專利名稱：：一種用于檢測(cè)細(xì)胞嵌合狀態(tài)或個(gè)體識(shí)別的基因檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)細(xì)胞嵌合狀態(tài)或個(gè)體識(shí)別的基因檢測(cè)試劑盒和核苷酸序列及其使用方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：利用不同生物個(gè)體各自的獨(dú)特的基因信息來(lái)區(qū)分不同的個(gè)體或細(xì)胞的個(gè)體來(lái)源，可用于檢測(cè)與自身免疫病有關(guān)的分娩后母子細(xì)胞長(zhǎng)期存在的微嵌合狀態(tài)，造血干細(xì)胞或者其他器官移植后供者/受者細(xì)胞嵌合狀態(tài)，白血病造血干細(xì)胞移植后微小殘留病等，在法醫(yī)物證鑒定、親子鑒定和其他醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面有著廣泛的應(yīng)用?；蚪M是包含著一個(gè)人所有遺傳信息的片段，與生具有，并且終身保持不變。這種遺傳信息蘊(yùn)含在人的骨骼、毛發(fā)、血液等所有人體組織或器官中。由于人類基因組中有著數(shù)量眾多的多種類型的多態(tài)性位點(diǎn)，不同個(gè)體之間往往在很多位點(diǎn)上都有差異，并且進(jìn)行基因檢測(cè)只需微量的標(biāo)本即可進(jìn)行。利用基因多態(tài)性進(jìn)行個(gè)體識(shí)別已經(jīng)成為法醫(yī)和臨床檢測(cè)廣泛使用的方法。近年來(lái)已開發(fā)出多種遺傳標(biāo)記用于個(gè)體識(shí)別。其中短串聯(lián)重復(fù)序列(ShortTandemRepeat簡(jiǎn)稱STR)由于檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高、擴(kuò)增片段大小適中，目前已發(fā)展為各法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室最常用的個(gè)體識(shí)別檢測(cè)標(biāo)記。但由于不同的微衛(wèi)星多態(tài)性片段之間片段大小差異很少(常為35個(gè)堿基長(zhǎng)度)，因此需要高分辨率的電泳方法(聚丙烯酰胺凝膠電泳或使用測(cè)序儀分析)才能進(jìn)行檢測(cè)。由于聚丙烯酰胺凝膠電泳操作復(fù)雜，穩(wěn)定性差，已逐漸趨于淘汰；而測(cè)序儀的成本昂貴，限制了此技術(shù)的廣泛應(yīng)用。遺傳學(xué)上嵌合體(Chimerism)的定義是同一個(gè)體體內(nèi)不同遺傳性狀的細(xì)胞嵌合或混雜表現(xiàn)。這種一個(gè)機(jī)體同時(shí)有兩種或兩種以上染色體組成不同的細(xì)胞系同時(shí)存在的狀態(tài)稱為嵌合狀態(tài)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，分娩后母子細(xì)胞長(zhǎng)期存在的微嵌合狀態(tài)，與自身免疫病有關(guān)；造血干細(xì)胞或者其他器官移植后供者/受者細(xì)胞嵌合狀態(tài)和預(yù)后有關(guān)，白血病造血干細(xì)胞移植后微小殘留病嵌合狀態(tài)等和治療直接相關(guān)。對(duì)于疾病機(jī)理和治療的研究、患者病情的檢測(cè)都有重要意義。例如，在異體造血干細(xì)胞移植中，被植入的干細(xì)胞來(lái)源于與患者不屬于同一個(gè)體的供者，這些干細(xì)胞植入患者體內(nèi)后，雖然能夠在患者體內(nèi)生長(zhǎng)自己，但其攜帶的基因遺傳信息仍舊是屬于供者的信息，因此便形成了嵌合現(xiàn)象。因此供受者細(xì)胞嵌合狀態(tài)的監(jiān)測(cè)是造血干細(xì)胞移植成功與否的重要指標(biāo)，目前多采用STR方法來(lái)檢測(cè)造血干細(xì)胞移植后的植入狀態(tài)。微嵌合現(xiàn)象(Microchimerism)是指某一個(gè)體的少量細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)體內(nèi)的現(xiàn)象。一般稱混合的細(xì)胞中一種個(gè)體來(lái)源的成分低于1%時(shí)為微嵌合，而所有來(lái)源的成分比例均大于1%時(shí)為嵌合狀態(tài)。早在上世紀(jì)50年代就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，母親可能會(huì)將自己的細(xì)胞傳輸給胎兒，并且在胎兒出生后，母體來(lái)源的細(xì)胞還會(huì)長(zhǎng)期在孩子體內(nèi)存在甚至數(shù)十年之久。后來(lái)還發(fā)現(xiàn)，分娩后母親的體內(nèi)也可能會(huì)長(zhǎng)期攜帶少量的來(lái)源于孩子的細(xì)胞。目前的研究已知這種母子嵌合的現(xiàn)象和一些自身免疫性疾病有關(guān)，但還有更多的機(jī)理有待研究者探索。近年來(lái)，隨著器官移植的應(yīng)用和研究的深入，研究者還發(fā)現(xiàn)在器官移植中也廣泛存在微嵌合現(xiàn)象。如在心臟移植或腎臟移植的患者體內(nèi)可以檢測(cè)到少量來(lái)源于供者的細(xì)胞長(zhǎng)期存在于患者的外周血中，這種微嵌合現(xiàn)象和移植物的排斥和耐受有關(guān)。與個(gè)體識(shí)別不同的是，個(gè)體識(shí)別是用來(lái)檢測(cè)兩個(gè)標(biāo)本是否分別來(lái)源于同一個(gè)個(gè)體，或者是否具有遺傳學(xué)上的血緣關(guān)系；而嵌合狀態(tài)分析的是在一份標(biāo)本中，不同個(gè)體來(lái)源的細(xì)胞成分各占多少。因此，個(gè)體識(shí)別是根據(jù)不同標(biāo)本的多態(tài)性位點(diǎn)信息進(jìn)行比較分析，以對(duì)其遺傳學(xué)上是否屬于同一個(gè)體或是否具有血緣關(guān)系進(jìn)行評(píng)估；而嵌合率的分析是根據(jù)已知的分別屬于兩個(gè)或多個(gè)不同個(gè)體的多態(tài)性信息為線索，來(lái)定量分析混合標(biāo)本中兩個(gè)或多個(gè)不同個(gè)體細(xì)胞所占的比例。因此嵌合狀態(tài)的檢測(cè)要求可以定量分析，尤其是微嵌合狀態(tài)的檢測(cè)要求更高靈敏度的檢測(cè)方法。而目前常規(guī)應(yīng)用的STR方法進(jìn)行嵌合狀態(tài)檢測(cè)時(shí)，由于檢測(cè)方法和儀器的限制，檢測(cè)靈敏度只能達(dá)到1%,因此不能進(jìn)行微嵌合的分析。目前進(jìn)行微嵌合研究時(shí)，多采用在女性標(biāo)本內(nèi)檢測(cè)Y染色體特異性基因的方法。此方法具有特異性好，檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)。但由于Y染色體只存在于男性細(xì)胞，因此該方法只能用來(lái)檢測(cè)女性標(biāo)本內(nèi)男性來(lái)源的細(xì)胞，通用性差，造成多數(shù)標(biāo)本無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)和分析。另一種較常用的方法是根據(jù)HLA位點(diǎn)的多態(tài)性，根據(jù)兩個(gè)個(gè)體HLA位點(diǎn)多態(tài)性的差別，結(jié)合巢式位點(diǎn)特異性PCR方法來(lái)增加檢測(cè)靈敏度。但由于HLA位點(diǎn)多態(tài)性很強(qiáng)，往往需要對(duì)每一對(duì)標(biāo)本都要特別設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，而且不能進(jìn)行定量分析。隨著基因組研究的進(jìn)展，新一代的多態(tài)性位點(diǎn)相繼被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。也有研究者采用單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphisms,SNP)位點(diǎn)來(lái)設(shè)定個(gè)體識(shí)別的檢測(cè)方案。但由于單核苷酸多態(tài)性的等位基因間差異只有一個(gè)堿基，因此難以設(shè)定高靈敏度的檢測(cè)方案，檢測(cè)靈敏度往往只能達(dá)到1%，仍然不能用于微嵌合的檢測(cè)。而且SNP定量方法復(fù)雜，實(shí)用性差。INDELs(insertionsanddeletions,即插入和缺失)多態(tài)性是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新一代的多態(tài)性位點(diǎn)，是指基因組中插入或缺失了不同類型和大小的小片段DNA。相對(duì)于STR多態(tài)性，由于STR位點(diǎn)為不同數(shù)目的重復(fù)序列，因此無(wú)法通過(guò)設(shè)定位點(diǎn)特異性PCR引物的方法來(lái)提高檢測(cè)靈敏度；而INDELs多態(tài)性是缺失或插入的變異，而且缺失或插入的片段可以是幾個(gè)至幾百個(gè)堿基不等，因此可以通過(guò)設(shè)計(jì)位點(diǎn)特異性PCR引物的方法來(lái)對(duì)插入/缺失的等位基因型進(jìn)行區(qū)分。相對(duì)于SNP多態(tài)性，由于SNP是單堿基的替換突變，不同等位基因間序列差異較小，因此根據(jù)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)的位點(diǎn)特異性引物只有3'末端一個(gè)堿基是特異性的，難以提高檢測(cè)靈敏度；但I(xiàn)NDELs多態(tài)性的缺失或插入的等位基因型之間的差異可以是幾個(gè)甚至幾百個(gè)堿基，因此不同位點(diǎn)的特異性引物之間可以有很大的差異，因此可以大大提高引物的特異性和檢測(cè)靈敏度。此外，確定一些個(gè)體的基因INDELs多態(tài)性特征在法醫(yī)物證鑒定、親子鑒定和其他醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面有著廣泛的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一組用以檢測(cè)人體內(nèi)異體細(xì)胞嵌合狀態(tài)、微嵌合狀態(tài)或?qū)Σ煌瑐€(gè)體進(jìn)行基因識(shí)別的寡核苷酸。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異、靈敏、高效的用于檢測(cè)細(xì)胞嵌合狀態(tài)或個(gè)體識(shí)別的基因檢測(cè)試劑盒。該試劑盒可用于母子細(xì)胞微嵌合，造血干細(xì)胞或者其他器官移植后供者/受者細(xì)胞嵌合狀態(tài)，白血病造血干細(xì)胞移植后殘留病的檢測(cè)，法醫(yī)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定等。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案本發(fā)明提供一組用于檢測(cè)細(xì)胞嵌合狀態(tài)或個(gè)體識(shí)別的寡核苷酸，為序列表SEQIDNo.l至序列表SEQIDNo.32所示堿基序列的寡核苷酸；其中，SEQIDNo.l為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs2308010多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.2為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs2308010多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.3為rs2308010多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.4為rs2308010多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.5為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs4150017多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.6為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs4150017多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.7為rs4150017多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.8為rs4150017多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.9為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs2307553多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.10為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs2307553多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.ll為rs2307553多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.12為rs2307553多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.13為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs2308144多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.14為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs2308144多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.15為rs2308144多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.16為rs2308144多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.17為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs4646006多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.18為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs4646006多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.19為rs4646006多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.20為rs4646006多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.21為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs34132048多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.22為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs34132048多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.23為rs34132048多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.24為rs34132048多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.25為檢測(cè)插入多態(tài)性的rsl610932多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.26為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rsl610932多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.27為rsl610932多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.28為rsl610932多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.29為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs56024302多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.30為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs56024302多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.31為rs56024302多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.32為rs56024302多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物。各種引物的序列詳見表1，其中擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為該引物和下游引物(R)配對(duì)所得的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度。7_表1.引物序列_多態(tài)性位點(diǎn)5'-3'核苷酸序列擴(kuò)增片段序列表編號(hào)引物編號(hào)長(zhǎng)度(bp)rs2308010+CTGACTAGCAACAAGCGTGGAATTAGTCAG149SEQIDNo::1rs2308010AGTCCTGCAACAAGCGTGGAATTAGGACT144SE(JIDNo::2rs2308010GAACTTATGCAATATTACTGCCATCAAGTTC348SEQIDNo::3rs2308010RCTCGTTTGTGTGATCATCAAACTCAACGAGSEQIDNo:4rs4150017+AGACAGGTACGGTGTGATGCCACTGTCT170SEQIDNo:5rs4150017—ATCAAGGTACGGTGTGATGCCACTTGAT166SEQIDNo:6rs4150017FACAAGGAGTGCAACAGAACGAGACCTTGT350SEQIDNo:rs4150017RGTCTTGTCCTTTCAACGGTTTCCAAGACSEQIDNo:8rs2307553+GTCAGTGCAAAGTGGGCATTTGACTGAC163SEQIDNo:9rs2307553—CTCTGTGCAAAGTGGGCATTTGACAGAG159SEQIDNo:10rs2307553FGAAAGTGACATGTGTATTAGACCTGCCACTTTC225SEQIDNo:11rs2307553RGCTCACATGAGTGCACAGCCATGAGCSEQIDNo:12rs2308144+CTTCATTGTCCTCGCCTCCATGAAG140SEQIDNo:13rs2308144一CTTCAGCACCTTGTCCTCGCCTGAAG141SEQIDNo:14rs2308144FCTGCTTGATGTCTGTCAGCCTTCTAAGCAG259SEQIDNo:15rs2308144RCTGATTGCGTCACCATTTGTGAATCAGSEQIDNo:16rs4646006+TGAGTGCTGGTAAATGGCACACACTCA228SEQIDNo:17rs4646006_TGCACCTGGTAAATGGCACACAGTGCA223SEQIDNo:18rs4646006FCTAAGTGGCAGCATTTTCAGCACTTAG301SEQIDNo:19rs4646006RAGCTGACGAGTCTCCAGATCTATGATCAGCTSEQIDNo:20rs34132048+TGTTAGGTGCCCAGTGAGCAGAACTAACA211SEQIDNo:21rs34132048—GACTGTGCCCAGTGAGCAGAACAGTC205SEQIDNo:22rs34132048FTTGGTCGGAGACAGTAGGTAGATGTTGACCAA267SEQIDNo:23rs34132048RCAGAGACGTGGTTGTCAAATGAAGGTCTCTGSEQIDNo:24rsl610932+AGAACCCTTTGCAACTCACCAGGTTCT180SEQIDNo:25rsl610932—GCATCTTTGCAACTCACCTGGATGC172SEQIDNo:26rs1610932FCTGTCTGTATCACAGCTGAATAAGCAGACAG271SEQIDNo:27rsl610932RCAACATCCAGGGAGAGCATGGTGTTGSEQIDNo:28rs56024302+GATAGATCCATTCACCCATCCATCTATC112SEQIDNo:29rs56024302_ACTTTGCCATTCACCCATCCATCAAAGT108SEQIDNo:30rs56024302FCAGCTAGTCCATTCCTGTACCAGAGTAGCTG203SEQIDNo:31rs56024302RCTCATTAGGAGTTTGGAGCTGCAATGAGSEQIDNo:32本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)細(xì)胞嵌合狀態(tài)或個(gè)體識(shí)別的基因檢測(cè)試劑盒，10tests/盒，保存于一2(TC，由以下試劑組成-1)基因組DNA提取試劑(20人次)，購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司，貨號(hào)AP-畫-BLGDNA-50;2)超純水(MilliporeMILLI-QPFPLUS純水機(jī)制備，電阻率〉18.2Mil)5ml;3)2xPCR反應(yīng)液2ml，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào)KT201;4)2xSYBRGreenPCR反應(yīng)液2ml，購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司，貨號(hào)4367659;5)檢測(cè)所使用的各種引物各50ul(各種引物如表1所示，其序列由美國(guó)IntegratedDNATechnologies公司合成，用1xTE稀釋為2pmolM濃度)，分別分裝在相應(yīng)編號(hào)的0.2ml離心管中；6)基因組DNA對(duì)照品1(50ng濃度，50ul);7)基因組DNA對(duì)照品2(50ng濃度，50ul);其中所述基因組DNA對(duì)照品1和對(duì)照品2的rs2308010、rs4150017、rs2307553、rs2308144、rs4646006、rs34132048、rsl610932和rs56024302位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行了基因測(cè)序。本發(fā)明提供的基因組DNA對(duì)照品1和對(duì)照品2的位點(diǎn)多態(tài)性信息見表2(其中"+"代表插入多態(tài)性，"一"代表缺失多態(tài)性)。表2.試劑盒對(duì)照品的8個(gè)INDELs位點(diǎn)的多態(tài)性信息INDELs位點(diǎn)對(duì)照品1對(duì)照品2rs2308010+/—+/+rs4150017—/一+/—rs2307553+/—+/—rs2308144+/++/_rs4646006+/+—/—rs34132048+/—+/—rsl610932—/一+/—rs56024302+/——/—本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明僅采用普通PCR儀和瓊脂糖電泳方法即可進(jìn)行INDELs位點(diǎn)的多態(tài)性定性分析，并根據(jù)各INDELs位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行個(gè)體識(shí)別或親緣關(guān)系分析。相對(duì)于目前廣泛釆用的STR方法，本發(fā)明不需要測(cè)序儀等昂貴的儀器，易于推廣和使用。2、進(jìn)行嵌合或微嵌合狀態(tài)分析時(shí)，相對(duì)于采用Y染色體特異性序列的檢測(cè)方法，本方法不具有性別限制性。任何性別的標(biāo)本均可進(jìn)行分析，使分析不再受標(biāo)本性別的限制，具有更好的通用性。3、進(jìn)行嵌合或微嵌合狀態(tài)分析時(shí)，相對(duì)于采用HLA位點(diǎn)特異性引物的方法，本方法通用性更好，而且可以進(jìn)行精確的定量分析。4、進(jìn)行嵌合或微嵌合狀態(tài)定量分析時(shí)，由于本方法結(jié)合了INDELs多態(tài)性的特點(diǎn)和巢式PCR技術(shù)。在增大初始模板量的同時(shí)又保證了定量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用Y染色體特異性序列檢測(cè)微嵌合時(shí)，由于初始DNA模板量的限制，檢測(cè)靈敏度只能達(dá)到約10—4。但采用本方法時(shí)，由于初始模板量的增加，檢測(cè)靈敏度可提高到10—5，進(jìn)一步提高了檢測(cè)靈敏度。下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖l為本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)示意圖，其中口為基因序列，國(guó)為插入多態(tài)性序列，F(xiàn)為上游引物，R為下游引物，+為插入型位點(diǎn)特異性引物，-為缺失型位點(diǎn)特異性引物；圖2為本試劑盒用于個(gè)體識(shí)別檢測(cè)電泳結(jié)果圖，"+"和"一"分別表示該反應(yīng)檢測(cè)的為插入型和缺失型多態(tài)性，電泳圖示標(biāo)本A和標(biāo)本B的8個(gè)INDELs位點(diǎn)中，有6個(gè)位點(diǎn)(rs4150017、rs2307553、rs2308144、rs4646006rs34132048、rs56024302)的多態(tài)性有差異；圖3為本發(fā)明用于檢測(cè)嵌合狀態(tài)的電泳結(jié)果圖，電泳圖示標(biāo)本處于嵌合狀態(tài)時(shí)的檢測(cè)結(jié)果和INDELs多態(tài)性位點(diǎn)的分類情況；圖4為檢測(cè)檢測(cè)母女微嵌合狀態(tài)時(shí)各位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)電泳結(jié)果圖，電泳圖示標(biāo)本E和標(biāo)本F中INDELs多態(tài)性位點(diǎn)的分類情況；圖5為本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增所得擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；R:內(nèi)參引物擴(kuò)增曲線；A:50%標(biāo)準(zhǔn)品特異性引物擴(kuò)增曲線；B:5%標(biāo)準(zhǔn)品特異性引物擴(kuò)增曲線；C:0.5%標(biāo)準(zhǔn)品特異性引物擴(kuò)增曲線；D:0.05%標(biāo)準(zhǔn)品特異性引物擴(kuò)增曲線；圖6為本發(fā)明的標(biāo)本檢測(cè)擴(kuò)增曲線和解離曲線圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:引物的設(shè)計(jì)與合成選擇在中國(guó)漢族人群中具有較強(qiáng)多態(tài)性的候選INDELS位點(diǎn)根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物信息中心(TheNationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)網(wǎng)站SNP數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www,ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrezdb-snp)中的INDELs多態(tài)性信息進(jìn)行選擇，初選在數(shù)據(jù)庫(kù)資料中這個(gè)人群多態(tài)性較強(qiáng)的INDELs位點(diǎn)。引物設(shè)計(jì)如圖l，圖示了本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)方法和原理根據(jù)選取的每個(gè)INDELs位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)并制備相應(yīng)的引物序列對(duì)于每一個(gè)INDELs位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)一條共用的上游引物(F)、一條共用的下游引物(R)、檢測(cè)插入多態(tài)性(Insersion，I)的位點(diǎn)特異性引物(+)和檢測(cè)缺失多態(tài)性(Deletsion，D)的位點(diǎn)特異性引物(一)。每條位點(diǎn)特異性引物的3'末端分別各有4-6個(gè)堿基特異性對(duì)應(yīng)各INDELs位點(diǎn)的或缺失多態(tài)性的基因序列，以達(dá)到較強(qiáng)的位點(diǎn)特異性效果。標(biāo)本選擇和實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取100個(gè)漢族健康成人(男50個(gè)，女50個(gè))基因組DNA標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增和基因測(cè)序分析。根據(jù)實(shí)際檢測(cè)的各位點(diǎn)的多態(tài)性情況最終確定采用的INDELs位點(diǎn)。用上述設(shè)計(jì)的引物對(duì)100份健康成人基因組DNA標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估引物擴(kuò)增效率和各位點(diǎn)的多態(tài)性情況。基因組DNA的提取愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司的產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行，提取得到的基因組DNA用lxTE溶液稀釋到5ng/ul備用。PCR反應(yīng)體系為20ul，每個(gè)反應(yīng)體系中含基因組DNA10ng，每個(gè)INDELs位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的編號(hào)為"F、R、+"或叩、R、一"的引物各4pmo1(分別用以檢測(cè)插入多態(tài)性和缺失多態(tài)性)，2xPCR反應(yīng)液10ul，用超純水補(bǔ)足反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為95'C預(yù)變性5分鐘，然后95'C變性15秒-58'C退火30秒-72。C延伸45秒共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳30分鐘檢測(cè)，根據(jù)出現(xiàn)的條帶大小判斷各位點(diǎn)的多態(tài)性情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選取了8個(gè)在漢族人群中具有較強(qiáng)多態(tài)性的INDELs位點(diǎn)，在SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)分別為rs2308010、rs4150017、rs2307553、rs2308144、rs4646006、rs34132048、rsl610932、rs56024302。所用引物序列見表l，在100例標(biāo)本中檢測(cè)到的811個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息見表3，其中"+/+"代表純合插入多態(tài)性；"+/—"代表插入/缺失雜合多態(tài)性；"一/一"代表純合缺失多態(tài)性。以上所用引物均由美國(guó)IntegratedDNATechnologies公司合成。表3.100例標(biāo)本中本試劑盒所選8個(gè)INDELs位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例2本發(fā)明所述試劑盒的組成本發(fā)明所述用于檢測(cè)細(xì)胞嵌合狀態(tài)或個(gè)體識(shí)別的基因檢測(cè)試劑盒，10tests/盒，保存于一2(TC，由以下試劑組成1)基因組DNA提取試劑(20人次)，購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司，貨號(hào)AP-MN-BLGDNA-50;2)超純水(MilliporeMILLI-QPFPLUS純水機(jī)制備，電阻率〉18.2MQ)5ml;3)2xPCR反應(yīng)液2ml，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào)KT201;4)2xSYBRGreenPCR反應(yīng)液2ml，購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司，貨號(hào)4367659;5)檢測(cè)所使用的各種引物各50ul(各種引物如表1所示，其序列由美國(guó)IntegratedDNATechnologies公司合成，用lxTE稀釋為2pmol/ul濃度)，分別分裝在相應(yīng)編號(hào)的0.2ml離心管中；6)基因組DNA對(duì)照品1(50ng濃度，50ul);7)基因組DNA對(duì)照品2(50ng濃度，50uO;基因組DNA對(duì)照品1和對(duì)照品2的制備采取兩名健康供者外周血標(biāo)本各10ml，用上述愛思進(jìn)公司基因組DNA提取試劑提取全血基因組DNA后，用1XTE緩沖液稀釋為50ng/ul并分裝后即為對(duì)照品。其中基因組DNA對(duì)照品1和對(duì)照品2做為質(zhì)控品提供，標(biāo)本來(lái)源于兩位健康供者。對(duì)照品1和對(duì)照品2聯(lián)合使用，提供了8個(gè)INDELs位點(diǎn)的各種插入型和缺失型的基因型的DNA標(biāo)本。基因組DNA對(duì)照品1和對(duì)照品2的位點(diǎn)多態(tài)性經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)，具體多態(tài)性信息見表2(其中"+"代表插入多態(tài)性，"一"代表缺失多態(tài)性)。實(shí)施例3:本試劑盒用于個(gè)體識(shí)別的檢測(cè)隨機(jī)選取兩個(gè)不同個(gè)體的基因組DNA標(biāo)本(分別命名為A和B)，分別進(jìn)行本試劑盒中8個(gè)INDELs位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為20ul，每個(gè)反應(yīng)體系中含基因組DNA10ng，每個(gè)INDELs位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的編號(hào)為"F、R、十"或"F、R、一"的引物各4pmo1(分別用以檢測(cè)插入多態(tài)性和缺失多態(tài)性)，2xPCR反應(yīng)液lOul,用超純水補(bǔ)足反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為95°〇預(yù)變性5分鐘，然后95'C變性15秒-58""C退火30秒-72'C延伸45秒共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳30分鐘檢測(cè)，根據(jù)出現(xiàn)的條帶大小判斷各位點(diǎn)的多態(tài)性情況。電泳結(jié)果見圖2，"+"和"一"分別表示該反應(yīng)檢測(cè)的為插入型和缺失型多態(tài)性。根據(jù)電泳結(jié)果可判斷，標(biāo)本A和標(biāo)本B的8個(gè)INDELs位點(diǎn)中，有6個(gè)位點(diǎn)(rs4150017、rs2307553、rs2308144、rs4646006rs34132048、rs56024302)的多態(tài)性有差異，因此可判斷標(biāo)本A和標(biāo)本B來(lái)源于不同的個(gè)體。實(shí)施例4:本試劑盒用于骨髓移植后嵌合狀態(tài)的檢測(cè)選取一例進(jìn)行骨髓移植的白血病患者的移植前外周血、供者外周血、供者外周血和移植后外周血標(biāo)本(分別標(biāo)記為C、D和CD)進(jìn)行檢測(cè)。移植后外周血標(biāo)本經(jīng)用經(jīng)典的STR方法檢測(cè)結(jié)果為患者來(lái)源細(xì)胞占13.12%，為供者和患者混合嵌合狀態(tài)。STR方法采用ABIIdentifilier試劑盒和ABI310測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)。與STR方法相同的是，采用本試劑盒進(jìn)行嵌合狀態(tài)檢測(cè)時(shí)，同樣需要對(duì)患者移植前標(biāo)本和供者標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以獲得供者和患者各自的INDELs位點(diǎn)多態(tài)性信息。但本試劑盒只需要瓊脂糖電泳檢測(cè)和普通凝膠成像儀即可對(duì)嵌合狀態(tài)進(jìn)行分析。具體實(shí)施方法為1、分別對(duì)C、D和CD標(biāo)本進(jìn)行8個(gè)INDELs位點(diǎn)的檢測(cè)PCR反應(yīng)體系為20ul，每個(gè)反應(yīng)體系中含基因組DNA10ng，每個(gè)INDELs位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的編號(hào)為"F、R、+"或'予、R、一"的引物各4pmol(分別用以檢測(cè)插入多態(tài)性和缺失多態(tài)性)，2xPCR反應(yīng)液10ul,用超純水補(bǔ)足反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性5分鐘，然后95'C變性15秒-58'C退火30秒-72。C延伸45秒共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳30分鐘檢測(cè)，根據(jù)出現(xiàn)的條帶大小判斷各位點(diǎn)的多態(tài)性情況。本例的電泳結(jié)果見圖3。2、多態(tài)性位點(diǎn)的分類根據(jù)各位點(diǎn)多態(tài)性的情況，可將8個(gè)INDELs位點(diǎn)分為4類1、供者和患者多態(tài)性完全相同的為0類位點(diǎn)(如本例中rs4150017和rs34132048位點(diǎn))，為非信息位點(diǎn)，此類位點(diǎn)不能用來(lái)進(jìn)行嵌合狀態(tài)分析；2、患者(C)為插入純合性、供者(D)為缺失純合性，或患者(C)為缺失純合性、供者(D)為插入純合性的位點(diǎn)(如本例中rs56024302位點(diǎn))為I類位點(diǎn)，此類位點(diǎn)可以進(jìn)行各種嵌合狀態(tài)的分析。3、患者(C)為插入/缺失雜合性、供者(D)為插入或缺失純合性的位點(diǎn)為IIa類位點(diǎn)(如本例中的rs2308010、rs2308144、rs4646006位點(diǎn))，此類位點(diǎn)適合進(jìn)行患者細(xì)胞量相對(duì)較少的嵌合狀態(tài)分析，在進(jìn)行供者細(xì)胞相對(duì)較少的嵌合狀態(tài)分析時(shí)會(huì)有較大的誤差。3、供者(D)為插入/缺失雜合性、患者(C)為插入或缺失純合性的位點(diǎn)為IIb類位點(diǎn)(如本例中的rs2307553、rsl610932位點(diǎn))，此類位點(diǎn)適合進(jìn)行供者細(xì)胞量相對(duì)較少的嵌合狀態(tài)分析，在進(jìn)行患者細(xì)胞相對(duì)較少的嵌合狀態(tài)分析時(shí)會(huì)有較大的誤差。3、嵌合比例的計(jì)算嵌合率的計(jì)算首先要用凝膠成像儀對(duì)嵌合標(biāo)本(本例中為標(biāo)本CD)中I類和II類位點(diǎn)的插入和缺失型PCR電泳片段進(jìn)行灰度分析。本例中所用的凝膠成像儀為TanonGIS-2010凝膠成像儀，所用灰度分析軟件為天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)V4.0。a)O類位點(diǎn)不參與嵌合狀態(tài)的分析，不進(jìn)行計(jì)算。b)I類位點(diǎn)的嵌合率計(jì)算公式為患者標(biāo)本嵌合率=患者特異性條帶灰度值/(插入/缺失條帶的總灰度值)供者標(biāo)本嵌合率-供者特異性條帶灰度值/(插入/缺失條帶的總灰度值)c)IIa類位點(diǎn)主要用于患者成份嵌合率計(jì)算，計(jì)算公式為患者標(biāo)本嵌合率=患者特異性條帶灰度值/(插入/缺失條帶的總灰度值)d)IIb類位點(diǎn)主要用于供者成份嵌合率計(jì)算，計(jì)算公式為供者標(biāo)本嵌合率-供者特異性條帶灰度值/(插入/缺失條帶的總灰度值)本例標(biāo)本中rs56024302位點(diǎn)為I類位點(diǎn)，嵌合率計(jì)算結(jié)果為患者細(xì)胞所占比例為11.80%;rs2308010、rs2308144、rs4646006為IIa類位點(diǎn)，計(jì)算患者細(xì)胞所占比例為13.51%、12.12%和10.17%。患者細(xì)胞嵌合比例平均值為12.05%,與用STR方法檢測(cè)14的結(jié)果相近。實(shí)施例5:本試劑盒用于微嵌合狀態(tài)的檢測(cè)本試劑盒用于微嵌合狀態(tài)的檢測(cè)(如母子微嵌合)時(shí)，同樣需要先對(duì)來(lái)自不同個(gè)體的兩份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以獲得供者和患者各自的INDELs位點(diǎn)多態(tài)性信息，再選出可用的信息位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的微嵌合檢測(cè)。由于微嵌合狀態(tài)時(shí)，微嵌合的細(xì)胞比例一般很低(<1%)，由于擴(kuò)增產(chǎn)物量很低和檢測(cè)方法的限制，瓊脂糖電泳檢測(cè)時(shí)往往檢測(cè)不到微嵌合的擴(kuò)增產(chǎn)物，因此需要結(jié)合熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。為達(dá)到10—5的檢測(cè)靈敏度，需要至少500ng的初始基因組DNA模板進(jìn)行檢測(cè)。但當(dāng)模板總量過(guò)多時(shí)，會(huì)影響PCR的擴(kuò)增效率和低拷貝模板的檢測(cè)，因此對(duì)嵌合或微嵌合狀態(tài)進(jìn)行定量分析時(shí)需要進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，即巢式PCR的第一輪擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增時(shí)分別采用各INDELs位點(diǎn)的上游引物(F)、下游引物(R)組合進(jìn)行擴(kuò)增。在進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)，還要構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，以進(jìn)行精確的定量分析。我們釆用本試劑盒對(duì)41對(duì)母子/女進(jìn)行母親為供者的骨髓移植的母親標(biāo)本進(jìn)行了微嵌合狀態(tài)的檢測(cè)。結(jié)果在其中10例(24%)母親外周血中檢測(cè)到子/女細(xì)胞的微嵌合，微嵌合細(xì)胞的比例在10—510—3之間。在此舉其中一例進(jìn)行應(yīng)用方法的說(shuō)明(母親標(biāo)本命名為E，女兒標(biāo)本命名為F)。具體實(shí)施方法為1、標(biāo)本E和標(biāo)本F中各INDELs位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)和多態(tài)性位點(diǎn)的分類方法同實(shí)施例3。兩份標(biāo)本的位點(diǎn)多態(tài)性電泳圖見圖4，由于兩者為母女血緣關(guān)系，因此不存在I類位點(diǎn)。根據(jù)II類位點(diǎn)中的rs2308010、rs4150017、rs2308144和rs4646006位點(diǎn)可以進(jìn)行女兒(F)體內(nèi)母親(E)細(xì)胞的微嵌合狀態(tài)分析。2、巢式PCR的第一輪擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20ul，每個(gè)反應(yīng)體系中含基因組DNA660ng(約相當(dāng)于105個(gè)細(xì)胞的基因組DNA)，每個(gè)INDELs位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的編號(hào)為"F、R"的引物各4pmo1，2xPCR反應(yīng)液10ul，用超純水補(bǔ)足反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為95t:預(yù)變性5分鐘，然后95。C變性15秒-58。C退火30秒-72。C延伸45秒共進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸7分鐘。3、標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建選取已知具有相關(guān)多態(tài)性的其它人的基因組DNA標(biāo)本，將不同的純合插入、純合缺失或雜合性的多態(tài)性標(biāo)本以不同比例混合(如缺失多態(tài)性插入多態(tài)性比例分別為50%、5%、0.5%、0.05%)，得到不同比例的標(biāo)準(zhǔn)品。4、巢式第二輪PCR反應(yīng)，即微嵌合狀態(tài)的定量分析將制備的嵌合比例分別為1550%、5%、0.5%、0.05。/。的標(biāo)準(zhǔn)品或巢式第一輪PCR擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物稀釋500倍作為定量分析的模板，同時(shí)以超純水為模板做空白對(duì)照。對(duì)于各個(gè)可進(jìn)行定量分析的INDELs位點(diǎn)(本例中為rs2308010、rs4150017、rs2308144和rs4646006位點(diǎn))，根據(jù)相應(yīng)情況分別采用檢測(cè)插入多態(tài)性的位點(diǎn)特異性引物(+)或檢測(cè)缺失多態(tài)性的位點(diǎn)特異性引物(-)與下游引物(R)組合進(jìn)行PCR第二輪的巢式PCR擴(kuò)增，同時(shí)采用上游引物(F)和下游引物(R)組合進(jìn)行內(nèi)參基因的擴(kuò)增。此步驟的PCR擴(kuò)增在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，并且采用SYBRGreen染料法進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)。本例熒光定量PCR檢測(cè)在AB7300型熒光定量PCR儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系為20ul，其中包括稀釋后的第一輪PCR產(chǎn)物2ul、SYBRGreenPCR反應(yīng)液10ul、每條引物各4pmo1。反應(yīng)條件為50°C2分鐘使UNG酶起作用、95°C10分鐘預(yù)變性并激活熱啟動(dòng)酶，然后95'C變性15秒、60°C1分鐘共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，PCR循環(huán)后做解離曲線分析以判斷PCR產(chǎn)物的特異性。5、標(biāo)準(zhǔn)曲線分析根據(jù)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)所得的目的基因和內(nèi)參基因的CT值的差值(目的基因CT-內(nèi)參基因CT值，即ACT值)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5所示為本例中rs2308010位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，圖中顯示標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線形態(tài)良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線R、0.9915，線性相關(guān)性良好。6、微嵌合狀態(tài)的定量分析根據(jù)每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)插入或缺失型位點(diǎn)特異性引物和內(nèi)參引物擴(kuò)增所得的解離曲線分析產(chǎn)物的特異性，并計(jì)算兩者所得CT值的差值(ACT)。根據(jù)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)所得的ACT值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線和待檢標(biāo)本的ACT值可計(jì)算標(biāo)本中嵌合或微嵌合狀態(tài)的比例。圖6所示為本例中rs2308010位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果，圖中顯示所測(cè)標(biāo)本中內(nèi)參基因和特異性位點(diǎn)(插入多態(tài)性位點(diǎn))基因控制曲線形態(tài)良好，解離曲線顯示PCR產(chǎn)物特異，空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增。由于本例中女兒rs2308010位點(diǎn)的基因型為缺失純合性，而母親此位點(diǎn)的基因型為插入/缺失雜合型，因此在女兒基因組DNA中檢測(cè)到的插入型基因片段來(lái)源于微嵌合的母源性細(xì)胞。本例中rs2308010位點(diǎn)的插入型基因微嵌合率根據(jù)標(biāo)本中檢測(cè)到的ACT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算為0.036%,由于母親體內(nèi)此位點(diǎn)的基因型為插入/缺失雜合型，因此母體細(xì)胞的微嵌合率應(yīng)為0.036%x2=0.072%。本例中對(duì)另三個(gè)位點(diǎn)(rs4150017、rs2308144和rs4646006)同樣進(jìn)行了定量分析，檢測(cè)結(jié)果分別為0.056%、0.078%、0.067%,四個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)細(xì)胞微嵌合的平均值為0.068%。因此在女兒標(biāo)本中存在母體來(lái)源的細(xì)胞的微嵌合狀態(tài)，母源性細(xì)胞嵌合比例約為0.068%。序列表<110>北京市道培醫(yī)院<120>—種用于檢測(cè)細(xì)胞嵌合狀態(tài)或個(gè)體識(shí)別的基因檢測(cè)試劑盒<130><160>32<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>30<212>DNA<213>人工合成引物rs2308010+<400>1ctgactagcaacaagcgtggaattagtcag30<210>2<211>29<212>DNA<213>人工合成引物rs2308010—<400>2agtcctgcaacaagcgtggaattaggact29<210>3<211>31<212>DNA<213>人工合成引物rs2308010F<400>3gaacttatgcaatattactgccatcaagttc31<210>4<211>30<212>DNA<213>人工合成引物rs2308010R<400>4ctcgtttgtgtgatcatcaaactcaacgag30<210>5<211>28<212>DNA<213>人工合成引物rs4150017+<400>5agacaggtacggtgtgatgccactgtct28<210>6<211>28<212>DNA<213>人工合成引物rs4150017—<400>6atcaaggtacggtgtgatgccacttgat28<210>7<211>29<212>DNA<213〉人工合成引物rs4150017F<400>7acaaggagtgcaacagaacgagaccttgt29<210>8<211>28<212>DNA<213>人工合成引物rs4150017R<400>8gtcttgtcctttcaacggtttccaagac28<210>9<211>28<212>DNA<213>人工合成引物rs2307553+<400>9gtcagtgcaaagtgggcatttgactgac28<210>1019<212>DNA<213>人工合成引物rs2307553<400〉10ctctgtgcaaagtgggcatttgacagag<210>11<211>33<212〉DNA<213>人工合成引物rs2307553<400>11gaaagtgacatgtg爐agacctgccactttc<210>12<211>26<212>DNA<213>人工合成引物rs2307553<400>12gctcacatgagtgcacagccatgagc<210>13<211>25<212>DNA<213>人工合成引物rs2308144<400>13cttcattgtcctcgcctccatgaag25<210>14<211>26<212>DNA<213>人工合成引物rs2308144—<400>14cttcagcaccttgtcctcgcctgaag26<210>15<211>30<212>DNA<213>人工合成引物rs2308144F<400>15ctgcttgatgtctgtcagccttctaagcag30<210>16<211>27<212>DNA<213>人工合成引物rs2308144R<400>16ctgattgcgtcaccatttgtgaatcag2721<210〉17<211>27<212>DNA<213>人工合成引物rs4646006+<400>17tgagtgctggtaaatggcacacactca27<210>18<211>27<212〉DNA<213>人工合成引物rs4646006—<400>18tgcacctggtaaatggcacacagtgca27<210>19<211>27<212>DNA<213>人工合成引物rs4646006F<400>19ctaagtggcagcattttcagcacttag27<210>20<211>31<212>DNA<213>人工合成引物rs4646006R<400>20agctgacgagtctccagatctatgatcagct31<210>21<211>29<212>DNA<213>人工合成引物rs34132048+<400>21tgttaggtgcccagtgagcagaactaaca29<210>22<211>26<212>DNA<213>人工合成引物rs34132048—<400>22gactgtgcccagtgagcagaacagtc26<210>23<211>32<212>DNA<213>人工合成引物rs34132048F<400〉23ttggtcggagacagtaggtagatgttgaccaa32<210>24<211>31<212〉DNA<213>人工合成引物rs34132048R<400〉24cagagacgtggttgtcaaatgaaggtctctg31<210>25<211>27<212>DNA<213>人工合成引物rsl610932+<400>25agaaccctttgcaactcaccaggttct27<210>26<211>25<212>DNA<213>人工合成引物rsl610932—<400>26gcatctttgcaactcacctggatgc25<210>27<211>31<212>DNA<213>人工合成引物rsl610932F<400>27ctgtctgtatcacagctgaataagcagacag31<210>28<211>26<212>DNA<213>人工合成引物rsl610932R<400>28caacatccagggagagcatggtgttg26<210>29<211>28<212>DNA<213>人工合成引物rs56024302+<400>29gatagatccattcacccatccatctatc28<210〉30<213>人工合成引物rs56024302—<400>30actttgccattcacccatccatcaaagt<210>31<211>31<212>DNA<213>人工合成引物rs56024302F<400>31cagctagtccattcctgtaccagagtagctg<210>32<211>28<212>DNA<213>人工合成引物rs56024302R<400>32ctcattaggagtttggagctgcaatgag權(quán)利要求1.一組用于檢測(cè)細(xì)胞嵌合狀態(tài)或個(gè)體識(shí)別的寡核苷酸，其特征在于為序列表SEQIDNo.1至序列表SEQIDNo.32所示堿基序列的寡核苷酸；其中，SEQIDNo.1為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs2308010多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.2為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs2308010多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.3為rs2308010多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.4為rs2308010多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.5為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs4150017多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.6為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs4150017多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.7為rs4150017多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.8為rs4150017多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.9為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs2307553多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.10為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs2307553多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.11為rs2307553多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.12為rs2307553多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.13為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs2308144多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.14為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs2308144多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.15為rs2308144多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.16為rs2308144多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.17為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs4646006多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.18為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs4646006多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.19為rs4646006多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.20為rs4646006多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.21為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs34132048多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.22為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs34132048多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.23為rs34132048多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.24為rs34132048多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.25為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs1610932多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.26為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs1610932多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.27為rs1610932多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.28為rs1610932多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物；SEQIDNo.29為檢測(cè)插入多態(tài)性的rs56024302多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.30為檢測(cè)缺失多態(tài)性的rs56024302多態(tài)性位點(diǎn)特異性引物，SEQIDNo.31為rs56024302多態(tài)性位點(diǎn)的上游引物、SEQIDNo.32為rs56024302多態(tài)性位點(diǎn)的下游引物。2.—種用于檢測(cè)細(xì)胞嵌合狀態(tài)或個(gè)體識(shí)別的基因檢測(cè)試劑盒，10tests/盒，由以下試劑組成1)基因組DNA提取試劑；2)超純水；3)2xPCR反應(yīng)液；4)2xSYBRGreenPCR反應(yīng)液；5)檢測(cè)所使用的引物，即序列表SEQIDNo.l至序列表SEQIDNo.32所示堿基序列的寡核苷酸，分別分裝在離心管中，每種引物的濃度為2pmol/ul;6)基因組DNA對(duì)照品1;7)基因組DNA對(duì)照品2;其中所述基因組DNA對(duì)照品1和對(duì)照品2的rs2308010、rs4150017、rs2307553、rs2308144、rs4646006、rs34132048、rsl610932和rs56024302位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行了基因測(cè)序。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)細(xì)胞嵌合狀態(tài)或個(gè)體識(shí)別的基因檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種用于檢測(cè)細(xì)胞嵌合狀態(tài)或個(gè)體識(shí)別的寡核苷酸序列、試劑盒及方法。該試劑盒利用基因插入/缺失多態(tài)性(INDELs)和位點(diǎn)特異性熒光定量PCR來(lái)定量檢測(cè)人類不同個(gè)體存在異體細(xì)胞的嵌合狀態(tài)或微嵌合狀態(tài)，可用于母子/女細(xì)胞微嵌合，造血干細(xì)胞或者其他器官移植后供者/受者細(xì)胞嵌合狀態(tài)，白血病造血干細(xì)胞移植后殘留病的檢測(cè)，法醫(yī)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定等。本發(fā)明的所述的試劑盒特異性好，檢測(cè)靈敏度高，可精確定量檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，不需要特殊的設(shè)備，采用本發(fā)明所述方法進(jìn)行個(gè)體識(shí)別檢測(cè)時(shí)，只需要瓊脂糖電泳即可分辨結(jié)果。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101671736SQ20091017818公開日2010年3月17日申請(qǐng)日期2009年10月15日優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日發(fā)明者劉紅星,平朱,倩王,童春容,鵬蔡申請(qǐng)人:北京市道培醫(yī)院