專利名稱：D-絲氨酸酶法轉化制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及D-絲氨酸酶法轉化制備方法。
二背景技術：
D-氨基酸及其衍生物廣泛應用于醫(yī)藥等領域，它是合成新藥如抗菌和抗病 毒藥物、食品添加劑如人工甜味劑的重要中間體。其中D-絲氨酸是一種內(nèi)源性 腦信息協(xié)傳物質，它可以用于預防或治療腦缺血缺氧所致腦損傷。近年來人們 發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在著區(qū)域性的高濃度D-絲氨酸，它作為N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的內(nèi)源性配體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的產(chǎn)生、代謝 和生理藥理等方面具有重要作用。此外，D-絲氨酸不僅用于合成治療結核病的 特效藥D-環(huán)絲氨酸，還可作為制備其它醫(yī)藥中間體的重要原料。
D-氨基酸很難從自然界中獲得，目前研究或產(chǎn)業(yè)化一般通過拆分外消旋絲 氨酸的方法制備，拆分的方法有化學拆分、物理拆分及酶拆分。
1、 化學拆分法
2005年，秦為民等(化學試劑，2005， 11)以2-N- (N'-節(jié)基)脯氨酰-氨 基-二苯甲酮甘氨酸席夫堿Ni (II)復合物與聚甲醛反應，生成2-N- (N'-芐基) 脯氨酰-氨基-二苯甲酮絲氨酸席夫堿Ni (II)復合物，經(jīng)水解制備了 D-或L-絲氨酸。
2007年，吳劉洋等(氨基酸和生物資源，2007， 2)以DL-絲氨酸為原料， 經(jīng)甲酯化后與L-2，3-二苯甲酰酒石酸反應得到D-絲氨酸甲酯'L-2,3-二苯甲酰酒 石酸鹽，經(jīng)水解制得D-絲氨酸，總收率為74.8%。
2、 物理拆分法
2007年，Seung-Hee Son等(Journal of Applied Polymer Science, 2007， 104) 以界面聚合技術制備了分子印跡復合膜，該膜能選擇性透過D-絲氨酸。當光學 拆分外消旋絲氨酸時，D-絲氨酸的擴散速率比L-絲氨酸快，復合膜中絲氨酸對 映體過量值達80%左右。
2007年，馬云峰等(CN 1900052A)以誘導結晶法制備左旋絲氨酸和右旋 絲氨酸，收率96%以上。3、酶法
2006年，朱延新等(CN 1834257A)以乙酰甘氨酸為起始原料，與甲醛反 應直接制備乙酰-DL-絲氨酸，進而用?；富虻鞍酌覆鸱值玫紻-絲氨酸。
2006年，池田創(chuàng)等(CN 1280424C)利用高活性的L-絲氨酸脫氨酶重組菌 株，與含有DL-絲氨酸的介質混合分解L-絲氨酸，然后從該介質中提取殘存的 D-絲氨酸。
2007年，安樂城正等(CN 101040047A)構建了具有D-絲氨酸合成酶活性 的基因工程菌，并利用該酶以甲醛和甘氨酸為原料制備D-絲氨酸。
2008年，龐敏等(食品與發(fā)酵工業(yè)，2008， 10)以吲哚和DL-絲氨酸為底 物，利用大腸桿菌A co//色氨酸酶酶促轉化，在生成L-色氨酸的同時得到D-
絲氨酸。
此夕卜，曰本專禾U (Japanese Published Unexamined Patent Application No. 61-152291)公開報導了通過微生物作用，由DL-羥甲基乙內(nèi)酰脲生成N-氨基甲 ?；?D-絲氨酸，然后水解得到D-絲氨酸的方法。日本專利(Japanese Published Unexamined Patent Application No. 5-91895)將具有酪氨酸酶活性的微生物與含 有DL-絲氨酸和酚的反應液互相作用，將L-絲氨酸轉換成L-酪氨酸，分離提取 殘存的D-絲氨酸。
以上提及酶法制備D-絲氨酸的方法存在酶活低，L-絲氨酸分解不完全需要 進行DL-絲氨酸分離，生成的D-絲氨酸濃度低等不利因素，用作D-絲氨酸工業(yè) 生產(chǎn)都有難度。
氨基?；赣捎诰哂懈咝院蛷V泛的底物特異性，在手性氨基酸生產(chǎn)中己 被廣泛應用。
2000年姚文兵等(中國藥科大學學報，2000， 31)以固定化牛腎氨基?；?酶拆分DL-丙氨酸。
2005年，錢紹松等(化工進展，2005， 24)利用米曲霉的氨基酰化酶活性 拆分了DL-茶氨酸，在最適條件下，L-茶氨酸收率達到理論收率的85%。
2005年，高大響等(氨基酸和生物資源，2005， 27)選育了刺孢小克銀漢 霉9980菌株，并利用其氨基?；覆鸱至?DL-丙氨酸，D-丙氨酸得率達87.1%。
2006年，崔志芳等(化學反應工程與工藝，2006， 22)利用從豬腎中提取
4的氨基?；?，對N-乙酰-DL-蛋氨酸進行了拆分，在最佳工藝條件下L-蛋氨酸 的產(chǎn)率可達45%。2009年，焦慶才等(精細化工，2009， 26)構建了具有氨基?；富钚缘?基因工程菌DM202，并以該菌的固定化細胞光學拆分了 DL-丙氨酸。但到目前為止，以DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸為起始原料，經(jīng)乙?；被??；覆鸱?、酸水解等歩驟制備D-絲氨酸的方法還未見文獻報導。 三、發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的問題是提供一種高效、低成本制備D-絲氨酸的方法。目前受技術和成本的限制，我國氨基酸工業(yè)中D-絲氨酸的產(chǎn)量遠不能滿足 市場需求。本發(fā)明采用DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸為起始原料，經(jīng)酰化、酶法拆 分、酸水解等步驟得到D-絲氨酸，原料成本低，酶法拆分效率高，反應條件溫 和，工藝流程簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明可以通過以下的技術方案來實現(xiàn)D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其歩驟為(1) 以DL-2-氨基-3-垸氧基丙酸為起始原料，用醋酐乙酰化得N-乙酰-DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸；(2) 將含有氨基?；傅挠坞x細胞或固定化細胞或該酶提取液與pH6 10的 N-乙酰-DL-2-氨基-3-垸氧基丙酸水溶液混合，加入表面活性劑和金屬離子，在 3(TC 6(TC條件下進行酶促反應；(3) 通過等電點結晶法或等電點結晶與離子交換樹脂相結合的方法對反應生成 物進行分離，得到高純度的N-乙酰-D-2-氨基-3-烷氧基丙酸和L-2-氨基-3-垸氧 基丙酸；(4) 轉化產(chǎn)物分別經(jīng)鹽酸或氫溴酸水解得到D-絲氨酸和L-絲氨酸。 上述步驟(1)所用的DL-2-氨基-3-垸氧基丙酸為DL-2-氨基-3-甲氧基丙酸或DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸或DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸或DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸。上述步驟(2)所用的氨基?；竵碓从趧游飪?nèi)臟或具有氨基?；富钚缘?微生物菌株或基因工程菌株。動物內(nèi)臟來源的氨基?；笧樨i腎或牛腎粗酶提 取液，微生物來源的氨基?；笧槊浊够虼替咝】算y漢霉或基因工程菌。氨基?；傅男螒B(tài)為粗酶提取液或游離菌體或固定化細胞。所用的N-乙酰-DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸水溶液濃度為20g/L 500g/L，最適濃度為100g/L 350g/L， 溶液pH為6 10，調(diào)溶液pH所用的無機堿為碳酸鈉或碳酸氫鈉或氫氧化鈉或 氫氧化鉀。所述的表面活性劑為吐溫-80或十六垸基三甲基溴化銨或聚乙二醇辛 基苯基醚，其濃度為0.05g/L 50g/L;所述的金屬離子為鈷離子或鈣離子或鎂 離子或錳離子，其濃度為lxl(r2mol/L lxlO—6mol/L。上述步驟(4)所用的鹽酸質量濃度為20% 37%，氫溴酸質量濃度為20% 47%，回流反應直至反應物脫去垸氧基和乙酰基。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點(1) 以DL-2-氨基-3-垸氧基丙酸為起始原料制備D-絲氨酸，成本低廉，工藝 簡單，產(chǎn)物得率高。(2) 酶促反應中使用的氨基?；竵碓磸V泛，酶法轉化條件溫和，轉化效率高， 為大量生產(chǎn)D-絲氨酸提供了可能。(3) N-乙酰-D-2-氨基-3-烷氧基丙酸和L-2-氨基-3-烷氧基丙酸理化性質差異大，用等電點結晶或等電點結晶與離子交換樹脂相結合的方法分離制備，工藝流程簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。(4) 具有原料來源豐富，價格低廉，酶法轉化時間短，操作簡便，生產(chǎn)成本低 等優(yōu)點。四具體實施方式
實施例一 D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其制備步驟如下1、 取50gDL-2-氨基-3-甲氧基丙酸溶于150mL水中，用質量濃度30%的NaOH 水溶液調(diào)pH9，控制反應液溫度低于2(TC，緩慢滴加醋酐進行酰化反應，同時 滴加30。/。NaOH水溶液控制pH10左右，?；瓿珊笳婵諠饪s，濃縮液調(diào)pH2， 冷卻結晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-DL-2-氨基-3-甲氧基丙酸64.8g， 含量95%，摩爾收率91%。2、 將從豬腎中提取的氨基酰化酶粗酶液10mL加入到590mL轉化液中，轉化 液含64.8gN-乙酰-DL-2-氨基-3-甲氧基丙酸，0.6mL0.1 mol/L鈷離子，pH7.5， 40。C反應15h。轉化液中L-2-氨基-3-甲氧基丙酸濃度36g/L，對N-乙酰-L-2-氨 基-3-甲氧基丙酸的摩爾轉化率為95%。活性炭脫色，減壓濃縮至60mL，冷卻 結晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-甲氧基丙酸和L-2-氨基-3-甲氧基丙酸的混合結晶 32g，將32g混合結晶加入到120mL95。/。乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨基-3-甲氧基丙酸15.6g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結晶母液合并調(diào)pH2， 冷卻結晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-甲氧基丙酸22g，結 晶母液循環(huán)套用。4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-甲氧基丙酸22g和L-2-氨基-3-甲氧基丙酸15.6g，分別溶于質量濃度35%的鹽酸中回流至反應完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋脫色后上陽離子交換柱分離，得D-絲氨酸10.1g，比旋光["]，=-14.8° (c=10， 2N HC1)和L-絲氨酸9.6g，比旋光[ ]^=+14.5° (c=10， 2NHC1)。實施例二 D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其制備步驟如下1、 稱取100g DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸溶于300mL水中，采用與實施例1相同 的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸127g，含量95%，摩爾收 率92%。2、 將從牛腎中提取的氨基酰化酶粗酶液10mL加入到990mL轉化液中，轉化 液含127gN-乙酰-DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸，lmL O.lmol/L鈷離子，pH7.5， 40°C 反應24h。轉化液中L-2-氨基-3-乙氧基丙酸濃度44g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-乙氧基丙酸的摩爾轉化率為 96%。3、 將上述轉化液升溫到70 80。C，加入活性炭脫色，減壓濃縮至120mL，冷卻 結晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-乙氧基丙酸和L-2-氨基-3-乙氧基丙酸的混合結晶 62.7g，將62.7g混合結晶加入到250mL95。/。乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨 基-3-乙氧基丙酸30.8g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結晶母液合并調(diào) pH2，冷卻結晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-乙氧基丙酸 42g，結晶母液循環(huán)套用。4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-乙氧基丙酸42g和L-2-氨基-3-乙氧基丙酸30.8g，分 別溶于質量濃度45%的氫溴酸中回流至反應完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋 脫色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸18.9g，比旋光[ ]，=-14.7°"=10， 2NHC1)和L-絲氨酸17g，比旋光+14.6° (c=10， 2NHC1)。實施例三D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其制備步驟如下
1、 稱取100g DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸溶于300mL水中，采用與實施例1相同 的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸126g，含量94%，摩爾收 率92%。
2、 將1000mL發(fā)酵液抽濾得到的米曲霉33g加入到990mL轉化液中，轉化液 含126gN-乙酰-DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸，lmL O.lmol/L鈣離子，10mL質量濃 度1%十六烷基三甲基溴化銨，pH7.5， 40。C反應30h。轉化液中L-2-氨基-3-丙 氧基丙酸濃度43g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-丙氧基丙酸的摩爾轉化率為95%。
3、 將上述轉化液升溫到70 8(TC，加入活性炭脫色，減壓濃縮至120mL，冷卻 結晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸和L-2-氨基-3-丙氧基丙酸的混合結晶 60g，將60g混合結晶加入到250mL95。/。乙醇中，攪拌溶解，抽濾得1^-2-氨基-3-丙氧基丙酸32.8g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結晶母液合并調(diào)pH2， 冷卻結晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸44g，結 晶母液循環(huán)套用。
4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸44g和L-2-氨基-3-丙氧基丙酸32.8g，分
別溶于質量濃度25%的鹽酸中回流至反應完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋脫
色后上陽離子交換柱分離得0-絲氨酸18.3§，比旋光[州，=-14.7° (c=10， 2N
HC1)和L-絲氨酸16.4g，比旋光["]^=+14.8° (c=10， 2NHC1)。
實施例四D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其制備步驟如下
1、 稱取100g DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸溶于300mL水中，采用與實施例1相同 的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸123g，含量95%，摩爾收 率93%。
2、 將1000mL刺孢小克銀漢霉9980發(fā)酵液抽濾得到的濕菌體42g加入到990mL 轉化液中，轉化液含123gN-乙酰-DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸，lmL O.lmol/L鈣離 子，10mL質量濃度0.5%吐溫-80， pH7.5， 4(TC反應40h。轉化液中L-2-氨基-3-丁氧基丙酸濃度44g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-丁氧基丙酸的摩爾轉化率為95%。
3、 將上述轉化液升溫到70 8(TC，加入活性炭脫色，減壓濃縮至120mL，冷卻 結晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸和L-2-氨基-3-丁氧基丙酸的混合結晶 64g，將64g混合結晶加入到250mL95。/。乙醇中，攪拌溶解，抽濾得匸2-氨基-3-丁氧基丙酸33g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結晶母液合并調(diào)pH2， 冷卻結晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸44g，結 晶母液循環(huán)套用。
4、取N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸44g和L-2-氨基-3-丁氧基丙酸33g，分別 溶于質量濃度30%的氫溴酸中回流至反應完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋脫
色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸17.1g，比旋光[c^卜-14.6° (c=10， 2N
HC1)和L-絲氨酸15g，比旋光["]^ = +14.8° (c=10， 2NHC1)。
實施例五D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其制備步驟如下
1、 稱取200gDL-2-氨基-3-甲氧基丙酸溶于600mL水中，采用與實施例1相同 的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-甲氧基丙酸262g，含量94%，摩爾收 率91%。
2、 取1000mL基因工程菌DM202發(fā)酵液離心所得濕菌體14g，加入到990mL 轉化液中，轉化液含262gN-乙酰-DL-2-氨基-3-甲氧基丙酸，lmL O.lmol/L鎂離 子，10mL質量濃度1%十六垸基三甲基溴化銨，pH7.5， 4(TC反應28h。轉化液 中L-2-氨基-3-甲氧基丙酸濃度85.5g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-甲氧基丙酸的摩 爾轉化率為94%。
3、 將上述轉化液升溫到70 8(TC，加入活性炭脫色，減壓濃縮至250mL，冷卻 結晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-甲氧基丙酸和L-2-氨基-3-甲氧基丙酸的混合結晶 123g，將123g混合結晶加入到500mL 95%乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨 基-3-甲氧基丙酸60.8g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結晶母液合并調(diào) pH2，冷卻結晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-甲氧基丙酸 86.2g，結晶母液循環(huán)套用。
4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-甲氧基丙酸86.2g和L-2-氨基-3-甲氧基丙酸60.8g， 分別溶于質量濃度35%的鹽酸中回流至反應完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋 脫色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸42.4g，比旋光["]^=-14.5°"=10， 2N
HC1)和L-絲氨酸37.6g，比旋光[";^=+14.7° (c=10， 2NHC1)。
實施例六D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其制備步驟如下
1 、稱取200g DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸溶于600mL水中，采用與實施例1相同
9的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸246g，含量95%，摩爾收 率91%。
2、 將從豬腎中提取的氨基酰化酶粗酶液20mL加入到980mL轉化液中，轉化 液含246gN-乙酰-DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸，lmL0.1mol/L鎂離子，pH7.5，40。C 反應30h。轉化液中L-2-氨基-3-丙氧基丙酸濃度85.4g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-
丙氧基丙酸的摩爾轉化率為94%。
3、 將上述轉化液升溫到70 8(TC，加入活性炭脫色，減壓濃縮至250mL，冷卻 結晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸和L-2-氨基-3-丙氧基丙酸的混合結晶 125g，將125g混合結晶加入到500mL 95%乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨 基-3-丙氧基丙酸61.7g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結晶母液合并調(diào) pH2，冷卻結晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸 83g，結晶母液循環(huán)套用。
4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸83g和L-2-氨基-3-丙氧基丙酸61.7g，分
別溶于質量濃度30%的氫溴酸中回流至反應完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋 脫色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸34.6g，比旋光["]，=-15° (c=10， 2N
HC1)和L-絲氨酸30.9g，比旋光["]，=+14.8° (c=10， 2NHC1)。
實施例七D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其制備步驟如下
1、 稱取200g DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸溶于600mL水中，采用與實施例1相同 的酰化方法制備得N-乙酰-DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸242g，含量95%，摩爾收 率91%。
2、 取2000mL米曲霉發(fā)酵液離心所得濕菌體55g，加入到990mL轉化液中，轉 化液含242gN-乙酰-DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸，1mL O.lmol/L錳離子，10mL質 量濃度0.5%聚乙二醇辛基苯基醚，pH7.5， 4(TC反應48h。轉化液中L-2-氨基-3-丁氧基丙酸濃度85g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-丁氧基丙酸的摩爾轉化率為94。/0。
3、 將上述轉化液升溫到70 8(TC，加入活性炭脫色，減壓濃縮至250mL，冷卻 結晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸和L-2-氨基-3-丁氧基丙酸的混合結晶 129g，將129g混合結晶加入到500mL95。/。乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨 基-3-丁氧基丙酸63.2g;將乙醇濾液蒸發(fā)濃縮，濃縮液與混合結晶母液合并調(diào) pH2，冷卻結晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸86.7g，結晶母液循環(huán)套用。
4、取N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸86.7g和L-2-氨基-3-丁氧基丙酸63.2g， 分別溶于質量濃度25%的氫溴酸中回流至反應完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀
釋脫色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸33.6g，比旋光["]，=-14.6° (c=10，
2NHC1)和L-絲氨酸28.9g，比旋光[ ]^= + 14.6° (c=10， 2NHC1)。
實施例八D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其制備步驟如下
1、 稱取300g DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸溶于900mL水中，采用與實施例1相同 的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸386g，含量94%，摩爾收 率92%。
2、 取1000mL基因工程菌DM202發(fā)酵液離心所得濕菌體15g，制備以卡拉膠 為載體的固定化細胞，并將固定化細胞加入到1200mL轉化液中，轉化液含386g N-乙酰-DL-2-氨基-3-乙氧基丙酸，1.2mL0.1mol/L錳離子，12mL質量濃度0.5% 聚乙二醇辛基苯基醚，pH7.5， 50。C反應36h。轉化液中L-2-氨基-3-乙氧基丙酸 濃度107g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-乙氧基丙酸的摩爾轉化率為94%。
3、 將上述轉化液中固定化細胞濾出，重復使用；濾出的轉化液升溫到70 8(TC， 加入活性炭脫色，減壓濃縮至350mL，冷卻結晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-乙氧基 丙酸和L-2-氨基-3-乙氧基丙酸的混合結晶181g，將181g混合結晶加入到700mL 95%乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨基-3-乙氧基丙酸90g;將乙醇濾液蒸發(fā) 濃縮，濃縮液與混合結晶母液合并調(diào)pH2，冷卻結晶，真空過濾、純水洗滌烘 干得N-乙酰-D-2-氨基-3-乙氧基丙酸127g，結晶母液循環(huán)套用。
4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-乙氧基丙酸127g和L-2-氨基-3-乙氧基丙酸90g，分 別溶于質量濃度30%的鹽酸中回流至反應完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋脫
色后上陽離子交換柱分離得0-絲氨酸57.2§，比旋光["]，=-14.6° (c=10， 2N
HC1)和L-絲氨酸49.7g，比旋光["]^=+14.8° (c=10， 2NHC1)。
實施例九D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其制備歩驟如下 1、稱取300gDL-2-氨基-3-丙氧基丙酸溶于900mL水中，采用與實施例1相同 的酰化方法制備得N-乙酰-DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸373g，含量95%，摩爾收 率92%。2、 取lOOOmL基因工程菌DM202發(fā)酵液離心所得濕菌體14g，制備以海藻酸 鈣為載體的固定化細胞，并將固定化細胞加入到1200mL轉化液中，轉化液含 373g N-乙酰-DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸，L2mL O.lmol/L鈷離子，12mL質量濃 度0.5%吐溫-80， pH7.5， 5CTC反應35h。轉化液中L-2-氨基-3-丙氧基丙酸濃度 106g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-丙氧基丙酸的摩爾轉化率為93%。
3、 將上述轉化液中固定化細胞濾出，重復使用；濾出的轉化液升溫到70 8(TC， 加入活性炭脫色，減壓濃縮至350mL，冷卻結晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基 丙酸和L-2-氨基-3-丙氧基丙酸的混合結晶178g，將178g混合結晶加入到700mL 95%乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨基-3-丙氧基丙酸95.6g;將乙醇濾液蒸發(fā) 濃縮，濃縮液與混合結晶母液合并調(diào)pH2，冷卻結晶，真空過濾、純水洗滌烘 干得N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸132g，結晶母液循環(huán)套用。
4、 取N-乙酰-D-2-氨基-3-丙氧基丙酸132g和L-2-氨基-3-丙氧基丙酸95.6g，分 別溶于質量濃度35%的氫溴酸中回流至反應完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋
脫色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸55g，比旋光[ol，--14.5° (c=10， 2N
HC1)和L-絲氨酸47.8g，比旋光[ ]^=+14.6° (c=10， 2NHC1)。
實施例十D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其制備步驟如下
1、 稱取300g DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸溶于900mL水中，釆用與實施例1相同 的?；椒ㄖ苽涞肗-乙酰-DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸374g，含量94%，摩爾收 率93%。
2、 取1000mL基因工程菌DM202發(fā)酵液離心所得濕菌體15g，制備以海藻酸 鈣為載體的固定化細胞，并將固定化細胞加入到1200mL轉化液中，轉化液含 374g N-乙酰-DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸，1.2mL O.lmol/L鈷離子，12mL質量濃 度0.5%吐溫-80， pH7.5， 50。C反應35h。轉化液中L-2-氨基-3-丁氧基丙酸濃度 99.7g/L，對N-乙酰-L-2-氨基-3-丁氧基丙酸的摩爾轉化率為95%。
3、 將上述轉化液中固定化細胞濾出，重復使用；濾出的轉化液升溫到70 8(TC， 加入活性炭脫色，減壓濃縮至350mL，冷卻結晶得N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基 丙酸和L-2-氨基-3-丁氧基丙酸的混合結晶178g，將178g混合結晶加入到700mL 95%乙醇中，攪拌溶解，抽濾得L-2-氨基-3-丁氧基丙酸90.5g;將乙醇濾液蒸發(fā) 濃縮，濃縮液與混合結晶母液合并調(diào)pH2，冷卻結晶，真空過濾、純水洗滌烘干得N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸131g，結晶母液循環(huán)套用。
4、取N-乙酰-D-2-氨基-3-丁氧基丙酸131g和L-2-氨基-3-丁氧基丙酸90.5g,分
別溶于質量濃度20%的鹽酸中回流至反應完全，經(jīng)真空濃縮脫酸、加水稀釋脫
色后上陽離子交換柱分離得D-絲氨酸50.8g，比旋光["]，=-14.7° (c=10， 2N HC1)和L-絲氨酸41.3g，比旋光["]^=+14.6° (c=10， 2NHC1)。
權利要求
1、一種D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其特征是由以下步驟構成(1)以DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸為起始原料，用醋酐乙?；肗-乙酰-DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸；(2)將含有氨基?；傅挠坞x細胞或固定化細胞或該酶提取液與pH6～10的N-乙酰-DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸水溶液混合，加入表面活性劑和金屬離子，在30℃～60℃條件下進行酶促反應；(3)通過等電點結晶法或等電點結晶與離子交換樹脂相結合的方法對反應生成物進行分離，得到高純度的N-乙酰-D-2-氨基-3-烷氧基丙酸和L-2-氨基-3-烷氧基丙酸；(4)轉化產(chǎn)物分別經(jīng)鹽酸或氫溴酸水解得到D-絲氨酸和L-絲氨酸。
2、 根據(jù)權利要求1所述的D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(1) 所用的DL-2-氨基-3-垸氧基丙酸為DL-2-氨基-3-甲氧基丙酸或DL-2-氨基-3-乙氧 基丙酸或DL-2-氨基-3-丙氧基丙酸或DL-2-氨基-3-丁氧基丙酸。
3、 根據(jù)權利要求1所述的D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2) 所用的氨基?；竵碓从趧游飪?nèi)臟或具有氨基?；富钚缘奈⑸锞昊蚧?工程菌株；氨基?；傅男螒B(tài)為粗酶提取液或游離菌體或固定化細胞。
4、 根據(jù)權利要求1所述的D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2) 所用的N-乙酰-DL-2-氨基-3-垸氧基丙酸水溶液濃度為20g/L 500g/L，最適濃度 為100g/L 350g/L，溶液pH為6 10，調(diào)溶液pH所用的無機堿為碳酸鈉或碳 酸氫鈉或氫氧化鈉或氫氧化鉀。
5、 根據(jù)權利要求1所述的D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(2) 所述的表面活性劑為吐溫-80或十六烷基三甲基溴化銨或聚乙二醇辛基苯基醚， 其濃度為0.05g/L 50g/L;所述的金屬離子為鈷離子或鈣離子或鎂離子或錳離 子，其濃度為lxl(r2mol/L lxl(r6mol/L。
6、 根據(jù)權利要求1所述的D-絲氨酸酶法轉化制備方法，其特征在于步驟(4) 所用的鹽酸質量濃度為20% 37%，氫溴酸質量濃度為20% 47%，回流反應直 至反應物脫去烷氧基和乙?；?br> 全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及D-絲氨酸酶法轉化制備方法。該制備方法以DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸為起始原料，經(jīng)醋酐乙?；肗-乙酰-DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸；然后將含有氨基?；傅挠坞x細胞或固定化細胞或該酶提取液與N-乙酰-DL-2-氨基-3-烷氧基丙酸水溶液混合，在30℃～60℃下進行酶促反應，利用等電點結晶或等電點結晶與離子交換樹脂相結合的方法分離轉化產(chǎn)物，得到高純度的N-乙酰-D-2-氨基-3-烷氧基丙酸和L-2-氨基-3-烷氧基丙酸；轉化產(chǎn)物分別經(jīng)鹽酸或氫溴酸水解后即得D-絲氨酸和L-絲氨酸。該方法具有原料價格低廉，操作簡便，轉化時間短，生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。
文檔編號C12P41/00GK101659978SQ200910183530
公開日2010年3月3日 申請日期2009年9月23日 優(yōu)先權日2009年9月23日 公開號200910183530.發(fā)明者茜 劉, 劉均忠, 焦慶才, 熊吉濱, 趙根海 申請人:南京大學