專利名稱：防除連作黃瓜立枯病的拮抗菌及其微生物有機(jī)肥料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防除連作黃瓜立枯病的拮抗菌及其微生物有機(jī)肥料，屬于農(nóng)業(yè) 集約化生產(chǎn)技術(shù)，專用于克服和消除連作黃瓜的立枯病問題。
二背景技術(shù)：
黃瓜苗期立枯病是危害連作黃瓜作物的主要土傳病害之一，是影響育苗質(zhì)量和 成活率的關(guān)鍵因素，該病在全國(guó)各地都有發(fā)生。連作黃瓜立枯病是由病原真菌(立 枯絲核菌AG-4)引起的，隨著連作年限的增加，病原菌逐漸積累，危害逐年加重， 常造成大量死苗甚至毀床。我們的研究結(jié)果表明，連作黃瓜立枯病的關(guān)鍵問題不是 養(yǎng)分缺乏或不平衡，也不是土壤次生鹽漬化問題，而是土壤中的微生物區(qū)系變化及 其次生代謝物質(zhì)的致毒問題。
另一方面，水稻、小麥、玉米、油菜等作物秸稈就地焚燒、規(guī)?；B(yǎng)殖后的畜 禽糞便隨地棄置等不僅嚴(yán)重污染了環(huán)境，也極大地浪費(fèi)了能作為有機(jī)肥和生物有機(jī) 肥產(chǎn)品的原料；大量的養(yǎng)分資源(C、 N、 P、 K、 S及微量元素)流失于土壤-植物 系統(tǒng)之外，明顯地削弱了我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的能力。如何將從土壤中因作物收獲 取走的營(yíng)養(yǎng)元素最大限度地歸還到土壤中去，唯一的途徑就是將這些固體有機(jī)廢棄 物制成商品有機(jī)肥料再施入土壤。如果將這些固體有機(jī)廢棄物經(jīng)過高溫發(fā)酵制成高 品位的有機(jī)堆肥，再用作功能菌的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)載體，所制成的微生物有機(jī)肥料功能明 確，將會(huì)有很好的應(yīng)用前景。
三
發(fā)明內(nèi)容
1. 技術(shù)問題
本發(fā)明的目的在于提供一種能防除連作黃瓜立枯病的拮抗菌及其微生物有機(jī) 肥料，使連作黃瓜立枯病的防治效率達(dá)到70%以上，使大量的設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤和露地 黃瓜連作障礙土壤得到較大程度的生物修復(fù)，確保集約化農(nóng)業(yè)的順利發(fā)展。
2, 技術(shù)方案
一種防除連作黃瓜立枯病的拮抗菌NJN43，屬于枯草芽孢桿菌(泡cW勿s s^"7is), 2009年7月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 3181，主要生物學(xué)特性為革蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞形 狀為桿狀，芽孢中生，兼性厭氧生長(zhǎng)，接觸酶陽性、V.R反應(yīng)陽性，甲基紅試驗(yàn)陽 性，發(fā)酵葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、 露醇產(chǎn)酸，能利用擰檬酸鹽，硝酸還原酶 陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性。用上述拮抗菌生產(chǎn)的防除連作黃瓜立枯病的微生物有機(jī)肥料，該肥料中含有1 Xl()S個(gè)/g以上的拮抗菌NJN43、全氮質(zhì)量比含量為4 5%，全氮中質(zhì)量比90%以 上為有機(jī)氮，總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量為30 35%。
所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，包括
1) 將拮抗菌NJN43接種到PDA培養(yǎng)液，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的 條件為pH生長(zhǎng)范圍自然，培養(yǎng)溫度范圍30'C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘， 發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵液中的拮抗菌含菌或芽孢量》lX10W個(gè)/ml;所用PDA 培養(yǎng)液配制方法為(以配制1L培養(yǎng)基為例)用200 g土豆削皮后切成小塊放到水 里煮，沸騰后煮30min，接著用四層醫(yī)用紗布過濾，濾液加20g普通蔗糖，定容至 1000 ml， pH值調(diào)至7.2-7.4， 12rC滅菌20min。
2) 將拮抗菌NJN43發(fā)酵液分別與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合 物進(jìn)行固體發(fā)酵，每噸固體有機(jī)物料中加入拮抗菌液40L混合，固體發(fā)酵過程中每 天翻堆1次，使固體發(fā)酵溫度不超過50'C，發(fā)酵5天后結(jié)束，使拮抗菌NJN43含量 達(dá)到1X 1()S個(gè)/g以上，獲得豬糞堆肥微生物有機(jī)肥和菜粕酶解混合物微生物有機(jī)肥； 所用腐熟的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量>35%，有機(jī)氮質(zhì)量 比含量為1.2-2%，含水量25-30%。
3) 然后將固體發(fā)酵的豬糞堆肥微生物有機(jī)肥和菜粕酶解混合物微生物有機(jī)肥 按體積比60: 40的比例充分混合后熟2天，后熟過程中翻堆2次，將后熟物低溫干 燥至30%的含水量，包裝出廠即為能連作黃瓜立枯病的微生物有機(jī)肥。
所述微生物有機(jī)肥料可專用于連作黃瓜立枯病。
3.有益效果
本發(fā)明涉及一種能克服或消除連作黃瓜立枯病的微生物有機(jī)肥料及其生產(chǎn)方 法，其產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上的產(chǎn)品相比具有如下優(yōu)點(diǎn)
1) 肥料產(chǎn)品中含有抑制黃瓜立枯病原真菌生長(zhǎng)的專一性高效菌株(枯草芽孢 桿菌NJN43)，其抑制效果非常顯著，肥料中該高效菌株的含量達(dá)到lXl()S個(gè)/g以 上，施入土壤后能形成優(yōu)勢(shì)群，并在土壤中存活下來。
2) 肥料產(chǎn)品中含有豐富的可溶性有機(jī)碳和有機(jī)氮，能給功能菌提供十分優(yōu)越 的生長(zhǎng)環(huán)境，極大地提高了功能菌在土壤中的定殖和發(fā)揮功能的能力。
3) 本發(fā)明產(chǎn)品的有機(jī)磷和有機(jī)氮含量特別高，均達(dá)到4%。本產(chǎn)品原料之一為 豬糞，總磷含量很高，而且生物有效性特別高，在該微生物有機(jī)肥料產(chǎn)品中無需添 加任何含磷化肥，使用本產(chǎn)品后能使作物順利度過苗期磷素敏感期。相比之下，含 磷化肥施入土壤后生物有效性較差；而本產(chǎn)品中有機(jī)氮能達(dá)到4%以上(大部分為氨基酸和小分子多肽)，確保了肥料氮素持續(xù)穩(wěn)定的供應(yīng)，使所種作物的生長(zhǎng)和抗 逆能力大大增強(qiáng)。
4)研究結(jié)果表明，在連作黃瓜的土壤上施用本產(chǎn)品后，能顯著降低黃瓜立枯 病的發(fā)病率，生物防治率達(dá)70%以上，并且植株長(zhǎng)勢(shì)良好(圖2)。連續(xù)施用本肥料 的土壤，對(duì)連作黃瓜的立枯病的生物防治率更高。
四

圖1拮抗菌NJN43的平板拮抗效果
圖2盆栽效果注1. CK1(健康土壤)2. CK2(有連作立枯病土壤)3. CK2+常規(guī)有機(jī)肥4. CK2+ 拮抗菌NJN43菌液5. CK2+拮抗菌NJN43經(jīng)二次發(fā)酵的有機(jī)肥(本發(fā)明肥料產(chǎn)品)
五具體實(shí)施例方式
(一) 菌株的分離和鑒定
拮抗菌株的獲得病原菌株立枯絲核菌(及/^OCto"&M/fl"/)由北京農(nóng)科院蔬菜
花卉研究所購買，并確認(rèn)其致病性。分別在NA改良培養(yǎng)基、PDA改良培養(yǎng)基和 LB改良培養(yǎng)基上利用對(duì)峙法進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，從連作黃瓜立枯病發(fā)病田塊中的健康 黃瓜植株根際土壤初篩拮抗菌株，然后通過盆栽試驗(yàn)復(fù)篩髙效拮抗菌株，最終獲得 拮抗菌NJN43并進(jìn)行鑒定，菌種凍干一20'C保存。平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)拮抗菌對(duì) 病原菌的抑菌圈直徑高達(dá)2.4cm (圖1)。
拮抗菌NJN43屬于枯草芽孢桿菌(^ciWtA sM07i's)，主要生物學(xué)特性為革 蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞形狀為桿狀，芽孢中生，兼性厭氧生長(zhǎng)，接觸酶陽性、V.P. 反應(yīng)陽性，甲基紅試驗(yàn)陽性，發(fā)酵葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇產(chǎn)酸，能利 用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性。
(二) 菌劑生產(chǎn)
1) 拮抗菌NJN43接種到PDA培養(yǎng)液，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件 為pH生長(zhǎng)范圍自然，培養(yǎng)溫度范圍30'C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵 中后期形成芽孢，發(fā)酵液中的拮抗菌含菌或芽孢量》lXl(^個(gè)/ml;所用PDA培養(yǎng) 液配制方法為(以配制1L培養(yǎng)基為例)用200 g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮， 沸騰后煮30 min，接著用四層醫(yī)用紗布過濾，濾液加20 g普通蔗糖，定容至1000 ml， pH值調(diào)至7.2-7.4， 121'C滅菌20min。
2) 將拮抗菌NJN43發(fā)酵液分別與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物 進(jìn)行固體發(fā)酵，每噸固體有機(jī)物料中加入拮抗菌液40L混合，固體發(fā)酵中每天翻堆 1次，使固體發(fā)酵溫度不超過5(TC，發(fā)酵5天后結(jié)束，使拮抗菌含量達(dá)到1X108 個(gè)/g以上，獲得固體發(fā)酵的豬糞堆肥微生物有機(jī)肥和菜粕酶解混合物微生物有機(jī)肥；
5所用腐熟的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量>35%，有機(jī)氮質(zhì)量 比含量為1. 2-2%，含水量25-30%。
其中菜粕的微生物分解混合物制備方法為(公知公用，見發(fā)明專利 ZL200610086126.0, —種農(nóng)用氨基酸的生物制取方法及其肥料產(chǎn)品)，菌株37-1發(fā) 酵液加入到菜粕原料中，調(diào)節(jié)含水量55-65%和pH6.0-7.5，進(jìn)行開放式固體發(fā)酵， 待發(fā)酵溫度上升至50'C時(shí)立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50 'C共5天，固體發(fā)酵開始后，堆物的pH會(huì)不斷上升，每次翻堆時(shí)用含酸液體調(diào)節(jié) 含水量和pH,使它們分別維持在55-65%和6.0-7.0,發(fā)酵終止時(shí)再用含酸液體進(jìn)行 噴灑，直至堆物pH調(diào)整為5.0左右，再進(jìn)行低溫干燥或自然涼干，即為菜粕的微 生物分解混合物(含氨基酸的混合材料)。
3)然后將豬糞堆肥微生物有機(jī)肥和菜粕酶解混合物微生物有機(jī)肥按體積比60: 40的比例充分混合后熟2天，后熟過程中翻堆2次，將后熟物低溫干燥至30%的含 水量，包裝出廠即為能連作黃瓜立枯病的微生物有機(jī)肥產(chǎn)品。
上述防除連作黃瓜立枯病微生物有機(jī)肥料，該肥料產(chǎn)品中含有1Xl()S個(gè)/g以上 的拮抗菌NJN43、全氮質(zhì)量比含量為4 5%，全氮中質(zhì)量比卯％以上為有機(jī)氮，總 氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量為30 35%。
(三)盆栽實(shí)驗(yàn)
盆栽實(shí)驗(yàn)中，拮抗菌NJN43菌液處理以1()ScfU/g土均勻拌入連作黃瓜立枯病嚴(yán) 重的土壤中，本發(fā)明肥料產(chǎn)品以2%的施用量(w /w)均勻拌入病土中。兩天后， 栽入已催好芽的黃瓜種子，每個(gè)處理3組重復(fù)，每組重復(fù)7棵黃瓜苗。培養(yǎng)時(shí)保持 各處理土壤中濕度、溫度一致，18天后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重 復(fù)2次。
結(jié)果表明連作土壤中黃瓜苗的發(fā)病率為77.78%，并且存活植株長(zhǎng)勢(shì)矮小，生長(zhǎng) 緩慢；連作土壤中接種拮抗菌NJN43菌液處理的發(fā)病率為50Q/Q (防治率35.71%)， 連作土中施用本發(fā)明肥料產(chǎn)品處理的發(fā)病率為22.21% (表l)(防治率71.43%)，并 且植株長(zhǎng)勢(shì)良好(圖2)，說明本產(chǎn)品能有效的抑制連作立枯病土壤中病害的發(fā)生； 本產(chǎn)品還能有效的降低連作立枯病土壤中病原菌立枯絲核菌的數(shù)量(表1中第3 行)，改善黃瓜苗根際微生物區(qū)系，從而減少立枯病的發(fā)生以及立枯絲核菌對(duì)黃瓜 苗產(chǎn)生的抑制作用。
連作土壤中對(duì)照處理的黃瓜苗地上部鮮重僅為0.92±0. 116g/株，而在連作土 壤中施入本產(chǎn)品后黃瓜苗地上部鮮重為2.06±0. 192 g/株(表2)(地上部生物量 增加124%);連作土壤中對(duì)照處理的黃瓜苗的蒸騰速率為3.72±0.810 mmolH20 .m-2 .s",而施入本產(chǎn)品后黃瓜苗的蒸騰速率為9.34±0. 496rnrno1 H20 'm'2 .s" (表2)(蒸騰速率提高151%);此外，連作土壤中施用本產(chǎn)品與未使用相比，黃瓜 苗的總根長(zhǎng)增加128%,根系活力增加85.2% (表2)，這些結(jié)果表明，本產(chǎn)品除了 能有效降低連作立枯病土壤中立枯病的發(fā)生，還能降低或消除病原菌對(duì)黃瓜苗生長(zhǎng) 產(chǎn)生的抑制作用，顯著的促進(jìn)黃瓜苗的生長(zhǎng)。
表1盆栽試驗(yàn)發(fā)病率及土壤中病原菌數(shù)量
CK1(無連作立枯 病的健康土壤)CK2(有連作立枯 病的發(fā)病土壤)CK2+ NJN43液 體菌劑CK2+本發(fā)明肥 料產(chǎn)品
發(fā)病率(％)077.8%50.0%22.21%
土壤中病原菌數(shù)量3.33 X1027.33 XI032.00 X1031.33 X103
表2盆栽試驗(yàn)植株長(zhǎng)勢(shì)
CK1(無連作立枯 病的健康土壤)CK2(有連作立枯 病的發(fā)病土壤)CK2+ N屈3液 體菌劑CK2+本發(fā)明肥 料產(chǎn)品)
黃瓜苗地上部鮮 重(g/株)1. 38±0. 0750. 92±0. 1161.61±0. 0302. 06±0.192
蒸騰速率(mmol5.62±0.6183.72±0. 8104.73 ±0. 3809.34 ±0. 496
總根長(zhǎng)(cm)188.2±14. 71122.7±18. 24193.7±43. 11279.5 ±58. 02
根系活力腿±61. 10646.2±43. 38992.9 ±56. 701197±69. 60
本發(fā)明專利從連作土壤的微生物區(qū)系這一關(guān)鍵問題著手，研制出一種能顯著降
低連作黃瓜的立枯病發(fā)病率的微生物有機(jī)肥料產(chǎn)品，防治率達(dá)70%以上。本肥料產(chǎn) 品的作用機(jī)制在于本肥料產(chǎn)品提供的功能菌及其有效碳和有效氮源給連作障礙土 壤有益微生物區(qū)系的培育提供了很好的條件，使之迅速恢復(fù)土著有益微生物和外源 功能菌微生物的生態(tài)及其食物鏈；另一方面，本肥料產(chǎn)品中含有較高含量的有機(jī)氮 和有機(jī)磷，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)連作障礙土壤中作物的生長(zhǎng)十分有利，大大提高了作物 的立苗率和抗逆能力。
權(quán)利要求
1、一種防除連作黃瓜立枯病的拮抗菌，該菌株NJN43屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，2009年7月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.3181，主要生物學(xué)特性為革蘭氏染色陽性G+，細(xì)胞形狀為桿狀，芽孢中生，兼性厭氧生長(zhǎng)，接觸酶陽性、V.P.反應(yīng)陽性，甲基紅試驗(yàn)陽性，發(fā)酵葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇產(chǎn)酸，能利用檸檬酸鹽，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性，分解酪蛋白陽性。
2、 用權(quán)利要求1所述拮抗菌生產(chǎn)的防除連作黃瓜立枯病的微生物有機(jī)肥料。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物有機(jī)肥料，其特征在于該肥料中含有1X108 個(gè)/g以上的拮抗菌NJN43、全氮質(zhì)量比含量為4 5%，全氮中質(zhì)量比90%以上為有 機(jī)氮，總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6~10%、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量為30 35%。
4、 權(quán)利要求2或3所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，包括1) 將權(quán)利要求1所述的拮抗菌NJN43接種到PDA培養(yǎng)液，進(jìn)行液體發(fā)酵生 產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為pH生長(zhǎng)范圍自然，培養(yǎng)溫度范圍30°C ，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵中后期形成芽孢，發(fā)酵液中的拮抗菌含菌或芽孢量^1X1(^個(gè) /ml;2) 將拮抗菌NJN43發(fā)酵液分別與腐熟后的豬糞堆肥和菜粕微生物酶解混合物 進(jìn)行固體發(fā)酵，每噸固體有機(jī)物料中加入NJN43發(fā)酵液40L混合，固體發(fā)酵過程中 每天翻堆1次，使固體發(fā)酵溫度不超過5(TC，發(fā)酵5天后結(jié)束，使拮抗菌NJN43含 量達(dá)到1Xl()S個(gè)/g以上，獲得豬糞堆肥微生物有機(jī)肥和菜粕酶解混合物微生物有機(jī) 肥；3) 然后將固體發(fā)酵的豬糞堆肥微生物有機(jī)肥和菜粕酶解混合物微生物有機(jī)肥按 體積比60: 40的比例充分混合后熟2天，后熟過程中翻堆2次，將后熟物低溫干燥 至30%的含水量，包裝出廠即為能防除連作黃瓜立枯病的微生物有機(jī)肥。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，其中步驟1)所用PDA 培養(yǎng)液配制方法為，以配制1L培養(yǎng)基為例用200g土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，接著用四層醫(yī)用 紗布過濾，濾液加20g普通蔗糖，定容至1000ml， pH值調(diào)至7.2-7.4， 121'C滅菌 20 min。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，其中步驟2)所用 腐熟的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量>35%，有機(jī)氮質(zhì)量比含 量為1.2-2%，含水量質(zhì)量比25-30%。
7、 權(quán)利要求2或3所述微生物有機(jī)肥料的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及防除黃瓜連作立枯病的拮抗菌及其生產(chǎn)的微生物有機(jī)肥料，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明分離到了對(duì)黃瓜立枯病原真菌有顯著拮抗作用的拮抗菌NJN43，該拮抗菌與有機(jī)堆肥混合制成微生物有機(jī)肥料，肥料中含有1×10⁸個(gè)/g以上的拮抗微生物數(shù)量、全氮含量為4～5％(90％以上為有機(jī)氮)，總氮磷鉀養(yǎng)分為6～10％、有機(jī)質(zhì)含量為30～35％。試驗(yàn)表明，這種微生物有機(jī)肥料施入土壤后能夠使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成優(yōu)勢(shì)群，在黃瓜立枯病嚴(yán)重的連作土壤中對(duì)立枯病的生物防治率達(dá)70％以上。在還沒有形成連作障礙的土壤上長(zhǎng)期施用本微生物有機(jī)肥料能在很大程度上防止連作作物立枯病的發(fā)生。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101659931SQ200910183358
公開日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者偉 冉, 楊興明, 標(biāo) 沈, 沈其榮, 黃新琦 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)