專利名稱：用于定量檢測egfr突變的試劑盒的制作方法
用于定量檢測EGFR突變的試劑盒
背景技術(shù)：
表皮生長因 子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一種廣泛分布于
人體各組織細胞膜上的多功能糖蛋白，是HER/ErbB家族成員之一，與腫瘤增殖、血管 生成、腫瘤轉(zhuǎn)移和抗細胞凋亡有關。大多數(shù)腫瘤細胞表達EGFR及其天然配體，結(jié)合后可引起自身的磷酸化，通過 一系列反應將信號傳遞到核內(nèi)，從而通過影響腫瘤細胞的生長凋亡，腫瘤血管生成，來 影響腫瘤的發(fā)展與演進。有研究表明EGFR在癌癥啟動和進展階段發(fā)揮重要作用。針對EGFR的靶向治 療藥物，如阿瓦斯丁(AVASTIN)、特羅凱(Erlotinib)，吉非替尼(Irressa)等EGFR酪氨 酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)能通過阻斷腫瘤細胞EGFR信號傳導，來抑制腫瘤細胞的增 生、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成并促進腫瘤細胞的凋亡。但是臨床實踐顯示僅有8-18%的非小細胞肺癌患者可以受益于易瑞沙等EGFR 酪氨酸激酶抑制劑(Paez JG，etal，Science, 2004，304 1497-1500 ； Sequist LV，et al，Oncologist, 2007，12(1): 90-8)。目前發(fā)現(xiàn)，攜帶EGFR基因突變的病人療效顯
著，突變的頻率與易瑞沙相對敏感的人群相一致女性多于男性；非吸煙者多于吸煙 者；腺癌多于其他；東方人多于西方人。通過對易瑞沙相對敏感患者組織EGFR基因 的突變分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)個體在EGFR基因酪氨酸激酶區(qū)域發(fā)生突變。這些突變主要集 中在外顯子 18-21 上(Chan SK，et al, Eur J Cancer, 2006，42(1) 17-23)。因此， 通過EGFR基因18-21號外顯子的突變檢測可以很好預測易瑞沙等分子靶向藥物的治療 效果。本發(fā)明主要考慮中國人EGFR基因突變的熱點位點(韓宇等，中華腫瘤學雜志， 2007，29(4) 278-282 ；郭健等，中國肺癌雜志，2007，10(6) 504-507)，通過實時 定量PCR方法檢測分子靶向抗腫瘤藥療效相關的腫瘤相關基因EGFR第18、19、21外顯 子5種類型的突變情況，通過本發(fā)明EGFR基因突變檢測來預測易瑞沙等分子靶向藥物的 治療效果。本發(fā)明采用的檢測方法具有以下幾個優(yōu)點操作簡單，易于標準化。其它方法 如等位基因特異的寡核苷酸探針雜交法，對雜交的條件非常敏感，需要嚴格控制實驗條 件；限制性片段長度多態(tài)性實驗需投入相當?shù)娜肆Σ僮?，且不能定量。實驗周期短? 小時內(nèi)就可以完成。不需要測序驗證結(jié)果，而直接測序法與高分辨溶解曲線分析需要4 天-2周。敏感度高，我們通過對實驗條件進行優(yōu)化，突變檢測的敏感度可達到1%，而 直接測序法敏感度20-50%。特異性高，免疫組化方法假陽性與假陰性率高，且不能確定 點突變的位置和類型；定量準確，這是本發(fā)明實驗方法最獨特的優(yōu)點，通過絕對定量法 處理數(shù)據(jù)，從而繪制標準曲線，精確測定樣本中野生型與突變型基因的含量，進而得到 突變型基因所占比例，輔助臨床診斷和用藥。另外，本發(fā)明安全無毒性，其它方法如錯 配堿基的化學斷裂法需要用到同位素和劇毒化學試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供一種EGFR基因突變的定量檢測試劑盒。定量檢測EGFR基因第18外顯子(SEQ ID NO 1 ； SEQ ID NO 2) 2155位G堿基置換為A堿 基；第19外顯子(SEQ ID NO 1 ； SEQ ID NO 3) 2235-2249位堿基缺失；第19外顯 子2236-2250位堿基缺失；第19外顯子2254-2277位堿基缺失；第21外顯子(SEQ ID NO 1 ； SEQ ID NO 4) 2573位T堿基置換為G堿基的突變情況。為解決上述問題，本發(fā)明提供包含Taq酶、10 X Taq緩沖液、MgCl2、dNTP混合 液及可特異性擴增EGFR基因突變位點序列的PCR引物與可特異性識別野生型與突變型 序列的探針的定量檢測試劑盒及檢測方法(1)分別在EGFR基因第18、19、21外顯子突變位點附近設計上下游引物，以 及根據(jù)每個突變位點的突變情況設計特異性的探針，該探針可與EGFR特定位點的野生 型或欲檢測的突變型序列特異性結(jié)合，從而確定該位點有無發(fā)生所檢測的基因突變。(2)為精確定量所測EGFR突變比例，本發(fā)明設計了標準品。(3)對待測樣品與標準品進行熒光定量PCR檢測。(4)由標準品檢測結(jié)果得到用于定量的標準曲線，由標準曲線計算得到待測樣品 核酸的EGFR基因突變占總體EGFR基因的比例。所述步驟(1)之前還包括對待測樣品中的核酸進行提取、純化和濃度測定。熒光定量PCR檢測所用探針在適宜的PCR條件下與EGFR基因突變位置的堿基 序列特異性結(jié)合。所述探針優(yōu)選在5’端連接有熒光發(fā)光基團，3’端連接有熒光淬滅基 團。所述的熒光發(fā)射基團選自FAM、ΤΕΤ、HEX、ROX ；所述的熒光淬滅基團選自 BHQ, TAMARA。優(yōu)選的，所述熒光發(fā)射基團為FAM，所述的熒光淬滅基團為BHQ。 所述探針的序列優(yōu)選為 SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQID NO: 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQID NO 38、SEQ ID NO 39、 SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 41 或 SEQ ID NO: 42。所述標準品至少包括質(zhì)粒、基因組DNA或化學合成序列中的一種。優(yōu)選地，所述 標準品包含野生型質(zhì)粒和/或突變型質(zhì)粒，其中野生型質(zhì)粒包含EGFR基因野生型序列， 突變型質(zhì)粒包含EGFR基因突變型序列。更優(yōu)選地，所述標準品由野生型質(zhì)粒和/或突變 型質(zhì)粒組成。優(yōu)選地，所述野生型質(zhì)粒包含的EGFR基因野生型序列為SEQ ID NO 46、 SEQID NO 48或SEQ ID NO: 52;所述突變型質(zhì)粒包含的EGFR基因突變型序列為SEQ IDNO 47、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 51 或 SEQ ID NO: 53。所述待檢樣品包括新鮮組織、石蠟包埋組織、細胞株、血液、胸腔積液、腹腔 積液、唾液、消化液、尿液、唾液、糞便。所述引物由上游引物與下游引物組成。所述引物優(yōu)選為SEQ IDNO : 5、SEQ IDNO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ IDNO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15 或 SEQ ID NO 16。所述的EGFR基因突變的定量檢測試劑盒包括選自以下的試劑如上所述的引 物、探針和標準品。所述試劑盒優(yōu)選還包括Taq酶、10 X Taq緩沖液、MgCl2、dNTP混合液。優(yōu)選的引物與探針的比例為2 1-10 1，優(yōu)選的正向與反向引物之間的比例為 1:3-3: 1。標準品包括以上所述的質(zhì)粒按一定比例的混合，野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒 的含量的比例分別為0% -100%。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是本發(fā)明實施例2所用質(zhì)粒標準品構(gòu)建方法示意圖。圖2是本發(fā)明實施例2野生型質(zhì)粒圖譜，箭頭所指即為載體中插入野生型PCR產(chǎn) 物序列的位置。圖3是本發(fā)明實施例2的野生型質(zhì)粒標準品測序結(jié)果圖，其中圖A是EGFR 18 外顯子2155G野生型質(zhì)粒測序圖，圖B是EGFR19外顯子2235-2249位、2236-2250位、 2254-2277位野生型質(zhì)粒測序圖，圖 C是EGFR 21外顯子2573位T野生型質(zhì)粒測序圖。圖4是本發(fā)明實施例2的突變型質(zhì)粒標準品測序結(jié)果圖，箭頭所指為堿基突變位 點。其中圖A是EGFR 18外顯子2155G —A突變質(zhì)粒測序圖，圖B是EGFR 19外顯子
2235-2249位缺失突變質(zhì)粒測序圖，圖C是EGFR19外顯子2236-2250位缺失突變質(zhì)粒測 序圖，圖D是EGFR 19外顯子2254-2277位缺失突變質(zhì)粒測序圖，圖E是EGFR 21外顯 子第21外顯子2573位T — G突變質(zhì)粒測序圖。圖5是本發(fā)明實施例3的標準品擴增曲線圖，其中圖A是￡0 1118外顯子21550 野生型質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖B是EGFR 19外顯子2235-2249位、2236-2250位、 2254-2277位野生型質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖C是EGFR 21外顯子2573位T野生型質(zhì) 粒標準品擴增曲線，圖D是EGFR 18外顯子2155G —A突變質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖E 是EGFR19外顯子2235-2249位缺失突變質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖F是EGFR 19外顯子
2236-2250位缺失突變質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖G是EGFR19外顯子2254-2277位缺失突 變質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖H是EGFR 21外顯子2573位T — G突變質(zhì)粒標準品擴增曲 線。圖6是根據(jù)圖4繪制的標準曲線圖，其中圖A是EGFR 18外顯子2155G野生型質(zhì) 粒標準曲線，圖B是EGFR 19外顯子2235-2249位、2236-2250位、2254-2277位野生型 質(zhì)粒標準曲線，圖C是EGFR 21外顯子2573位T野生型質(zhì)粒標準曲線，圖D是EGFR18 外顯子2155G — A突變質(zhì)粒標準曲線，圖E是EGFR 19外顯子2235-2249位缺失突變質(zhì) 粒標準曲線，圖F是EGFR 19外顯子2236-2250位缺失突變質(zhì)粒標準曲線，圖G是EGFR 19外顯子2254-2277位缺失突變質(zhì)粒標準品標準曲線，圖H是EGFR 21外顯子2573位 T — G突變質(zhì)粒標準品標準曲線圖7是本發(fā)明實施例3檢測的組織樣本EGFR 21外顯子2573位野生型(圖A) 與T —G置換突變型(圖B)熒光定量PCR擴增曲線圖，組織樣本EGFR 19外顯子野 生型(圖C)與2235-2249位缺失突變型(圖D)熒光定量PCR擴增曲線圖，全血樣本 EGFR 19外顯子2236-2250位缺失突變型(圖E)熒光定量PCR擴增曲線圖，全血樣本 EGFR2254-2277位缺失突變型(圖F)熒光定量PCR擴增曲線圖，細胞系樣本EGFR 18 外顯子2155位野生型(圖G)與G —A置換突變型(圖H)熒光定量PCR擴增曲線圖。圖8是本發(fā)明的定量方法示意圖。實施例

以下的實施例用于為本領域中的普通技術(shù)人員提供有關如何實施和使用本發(fā)明 的完整披露和描述，并且這些例子并非意在對發(fā)明人所認為的發(fā)明范圍進行限制，亦非 意指下文的實驗是被實施的全部實驗而且是僅可實施的實驗。實施例中未注明具體條件 的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南第三版(Sambrook J.)，或按照 廠商所建議的條件。棚仿丨丨1: kmmimmmm,夕卜胤血、瞧、λ糊胞名某 因組DNA抽提我們所測試的人類癌細胞系包括非小細胞肺癌(NSCLC) (Α549、Η460、Η838和 Η1703)、乳腺癌(MCF-7，ΒΤ474和HuLlOO)、惡性多間皮瘤細胞系(Η513，Η2052, Η290, MS-I和Η28)、結(jié)腸癌細胞系(SW480)、頭頸癌細胞系(U87)、子宮頸癌 (Hela)、肉瘤細胞系(Mes-SA、Saos-2 和 A204)。我們所測試的人類新鮮腫瘤組織、外周血、石蠟包埋組織包括NSCLC、間皮 瘤、結(jié)腸癌、惡性黑素瘤、腎癌、食道癌、甲狀腺癌、惡性毒瘤和卵巢癌。標本DNA抽提可以使用Qiagen公司、Promega公司、Roche公司的DNA提取試劑盒提取樣本 基因組DNA，使用Gene公司Nanodrop NDlOOO型核酸微量測量儀檢測所提DNA濃度與 純度(OD260/C)D280約為1.8，00260/00230大于2.0)。下面以使用Promega公司的 DNA提取試劑盒為例介紹樣本DNA提取步驟1.新鮮組織DNA抽提(1)用剪刀切取約黃豆粒大小的組織，置于研缽中，將組織剪碎，加液氮研成粉末。(2)加入600 μ 1預冷的裂解液于研缽中，用Iml大槍頭吹打6次，盡量使組織粉 末與裂解液混勻，轉(zhuǎn)移混合物到1.5ml EP管中，上下顛倒6次混勻后65°C水浴20分鐘。(3)加3 μ 1的RNA酶，上下顛倒6次混勻，37°C水浴20分鐘。(4)冷卻到室溫，加200 μ 1蛋白沉淀劑，上下顛倒6次混勻，冰上放置5分鐘后 13,000*g，室溫離心4分鐘。(5)轉(zhuǎn)移上清至事先加600 μ 1異丙醇(室溫)的新EP管中，輕柔混勻6次后 13,000*g，室溫離心1分鐘。(6)棄上清，加600μ170%乙醇(室溫)至沉淀中，上下顛倒6次混勻后 13,000*g，室溫離心1分鐘。(7)吸干乙醇，空氣干燥15分鐘。(8)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小時或4°C過夜。2.石蠟包埋組織DNA抽提(1)將Img或少于Img的組織放入1.5ml離心管內(nèi)。(2)加入新鮮制備的ΙΟΟμΙ溫育緩沖液/蛋白酶K溶液。根據(jù)樣品的類型，56°C 溫育過夜。(3)取出溫育的樣品管，加入兩倍體積的裂解緩沖液。
(4)高速渦 旋振蕩樹脂10秒鐘至樹脂完全懸浮，加入7μ1完全懸浮的樹脂。高 速渦旋振蕩3秒鐘后室溫溫育5分鐘。(5)高速渦旋振蕩2秒鐘，將管子放在MagneSphere '磁分離架上。磁分離 立刻進行。(6)小心去除所有溶液，不要觸碰管壁上的樹脂。(7)加入100 μ 1裂解緩沖液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩2秒鐘。(8)將管子放回到磁分離架上，并去除所有的裂解液。(9)加入100 μ 1配制的Ix洗滌液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩2秒鐘。(10)將管子放回到磁分離架上，去掉所有洗滌液。(11)重復步驟9和10兩次，共3次洗滌，并確保在最后一次洗滌后，除去所有 的液體。(12)打開蓋子，將管子放在磁分離架上，空氣中干燥5分鐘。(13)加入25 μ 1洗脫液。(14)蓋上管蓋并高速渦旋振蕩2秒鐘。65°C溫育5分鐘。(15)取出溫育的管子，高速渦旋振蕩2秒鐘。立即放到磁分離架上。(16)將DNA溶液小心地轉(zhuǎn)移到選定的容器中。3.全血DNA抽提(1)收集抗凝全血300 μ 1，加入900 μ 1細胞裂解液，用Iml槍頭吹打混勻6次， 盡量使全血與細胞裂解液混勻，室溫放置10分鐘，期間用Iml槍頭吹打混勻3次。(2) 13,000*g，室溫離心20秒后棄上清，劇烈震蕩，加入300 μ 1預冷的裂解液， 用Iml槍頭吹打混勻至沉淀完全溶解。(3)力卩1.5 μ 1的RNA酶，上下顛倒6次混勻，37°C水浴20分鐘。(4)冷卻到室溫，力Π 100 μ 1蛋白沉淀劑，上下顛倒6次混勻，冰上放置5分鐘后 13,000*g，室溫離心4分鐘。(5)轉(zhuǎn)移上清至事先加300 μ 1異丙醇(室溫)的新EP管中，輕柔混勻6次后 13,000*g，室溫離心1分鐘。(6)棄上清，加Iml 70%乙醇(室溫)至沉淀中，上下顛倒6次混勻13,000*g，
室溫離心1分鐘。(7)吸干乙醇，空氣干燥15分鐘。(8)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小時或4°C過夜。4.胸水DNA抽提(1)收集胸水5ml，2000rpm室溫離心10分鐘，取上清加入Iml細胞裂解液，顛
倒混勻6次，室溫放置10分鐘。(2) 13,000*g，室溫離心20秒后棄上清，劇烈震蕩，加入Iml預冷的裂解液，混
勻至沉淀完全溶解。(3)加3 μ 1的RNA酶，上下顛倒6次混勻，37°C水浴20分鐘。(4)冷卻到室溫，加200 μ 1蛋白沉淀劑，上下顛倒6次混勻，冰上放置5分鐘后 13,000*g，室溫離心4分鐘。
(5)轉(zhuǎn)移上清至事先加5ml異丙醇(室溫)的新EP管中，輕柔混勻6次后 13,000*g，室溫離心1分鐘。(6)棄上清，加Iml 70%乙醇(室溫)至沉淀中，上下顛倒6次混勻13,000*g，
室溫離心1分鐘。(7)吸干乙醇，空氣干燥15分鐘。(8)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小時或4°C過夜。5.細胞系DNA抽提(1)收集至少約IXlO6的細胞并轉(zhuǎn)移至1.5ml的EP管中，13,000*g，室溫離心
10秒，如果是貼壁細胞，收集細胞前要用胰酶消化。 (2)棄上清，力Π 200 μ 1 PBS洗細胞，13,000*g，室溫離心10秒后，棄上清，劇
烈震蕩至沉淀混懸。(3)加入600 μ 1預冷的裂解液，用Iml大槍頭吹打混勻至沒有肉眼可見的細胞塊。(4)力卩3 μ 1的RNA酶，上下顛倒6次混勻，37°C水浴20分鐘。(5)冷卻到室溫，加200 μ 1蛋白沉淀劑，上下顛倒6次混勻，冰上放置5分鐘后 13,000*g，室溫離心4分鐘。(6)轉(zhuǎn)移上清至事先加600 μ 1異丙醇(室溫)的新EP管中，輕柔混勻6次后 13,000*g，室溫離心1分鐘。(7)棄上清，加600μ170%乙醇(室溫)至沉淀中，上下顛倒6次混勻后 13,000*g，室溫離心1分鐘。(8)吸干乙醇，空氣干燥15分鐘。(9)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小時或4°C過夜。實施例2 含突變型與野生型檢測序列的質(zhì)粒標準品的準備1.野生型質(zhì)粒構(gòu)建(圖1，圖2)1.1載體的準備TA克隆載體pMD18_T購自TAKARA公司。1.2插入片段的準備使用PCR方法制備插入片段，PCR的模板為經(jīng)步驟1提取的樣本基因組DNA， 反應體系與擴增條件如下表(表1、表2、表3)表1 PCR 反應體系(50 μ 1)
權(quán)利要求
1.一種聚合酶鏈式反應引物，其在適宜的PCR條件下與EGFR基因突變位置的上下 游200個以內(nèi)的核苷酸結(jié)合。
2.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物由上游引物與下游引物組成。
3.一種熒光定量PCR探針，其在適宜的PCR條件下與EGFR基因突變位置的堿基序 列特異性結(jié)合。
4.如權(quán)利要求3所述的探針，其特征在于，所述探針5’端連接有熒光發(fā)光基團， 3’端連接有熒光淬滅基團。
5.一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含待檢測的EGFR基因野生型序列。
6.如權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒包含的EGFR基因野生型序列為 SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 48 或 SEQ ID NO 52。
7.一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含待檢測的EGFR基因突變型序列。
8.如權(quán)利要求7所述的質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒包含的EGFR基因突變型序列為 SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 50、SEQID NO 51 或 SEQ ID NO:53。
9.一種EGFR基因突變的定量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括選自以下的 試劑如權(quán)利要求1或2所述的引物、權(quán)利要求3或4所述的探針、以及權(quán)利要求5和/ 或7所述的質(zhì)粒。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，引物與探針的比例為2 1-10 1， 正向與反向引物之間的比例為1 3-3 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及與分子靶向抗癌藥物療效相關的EGFR基因突變檢測方法及檢測試劑盒。尤其涉及一種在EGFR基因突變熱點區(qū)域檢測突變的熒光定量PCR檢測方法、試劑盒及其應用。本發(fā)明對EGFR基因特定位點的突變進行檢測，并可對分子靶向抗腫瘤藥EGFR酪氨酸激酶抑制劑進行療效預測，進而對腫瘤患者的臨床個體化用藥方案提供指導。
文檔編號C12N15/63GK102021232SQ20091017685
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月22日
發(fā)明者李雋 , 許軍普, 陳釗 申請人:北京雅康博生物科技有限公司