValProValGlyAlaAsnGluThrPhe15AsplieGlulieSer435AsnPheGlyThrSer450AsnValLeuHisAsn465GlyGluAspAiaAla480ProGinThrGinTyr495GlyMaThrGluVal510GluGlyGinThrLeu525AlaAlaGlyGinGly54-0AspValThrGlyAsp555GlyPheGlyTyrMet570GluValAlaAlalie585AspGluC"yHeLeu6()()<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula><211〉丄7<212>DNA〈2丄3〉人工序列〈22()><223>人工合成的引物序列〈400>6carggy朋cccsgtbg;a〈210〉7〈211>17<212>DNA〈2丄3〉人工序列〈22()><223>人工合成的引物序列<22()>〈22l>misc—feature〈222>9〈223>nisaorgorcort<'1()0>7gtytcglAng'crccvac〈21()>8<21丄>15〈212>薩〈213>人工序列〈220>〈223〉人丁合成的引物序列<M()()>8cagggUiacccgg丄c〈21()>9<211>15〈212>:隱〈213>人工序列〈220>〈223〉人T合成的引物序列<'1()()〉9gactcgLUgcgcxc權(quán)利要求一種經(jīng)過分離的編碼醛脫氫酶的核酸分子，所述核酸分子包含與SEQIDNO1的核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸。2.—種經(jīng)過分離的編碼醛脫氫酶的核酸分子，所述核酸分子包含一段多核苷酸，所述多核苷酸與選fi由(a)SEQIDN〔)l中第258-2084位核苷酸、(b)SEQIDN0:1中第351-2084-位核苷酸、(c)SEQIDNO:1屮第258-1955位核苷酸和(d)SEQIDN():l屮第351-1955位核-伊酸所構(gòu)成的組的多核.伊酸至少95%相同。3.—種經(jīng)過分離的編碼醛脫氫酶的核酸分了，所述核酸分了包含選自由(a)編碼具有SEQIDNO:2中氨基酸序列的多肽的多核苷酸、(b)編碼由SEQIDNO:2中第32-609位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核苷酸、(c)編碼由SKQII)N():2中第卜566位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核——ff酸和(d)編碼由SEQIDN0:2中第32-566位氨基酸所構(gòu)成的多肽的多核苷酸所構(gòu)成的組的多核苷酸。4.一種經(jīng)過分離的核酸分子，所述核酸分子編碼具有醛脫氫酶活性的多肽，并能在標(biāo)準(zhǔn)條件下與如權(quán)利要求卜3屮任意一項(xiàng)所述的核酸分子的互補(bǔ)鏈雜交。5.-—種表達(dá)載體，其中包含如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的核酸分子。6.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其中，所述的載體選自選自tilpQE、pUC、p:BluescriptII、pACYCi77、pACYCi84、pVKiOO和RSFiOiO所構(gòu)成的組的載休或其衍牛物。7.—種重組微生物,其是經(jīng)權(quán)利要求5的載體轉(zhuǎn)化而來的。8.-浙重組微生物，其中包含整合到其染色體DNA上的如權(quán)利耍求1-4中任意-鄰所述的核酸分子。9.如權(quán)利要求7或8所述的重組微生物，其中所述的微生物選自由細(xì)菌、酵母和植物細(xì)胞所構(gòu)成的組。10.如權(quán)利要求9所述的重組微生物，其中所述的微生物選自由Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas、K:Lebsiella、Acinetobacter禾口Escherichia所構(gòu)成的組。11.如權(quán)利要求丄O所述的重組微牛物，其中所述的微牛物是Gluconobaderoxydtms國4025o12.-,中從L-山梨糖fi時(shí)生產(chǎn)2-酮基-L-古洛糖酸(2-KGA)和/或維生素C的方法，所述方法包括(a)在合適的培養(yǎng)基l:培養(yǎng)如權(quán)利要求7或8所述的重組微生物；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收及分離2-KGA和/或維生素C。13.—種從L-山梨糖酮生產(chǎn)2-KGA的方法，所述方法包括(a)在合適的培養(yǎng)某上培養(yǎng)屬于GluconobacteroxydansDSM4025的微生物，其中，所述微生物里編碼SEQ丄DNO:2所表不的醛脫氫酶的基因已經(jīng)被破壞掉；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收及分離2-KGA。14.-一種牛產(chǎn)醛脫氫酶的方法，所述方法包括Oi)在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)包含如權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的核酸分子的重組微生物；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收及分離醛脫氫酶。全文摘要本發(fā)明涉及編碼醛脫氫酶(SNDH)的DNA、含有所述DNA的表達(dá)載體和含有所述DNA的重組生物。此外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)重組醛脫氫酶蛋白質(zhì)的方法，以及用重組醛脫氫酶蛋白質(zhì)或者用含有所述表達(dá)載體的重組生物從L-山梨糖酮來生產(chǎn)L-抗壞血酸(維生素C)和/或2-酮基-L-古洛糖酸(2-KGA)的方法。本發(fā)明還提供了用其中編碼所述醛脫氫酶的基因已經(jīng)被破壞掉的微生物來生產(chǎn)2-KGA的方法。文檔編號(hào)C12N1/19GK101693896SQ20091017559公開日2010年4月14日申請(qǐng)日期2003年9月22日優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日發(fā)明者宮崎太郎,星野達(dá)雄,杉澤輝秀申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司;