專利名稱：：一種人工設(shè)計(jì)的Bt抗蟲基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因人工改造和生物防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種人工設(shè)計(jì)的Bt抗蟲基因，及其在鱗翅目害蟲防治上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蘇云金芽孢桿菌(Bt)的晶體蛋白可作為生物農(nóng)藥特異地毒殺某些昆蟲。該晶體蛋白被昆蟲攝取后，在昆蟲腸道的堿性條件下溶解產(chǎn)生130KD左右的前毒素分子，經(jīng)腸道蛋白酶水解前毒素的C端被降解，最后產(chǎn)生由N端65-70KD組成的毒蛋白。該毒蛋白的N端一段殘基(就CrylA而言為28個)進(jìn)一步被腸蛋白酶加工去掉才能形成完全活化的毒蛋白。活化的毒蛋白與敏感昆蟲中腸上皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，插入到中腸細(xì)胞膜上形成0.51.Onm的小空或離子通道，引起胞內(nèi)離子的外滲及水的內(nèi)滲，造成細(xì)胞溶脹破裂，大量細(xì)胞遭到破壞，致使幼蟲停止進(jìn)食而死亡。研究證明，Bt晶體蛋白對人體、哺乳動物、鳥類、魚類以及很多有益昆蟲均無毒害作用，所以Bt制劑已作為一種無公害的天然微生物殺蟲劑在農(nóng)業(yè)、林業(yè)及環(huán)境衛(wèi)生等方面應(yīng)用了近50年。但由于自然條件下Bt晶體蛋白穩(wěn)定性差，殺蟲效果受天氣影響大，易被太陽照射降解，也不能滲透到植物組織內(nèi)部，易被雨水沖刷掉；且其必須被昆蟲取食到才能發(fā)揮殺蟲功能，這些限制因素使該生物殺蟲劑的發(fā)展一直受到很大制約，所以目前對農(nóng)業(yè)害蟲的防治還主要依靠化學(xué)殺蟲劑。20世紀(jì)80年代中期，隨著植物基因工程技術(shù)的成熟、Bt基因克隆的成功及對Bt晶體蛋白殺蟲劑機(jī)制研究的深入，使人們有可能將Bt基因轉(zhuǎn)入植物獲得可表達(dá)殺蟲蛋白的抗蟲轉(zhuǎn)基因植物。目前，全世界已有26種以上Bt轉(zhuǎn)基因植物，包括棉花、玉米、水稻等主要農(nóng)作物。野生型Bt晶體蛋白基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量非常低。在CaMV355啟動子驅(qū)動下其表達(dá)量約占總可溶性蛋白的0.001%左右，不能使轉(zhuǎn)基因植物獲得毒殺多數(shù)對Bt毒蛋白不太敏感的昆蟲。并且來源于Bt的殺蟲基因直接轉(zhuǎn)入植物中還存在表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定的問題。1991年，Perlark等(FREDERICKJ.PERLAK等Proc.Natl.Acad.Sci.USA883324-3328,1991)根據(jù)植物基因的密碼子使用頻率及可能影響植物mRNA穩(wěn)定性的基序在保持原Bt基因編碼的氨基酸序列不變前提下，對Bt晶體蛋白基因CrylAb和CrylAc進(jìn)行了改造。改造的基因在轉(zhuǎn)基因煙草和番茄中表達(dá)的殺蟲蛋白量比野生型基因的表達(dá)量分別提高了約10倍和100倍。然而，這種改造只是部分使用了偏好密碼子，大部分氨基酸仍使用了多個密碼子(表3FMCrylAb基因)。同時(shí)，不同植物的密碼子使用頻率存在差異，以同是高等植物的單子葉植物和雙子葉植物為例，單子葉植物氨基酸密碼子簡并位(末位)偏向使用C或G，而雙子葉植物部分氨基酸密碼子的簡并位卻偏向使用A或U(WiIburH.Campbell等PlantPhysiol.199092,1-11)。因此，根據(jù)植物密碼子的使用頻率設(shè)計(jì)基因，在不同作物中表達(dá)量也會存在差異，要想在特定作物中高量表達(dá)目的基因，應(yīng)根據(jù)本作物的偏好密碼子來改造目的基因。水稻是我國乃至世界的最重要糧食作物之一，每年由于大螟、二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲危害，損失慘重。目前水稻田間生產(chǎn)，如果不使用化學(xué)農(nóng)藥防治鱗翅目害蟲，可使產(chǎn)量損失達(dá)60%左右。近年來，由于水稻基因組計(jì)劃的完成，大大方便了水稻基因序列和密碼子信息的獲得，使得分析水稻密碼子使用頻率成為可能。如能根據(jù)水稻的密碼子使用頻率，挑選偏好密碼子改造現(xiàn)有的BT毒蛋白基因，使其在水稻中穩(wěn)定高效表達(dá)，無疑具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的轉(zhuǎn)基因技術(shù)可打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)不同物種間的基因轉(zhuǎn)移。但是在一個物種高效表達(dá)的基因，被轉(zhuǎn)化到另一物種后，表達(dá)量不一定高，也不一定還能具有本來的功能，特別是對于差異較大的物種。物種密碼子偏好性是影響外源基因表達(dá)量的諸多因素之一。不同的物種往往具有不同的偏好密碼子。分析這種偏好性，在轉(zhuǎn)基因之前，對需要轉(zhuǎn)化的目的基因進(jìn)行密碼子的重新設(shè)計(jì)或改造，將對提高外源基因在受體生物中的表達(dá)量具有重要作用。CrylAb蛋白是一類由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的對鱗翅目害蟲具有毒害作用的伴胞晶體。CrylAb基因在生物防治領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。但是CrylAb基因來源于細(xì)菌(蘇云金芽孢桿菌)，直接應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因植物中，表達(dá)量低，抗蟲性效果差。分析蘇云金芽孢桿菌和水稻的密碼子使用情況，可以發(fā)現(xiàn)兩者在密碼子偏好上存在很大差異，利用水稻的偏好密碼子，重新設(shè)計(jì)和改造crylAb，以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)新CrylAb基因水稻具有較好的抗蟲性。技術(shù)方案1、基因供體生物和受體生物間密碼子使用頻率和偏好密碼子分析不同生物在密碼子使用頻率和偏好性方面存在差異，是影響外源基因在供體生物和受體生物間表達(dá)差異的重要因素之一。本發(fā)明正是利用物種間密碼子偏好性差異來改造和設(shè)計(jì)基因的。本發(fā)明需要改造的基因?yàn)镃rylAb，來源于蘇云金芽孢桿菌(細(xì)菌)，轉(zhuǎn)基因的受體生物為水稻(單子葉植物)。分析水稻和蘇云金芽孢桿菌的密碼子使用頻率結(jié)果見表1。從表1中挑選出水稻和蘇云金芽孢桿菌氨基酸使用頻率最高的密碼子(偏好密碼子，表2)。由表2可知，水稻和蘇云金芽孢桿菌的偏好密碼子存在很大差異，蘇云金芽孢桿菌的氨基酸偏好密碼子第三位(末位)除亮氨酸(L)為G外，其它全部為A或T；而水稻的偏好密碼子第三位全部為G或C，只有偏好的終止密碼子第三位為A。水稻、蘇云金芽孢桿菌密碼子的使用頻率和偏好性差異是本發(fā)明進(jìn)行CrylAb基因設(shè)計(jì)和改造的理論基礎(chǔ)。2、目的基因的設(shè)計(jì)和序列分析用水稻偏好的密碼子(表2)依次替換CrylAb蛋白的每個氨基酸，獲得一個新的基因(DNA序列)，該基因被命名為mCrylAb，序列見SEQIDNO1。分析mCrylAb與其他BT基因間的DNA序列差異，驗(yàn)證mCrylAb是否為一個全新的基因。分析結(jié)果是mCrylAb與CrylAb在DNA序列組成上有很大差異。CrylAb基因使用了58個密碼子，而mCrylAb基因只選用了22種密碼子(只有S和R兩種氨基酸各選用了兩個密碼子，其它氨基酸都只有一個密碼子)；CryIAb基因的GC含量為37.3%，而mCrylAb基因的GC含量為64.7%;同源比對結(jié)果顯示，兩個基因的同源性只有69.38%(圖1)，總共1845個堿基，有565個堿基存在差異。GENBANK數(shù)據(jù)庫中Blast結(jié)果顯示無與mCryIAb基因完全一致的序列，最高同源序列為gb:AY326434.1，同源性僅為89%(1664/1852)?？梢?，mCrylAb為一個全新的基因。3、目的基因的人工合成由于mCrylAb基因是人為設(shè)計(jì)的，在自然界中不存在這個序列，需要全人工合成。本發(fā)明委托上海英俊公司按照mCrylAb基因序列進(jìn)行全人工合成，并裝載在pMD18_T載體上，形成pMD18-mCrylAb載體。4、構(gòu)建目的基因的植物表達(dá)盒或表達(dá)載體把目的基因裝載到植物表達(dá)盒或表達(dá)載體上，為植物轉(zhuǎn)化做準(zhǔn)備。本發(fā)明所用到的表達(dá)載體有兩個，一個為PCAMBI1305.1，用mCryIAb基因替換⑶S基因，形成一個新的載體P35S-mCrylAb(見圖2)，在該載體中mCrylAb基因前的啟動子為CaMV35S，該啟動子為組成型表達(dá)啟動子；另一個為pOsTSPI-GUS載體，同樣用mCrylAb基因替換掉⑶S基因，形成新的載體pOsTSPI-mCrylAb(見圖3)，在該載體中mCrylAb基因前的啟動子為OsTSPI，該啟動子具有組織特異型表達(dá)功能，能使外源基因在水稻胚乳部分不表達(dá)，在葉片、莖等其他組織表達(dá)。并將兩個新構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中。5、目的基因轉(zhuǎn)化受體生物用兩個新構(gòu)建的攜帶有mCrylAb基因的植物表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化受體生物水稻，水稻品種為皖粳97(粳稻)。經(jīng)過愈傷誘導(dǎo)、共培養(yǎng)、抗性愈傷篩選、分化成苗等過程，最終獲得轉(zhuǎn)基因苗。6、目的基因在受體生物中的表達(dá)和功能驗(yàn)證分析受體生物轉(zhuǎn)基因植株中的目的基因表達(dá)情況和功能，以鑒定本發(fā)明改造的基因是否具有預(yù)期效果。p35S-mCrylAb載體轉(zhuǎn)化水稻得到的轉(zhuǎn)基因苗22棵，pOsTSPI-mCrylAb載體得到的轉(zhuǎn)基因苗47株，PCR鑒定這些轉(zhuǎn)基因苗全為陽性。用CrylAb/Ac試紙條(購自北京銀土地生物技術(shù)有限公司)檢測轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果轉(zhuǎn)P35S-mCrylAb基因苗有17株呈陽性，陽性率為77.3%。轉(zhuǎn)pOsTSPIiCrylAb轉(zhuǎn)基因有39株呈陽性，陽性率為88.6%。進(jìn)一步對這些轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行田間抗蟲性鑒定，結(jié)果田間抗蟲性和試紙條檢測結(jié)果一致，即試紙條檢測為陽性的單株，抗蟲；試紙條檢測為陰性的單株，不抗蟲。這說明轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性是由BT毒蛋白引起的。用CrylAb/Ac試紙條檢測轉(zhuǎn)基因水稻各器官mCrylAb基因表達(dá)情況，結(jié)果轉(zhuǎn)P35S-mCrylAb的水稻在莖、葉、穎殼和胚乳中都呈陽性，而轉(zhuǎn)POsTSPI-mCrylAb的水稻在莖、葉、穎殼中呈陽性，但在胚乳中無表達(dá)。所以，35S和OsTSPI兩個啟動子都能驅(qū)動mCrylAb正常表達(dá)，并且表達(dá)的組織特異性與啟動子特性一致，35S為組成性表達(dá)啟動子，而OsTSPI為非胚乳表達(dá)啟動子。用EnvirologixCrylAb/CrylAc平板試劑盒定量測量轉(zhuǎn)基因株系葉片的表達(dá)量(表9)，結(jié)果P35S-mCrylAb轉(zhuǎn)基因植株葉片BT毒蛋白平均表達(dá)量為6.02ng/mg，pOsTSPI-mCrylAb轉(zhuǎn)基因植株葉片BT毒蛋白平均表達(dá)量為8.43ng/mg，兩種啟動子驅(qū)動的mCrylAb平均表達(dá)量達(dá)7.23ng/mg。采集轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻葉片用于試驗(yàn)室稻縱卷葉螟生物測定試驗(yàn)，結(jié)果顯示所有非轉(zhuǎn)基因植株的葉片接蟲4天后全部卷曲，葉片變枯白，為明顯的稻縱卷葉螟取食危害狀，而轉(zhuǎn)基因水稻葉片無明顯變化，葉綠(圖6，7)；非轉(zhuǎn)基因水稻葉片上的蟲子明顯較轉(zhuǎn)基因水稻葉片上的蟲子大(圖7)?？梢?，本發(fā)明利用水稻密碼子偏好性改造的mCryIAb基因能在水稻中正常表達(dá)，并且表現(xiàn)出良好的抗蟲性，利用物種對密碼子的偏好性改造或設(shè)計(jì)基因的方法可行。有益效果本發(fā)明提供了一種利用物種密碼子偏好性，設(shè)計(jì)和改造基因，以增強(qiáng)外源基因在受體物種中功能的方法。利用水稻密碼子頻率表，把來源于蘇云金桿菌的CrylAb蛋白每個氨基酸用水稻偏好密碼子進(jìn)行逐一替換，設(shè)計(jì)出一條由水稻偏好密碼子組成的新的Bt基因，命名為mCryIAb。比較mCryIAb基因與CryIAb基因可以發(fā)現(xiàn)CryIAb基因使用了58個密碼子，而mCrylAb基因只選用了22種密碼子；CryIAb基因的GC含量為37.3%，而mCrylAb基因的GC含量為64.7%；同源比對結(jié)果顯示兩基因同源性只有69.38%。GENBANK數(shù)據(jù)庫中Blast比對結(jié)果顯示無與mCrylAb基因一致的序列，最高同源序列為gb:AY326434.1，同源性僅為89%(1664/1852)。所以mCryIAb為一個全新的基因。該基因應(yīng)用于水稻轉(zhuǎn)化表現(xiàn)出良好的抗蟲性。這說明利用物種密碼子偏好性改造或設(shè)計(jì)基因方法可行。四圖1CryIAb、FMCrylAb和mCrylAb三基因比對結(jié)果a=CrylAb,b=FMCrylAb,c=HiCrylAb；標(biāo)紅堿基為三基因間相同的堿基，沒有標(biāo)紅的堿基為三基因間不同的堿基。圖2:p35S-mCrylAb載體圖LB至RB為轉(zhuǎn)移到受體生物的DNA，包括潮霉素抗性基因和35S啟動子驅(qū)動的mCrylAb基因。圖3:p0sTSPI-mCrylAb載體圖LB至RB為轉(zhuǎn)移到受體生物的DNA，包括潮霉素抗性基因(HPT)和OsTSPI啟動子驅(qū)動的mCrylAb基因。圖4=HiCrylAb基因電泳檢測圖譜1=Marker,2-8為轉(zhuǎn)基因單株。圖5:CrylAb/Ac試紙條檢測結(jié)果1-4:P35S-mCrylAb載體轉(zhuǎn)基因植株各器官檢測結(jié)果，5-8:p0sTSPI-mCrylAb載體轉(zhuǎn)基因植株各器官檢測結(jié)果，1、5莖，2、6葉，3、7穎殼，4、8胚乳；A為試紙條的控制線(controlline)，B為CrylAb蛋白檢測線。圖6稻縱卷葉螟實(shí)驗(yàn)室抗蟲性鑒定_葉片1非轉(zhuǎn)基因水稻皖粳97，2轉(zhuǎn)p35S-mCrylAb基因水稻，3轉(zhuǎn)pOsTSPI-mCrylAb基因水稻。圖7稻縱卷葉螟實(shí)驗(yàn)室抗蟲性鑒定_蟲子和葉片A非轉(zhuǎn)基因水稻葉片及其飼喂的稻縱卷葉螟，B轉(zhuǎn)P35S-mCrylAb基因水稻葉片及其飼喂的稻縱卷葉螟。五具體實(shí)施例方式以下敘述本發(fā)明的實(shí)施例。應(yīng)該說明，本發(fā)明的實(shí)施例只對本發(fā)明起說明作用，而沒有任何限制作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作出某些等同的改動和顯而易見的改進(jìn)。實(shí)施例1水稻、蘇云金芽孢桿菌密碼子的使用頻率和偏好密碼子根據(jù)GENBANK數(shù)據(jù)庫中的信息，收集水稻92188條⑶S序列，共計(jì)34132283個密碼子，蘇云金芽孢桿菌中的496條CDS序列，共計(jì)211286個密碼子，分析這些密碼子在水稻和蘇云金芽孢桿菌中的使用情況(http://WWW.kazusa.or.jp/codon/)，結(jié)果如表1。由表1知同一物種同一氨基酸，不同密碼子被使用的頻率有差異，有的密碼子使用頻率高，有的密碼子使用頻率低，如在水稻中，亮氨酸(L)密碼子使用頻率最高的為CUC，達(dá)到28.51%，使用頻率最低的為UUA，只有6.79%。不同物種間，同一氨基酸使用頻率最高的密碼子往往不同，如絲氨酸(S)在水稻中最高頻使用的密碼子為UCC(20.77%)，而在蘇云金芽孢桿菌中最高頻使用的密碼子為AGU(27.53%)。表1水稻和蘇云金芽孢桿菌的密碼子使用頻率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>歸納水稻和蘇云金芽孢桿菌中各氨基酸最高頻率使用的密碼子(偏好密碼子)，結(jié)果見表2。由表2知，除色氨酸(W)和甲硫氨酸(M)沒有簡并密碼子外，其他氨基酸的偏好密碼子(包括終止密碼子)在水稻和蘇云金芽孢桿菌間都不相同。同時(shí)，蘇云金芽孢桿菌的氨基酸偏好密碼子第三位(末位)除亮氨酸(L)為G外，其它全部為A或T；而水稻的偏好密碼子第三位全部為G或C，只有偏好的終止密碼子第三位為A。這說明，在進(jìn)化過程中，蘇云金芽孢桿菌和水稻在選擇偏好密碼子上存在很大差異。分析物種的密碼子偏好性差異，對利用偏好密碼子改造基因，使外源基因在不同物種中穩(wěn)定高量表達(dá)提供前提依據(jù)。表2水稻和蘇云金芽孢桿菌的偏好密碼子<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例2mCryIAb基因的設(shè)計(jì)及序列分析CrylAb蛋白是一類由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的對鱗翅目害蟲具有毒害作用的伴胞晶體。選用表2中的水稻偏好密碼子，對CrylAb蛋白的氨基酸進(jìn)行逐一替換，獲得一條新的DNA序列，并給這個DNA序列末端加上水稻偏好的終止密碼子TGA，形成一個新基因，該基因被命名為mCrylAb，序列如SEQIDNO:1。FMCrylAb基因?yàn)镕REDERICKJ.PERLAK等根據(jù)植物密碼子和堿基組成設(shè)計(jì)出的一個新基因，該基因已被證實(shí)在煙草和番茄中表達(dá)量大大提高。分析CrylAb、mCrylAb和FMCrylAb三個基因密碼子使用情況，結(jié)果如表3。由表3知=CrylAb基因編碼蛋白的20種氨基酸使用了58個密碼子(共61個氨基酸密碼子)；FMCrylAb使用了55個密碼子，但密碼子的使用頻率與CrylAb基因相比，已經(jīng)發(fā)生較大變化；mCrylAb只選用了22種密碼子，只有S和R兩種氨基酸選用了兩種密碼子，而有39個密碼子在該基因中沒有被使用一次。因此mCrylAb基因的密碼子組成與CrylAb和FMCrylAb相比，已經(jīng)發(fā)生很大改變。表3CrylAb、mCrylAb和FMCrylAb三個基因密碼子使用情況<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>進(jìn)一步分析CryIAb、FMCrylAb和mCrylAb基因的堿基組成，結(jié)果見表4。由表4知CrylAb,FMCrylAb和mCrylAb三個基因的GC含量呈明顯上升趨勢，mCrylAb的GC含量高達(dá)64.7%，高出CrylAb基因27.4%，高出FMCrylAb基因16.2%0表4CryIAb,FMCrylAb和mCrylAb基因堿基成分分析<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>分析CrylAb、FMCrylAb和mCrylAb基因間的序列差異，結(jié)果見表5和圖1。表5顯示mCrylAb與CrylAb間的序列，總堿基數(shù)為1845，不同的堿基數(shù)達(dá)565個，差異率達(dá)30.62%;mCrylAb與FMCrylAb間的不同堿基數(shù)達(dá)346個，差異率達(dá)18.75%?？梢姡琺CrylAb與CrylAb和FMCrylAb在堿基組成上均有較大差異。表5=CrylAb,FMCrylAb和mCrylAb基因序列差異性分析基因2相同的~不同的總堿基數(shù)相似性差異性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>GENBANK數(shù)據(jù)庫中Blast比對結(jié)果顯示無與mCrylAb基因序列一致的記錄，最高同源序列為gb:AY326434.1，同源性僅為89%(1664/1852)?？梢?，mCrylAb是一個全新的基因。將設(shè)計(jì)好的mCrylAb基因送上海英俊公司全基因合成后，連接于pMDIS-T載體上，形成pMD18-mCrylAb載體，并裝載入大腸桿菌JMllO菌株中。實(shí)施例3含有mCrylAb基因表達(dá)載體的構(gòu)建(l)p35s_mCrylAb載體的構(gòu)建用Axygen質(zhì)粒提取試劑盒提取pMD18_mCrylAb載體(大腸桿菌JMllO菌株中)DNA。PCR擴(kuò)增mCryIAb基因，引物序列35S-newBTPGATAACCTGAAGACTCCATGGACAACAACCCGAACATCAACG,35S-newBTRCCAGCATTGAAGACTCGTCACCTCAGTACTCGGCCTCGAAGGTCACC,擴(kuò)增體系<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>擴(kuò)增條件為94°C5min；94°C30s60°C30s72°C30s共30個循環(huán)，72°C7min。取5uLPCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳，檢測目的片段，對剩下的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，超純水溶解，用BclI酶(購自上海生工，按說明書進(jìn)行)切PCR片段，瓊脂糖電泳，膠回收目的片段(Axygen膠回收試劑盒)。Axygen質(zhì)粒提取試劑盒提取pCAMBIA1305.1質(zhì)粒(大腸桿菌JMllO菌株中)DNA，用NcoI和BstEII雙酶切載體PCAMBIA1305.1，膠回收載體片段(Axygen膠回收試劑盒)。T4連接酶連接上述的兩個回收DNA片段，T4連接酶購子(大連寶生物公司)，具體操作按照T4連接酶說明書進(jìn)行。大腸桿菌JMl10感受態(tài)細(xì)胞制備如下①挑取單菌落于IOOmLLB培養(yǎng)液中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；②按110接種量接種于IOOmLLB液體培養(yǎng)液上，37°C，200rpm培養(yǎng)2_3hr至0D600為0.30.4；③菌液置冰浴20min，4°C下4000Xg離心5min，棄上清；④菌體重懸于30mL冰預(yù)冷的0.IMCaCl2中，冰浴30min；⑤4°C下4000Xg離心5min收集菌體；⑥重懸于3mL0.lmol/LCaCl2中，冰浴4_10h，分裝成200μL，_70°C保存?zhèn)溆没?°C一周內(nèi)用完。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JMllO感受態(tài)細(xì)胞的步驟如下①取100μL感受態(tài)細(xì)胞懸液加10μL連接反應(yīng)產(chǎn)物，混勻，冰上放置30min；②42°C水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘；③向管中加入ImlLB液體培養(yǎng)基(不含Kan)，混勻后37°C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Kanr)；④將上述菌液10000Xg離心Imin后，棄上清，留100μL涂布于含Kan(50μg/mL)的LB篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng)16-24小時(shí)；菌落PCR檢測轉(zhuǎn)化的單菌落，取0.2mLPCR薄壁管，按照上述擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系配制混合液(不加模板DNA)，用無菌牙簽分別挑取單菌落混合到PCR反應(yīng)液中，PCR擴(kuò)增和電泳同前述。挑取菌落PCR檢測為陽性的單菌落，IOmLLB培養(yǎng)基過夜搖菌培養(yǎng)，送上海英俊公司測序，檢測mCrylAb基因序列的正確性。對測序正確的單菌落，提取質(zhì)粒DNA(Axygen質(zhì)粒提取試劑盒)，凍融發(fā)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，最終獲得含有P35S-mCrylAb載體(圖2)的農(nóng)桿菌菌株。(2)p0sTSPI-mCrylAb載體的構(gòu)建pOsTSPI-Gus載體是pCAMBIA1305.1質(zhì)粒中GUS基因前的35S啟動子為水稻非胚乳表達(dá)啟動子OsTSPI所取代，形成的載體。利用上述p35S-mCrylAb載體構(gòu)建的方法，用mCrylAbDNA分子取代pOsTSPI_Gus載體中的GUS基因，最終形成pOsTSPI-mCrylAb載體(圖3)，用于轉(zhuǎn)基因。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因水稻的獲得1愈傷組織的誘導(dǎo)取無菌斑飽滿的水稻成熟種子，用70%酒精浸泡1.5min，再用加有一滴Tween-20的2.5%次氯酸鈉于28°C振蕩培養(yǎng)箱消毒45min，然后用無菌水洗至澄清。將經(jīng)徹底消毒的種子置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基成分見表6)，32°C連續(xù)光照培養(yǎng)1周。取質(zhì)地松脆、顏色鮮黃的35mm的胚性愈傷用于共培養(yǎng)。表6水稻遺傳轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分(mg/L)NB(N6macro,B5micro,B5vitamine)+CH300+Pro500+Gln500+2,4-D2.0+Sucrose3%+agar誘導(dǎo)培養(yǎng)基0.8%,pH5.8共培養(yǎng)培養(yǎng)基NB+2’4-D2.0+CH300+Pro500+Gln500+As39.6+sucrose3%+agar0.8%,pH5.8NB+CH300+Pro500+GIn500+2,4-D2.0+Hyg4.0+Carbicillin250+Sucrose3%+Agar0.8%,pH篩選培養(yǎng)基5.8分化培養(yǎng)基NB十CH300+Pro500+GIn500+6-BA2.0+KT0.5+Hyg2.0+Sucrose3%+Agar0.8%,pH5.8生根培養(yǎng)基1/2N6+NAA0.5+sucrose3%+agar0.8%,pH5.82根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)從平板上挑取單菌落，接種于含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)過夜，再按比例的接種量轉(zhuǎn)接入50ml相同培養(yǎng)基中(含相應(yīng)抗生素)培養(yǎng)8h左右(至0D_為0.5左右)。于4°C，5000rpm離心5min，收集菌體。后用5ml含100μmol/LAS的AAM液體培養(yǎng)基重新懸浮，將菌液轉(zhuǎn)入50mL的含100μmol/LAS的AAM液培中，28°C搖床上培養(yǎng)至菌液OD6tlO至0.5。3.共培養(yǎng)取生長旺盛的水稻胚性愈傷組織置于無菌培養(yǎng)皿中，加入新鮮的農(nóng)桿菌菌液(OD600=0.5)，其間輕緩晃動數(shù)次，Ih后將愈傷組織取出，置于無菌濾紙上以吸除殘余菌液，隨即轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)基上，于25°C暗培養(yǎng)23天。4洗菌共培養(yǎng)后，挑取共培養(yǎng)的愈傷置于無菌三角瓶中，用含有250mg/L羧芐青霉素的無菌水沖洗多次，每次搖動數(shù)次，直至水中看不到絲狀菌體。最后一次清洗時(shí)靜止lh，讓黏附于愈傷上的農(nóng)桿菌充分?jǐn)U散到水中。最后，加入含500mg/L的羧芐青霉素的無菌水于25°C的搖床上120rpm搖2h，之后倒掉液體，置愈傷于無菌濾紙上吸干多余水分。5抗性愈傷的篩選將愈傷轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，置25°C培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，其間注意定時(shí)檢查是否有農(nóng)桿菌污染。每兩周轉(zhuǎn)接ι次。培養(yǎng)48周，多數(shù)愈傷褐化死亡，有少數(shù)瘤狀抗性愈傷從干癟褐化的愈傷表面長出。挑選這些抗性愈傷繼續(xù)在篩選培養(yǎng)基上繼代生長，然后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上。6抗性愈傷的分化培養(yǎng)將抗性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上，26°C暗培養(yǎng)1周，然后轉(zhuǎn)入25°C光照培養(yǎng)(16h光照，8h黑暗)。7轉(zhuǎn)基因植株的再生及幼苗移栽轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上的愈傷組織，培養(yǎng)2周后愈傷開始轉(zhuǎn)綠，3周后即可長出幼芽，隨之根也長出。再生的小苗長至23cm左右時(shí)，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，繼續(xù)光照培養(yǎng)至待苗高710cm，打開瓶蓋于溫室中煉苗57天。后移溫室(注意保濕，以提高移栽成活率)。實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測1)PCR檢測采用SDS法提取再生水稻植株葉片DNA，具體步驟如下①取8cm左右的葉片放入2.OmL的離心管中，加入液氮用玻璃棒研磨成粉末②加入700μLSDS提取緩沖液，60°C水浴Ihr；③加入等體積的氯仿/異戊醇(241)，室溫靜置30min；④4°C12000Xg離心IOmin；⑤將上清轉(zhuǎn)移到1.5mL干凈的離心管中，加0.6倍體積的異丙醇，混勻后靜置30min；⑥4°C12000Xg離心lOmin，棄上清；⑦加70%乙醇，洗滌沉淀，4°CIOOOOXg離心5min，；⑨加IOOulLH2O溶解DNA用提取的DNA作為模板進(jìn)行PCR鑒定，檢測的引物序列為Primer-F5'TGTCCCTCTTCCCGAACTACG3，Primer-R5'GAGGTGCGGGCTCCTGATGG3’片段大小為158bp。反應(yīng)體系參見表，<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>擴(kuò)增條件為94°C5min-MV30s58°C30s72°C30s共35個循環(huán)，72°C7min。瓊脂糖凝膠電泳，膠濃度為2.0%(圖4)。由電泳結(jié)果知所有的轉(zhuǎn)基因水稻苗DNA均能擴(kuò)增出158bp的目的條帶，即獲得的轉(zhuǎn)基因苗均整合了mCrylAb基因。2)CrylAb/Ac試紙條鑒定CrylAb/Ac試紙條能靈敏檢出植株體內(nèi)的CrylAb和CrylAc兩類蛋白。取水稻葉片約5cm，裝入1.5mL離心管，加入50mL純水，用Tip頭搗碎葉片至液體呈現(xiàn)綠色，放入試紙條，并保證液面不超過試紙條的Max線，放置1分鐘，取出后再放置1分鐘，觀察試紙條結(jié)果。所有的轉(zhuǎn)基因單株試紙條檢測結(jié)果見表6和表7，匯總結(jié)果見表8。共檢測轉(zhuǎn)P35S-mCrylAb轉(zhuǎn)基因苗22株，有17株呈陽性，陽性率為77.3%。共檢測轉(zhuǎn)pOsTSPI-mCrylAb轉(zhuǎn)基因苗47株，有39株呈陽性，陽性率為88.6%。隨機(jī)挑選試紙條檢測葉片為陽性的轉(zhuǎn)基因單株，分別檢測其莖、穎殼、種子和胚乳中的CrylAb蛋白表達(dá)情況，結(jié)果由P35S-mCrylAb載體獲得轉(zhuǎn)基因苗在葉片、莖、穎殼、和胚乳中都能檢測到CrylAb蛋白，而由pOsTSPI-mCrylAb載體獲得轉(zhuǎn)基因苗在葉片、莖、穎殼、都能檢測到CrylAb蛋白，而在胚乳中未能檢測到CrylAb蛋白(圖5)。這與35S和OsTSPI啟動子的特性是一致的，35S為組成性啟動子，而OsTSPI為組織特異性啟動子，在水稻胚乳中不表達(dá)。表6p35S_mCrylAb轉(zhuǎn)基因植株試紙條和田間抗蟲性鑒定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注“+”表檢測為陽性，“_”表示檢測為陰性；“有蟲”指在植株上能看到大螟、二化螟、稻縱卷葉螟的危害狀，如白穗、卷葉、蟲口取食痕跡等。“無蟲”指植株無螟蟲的危害癥狀。表7p0sTSPI-mCrylAb轉(zhuǎn)基因植株試紙條和田間抗蟲性鑒定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注“+”表檢測為陽性，“_”表示檢測為陰性；“有蟲”指在植株上能看到大螟、二化螟、稻縱卷葉螟的危害狀，如白穗、卷葉、蟲口取食痕跡等?！盁o蟲”指植株無螟蟲的危害癥狀。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>隨機(jī)挑選CrylAb/Ac試紙條檢測為陽性兩個載體的轉(zhuǎn)基因單株各5株，用CrylAb/CrylAc平板試劑盒(購自Envirologix公司)進(jìn)行定量分析。取轉(zhuǎn)基因單株的葉片用液氮磨成粉末，稱取0.02g左右粉末于1.5ml離心管中，加入500ul提取緩沖液，劇烈振蕩后稀釋400倍，取50ul用于測量，測量方法依照試劑盒說明書進(jìn)行，以非轉(zhuǎn)基因單株葉片為陰性對照。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度(0.02ng、0.016ng、0.008ng和Ong)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于樣品的定量分析。測量結(jié)果見表9，由表9知p35S-mCrylAb轉(zhuǎn)基因植株葉片BT毒蛋白平均表達(dá)量為6.02ng/mg,p0sTSPI-mCrylAb轉(zhuǎn)基因植株葉片BT毒蛋白平均表達(dá)量為8.43ng/mg。PEPC-CrylAb轉(zhuǎn)基因株系(由新加坡淡馬錫研究院惠贈，CrylAb基因前的啟動子為綠色組織特異表達(dá)啟動子PEPC，純系)葉片平均BT毒蛋白表達(dá)量為2.02ng/mg。2001年，舒慶堯等用EnvirologixCrylAb/CrylAc平板試劑盒測量克螟稻1、克螟稻2(CrylAb基因由35s啟動子驅(qū)動)的米樣，表達(dá)量在1.5ng/mg-3.lng/mg之間。表9轉(zhuǎn)基因植株ELISA檢測p35S-mCrylAb轉(zhuǎn)基因植株pOsTSPI-mCrylAb轉(zhuǎn)基因植株取樣號粉末重量(g)OD值濃度(ng/mg)取樣號粉末重量(g)OD值濃度(ng/mg)‘20.02091.0666.333834260.01920.979<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性鑒定1)田間抗蟲性觀察將獲得的轉(zhuǎn)基因苗種植于網(wǎng)室，并且全生育期不施農(nóng)藥，花后15天觀察植株抗蟲性，以非轉(zhuǎn)基因的皖粳97作為陰性對照。田間觀察時(shí)，只要植株上出現(xiàn)卷葉、白穗、駐洞、缺口，均認(rèn)為不抗蟲。植株無明顯蟲害，植株健壯，認(rèn)為抗蟲?；ê?5天，陰性對照已表現(xiàn)出嚴(yán)重的螟蟲危害狀，所有單株葉片全卷(2009年試驗(yàn)地合肥大螟和二化螟發(fā)生不嚴(yán)重，沒有見到明顯的白穗，但稻縱卷葉螟發(fā)生嚴(yán)重)。轉(zhuǎn)基因植株田間抗蟲鑒定統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表6和表7。由表6知22株P(guān)35S-mCrylAb轉(zhuǎn)基因苗中抗蟲單株為18株，抗蟲率為81.8%;47株P(guān)35S-mCrylAb轉(zhuǎn)基因苗中抗蟲單株為38株，抗蟲率為80.9%。需要說明的是試紙條檢測結(jié)果與田間抗蟲性觀察結(jié)果基本一致，即試紙條檢測為陽性的單株，一般都具有抗蟲性，試紙條檢測為陰性的單株，一般都不抗蟲。這說明轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性是由BT毒蛋白引起的。但是也有個別單株例外，如轉(zhuǎn)P35S-mCrylAb的25號單株，轉(zhuǎn)pOsTSPI-mCrylAb的1號、15號單株，試紙條檢測為陰性，但是卻未有發(fā)現(xiàn)螟蟲危害，可能是由于為抗性單株包圍，而避免了螟蟲危害。而轉(zhuǎn)pOsTSPI-mCrylAb的17號、29號和39號單株，試紙條檢測為陽性，但是卻發(fā)現(xiàn)有蟲危害，分析可能的原因，其一，與BT毒蛋白表達(dá)量有關(guān)，不同的轉(zhuǎn)基因單株表達(dá)量不同，雖呈陽性，但是表達(dá)量偏低導(dǎo)致抗蟲性不明顯；其二，與抗蟲性調(diào)查尺度有關(guān)，本試驗(yàn)調(diào)查植株受害情況，有螟蟲危害計(jì)為不抗蟲，被蟲少量取食后，蟲子死亡或逃脫，實(shí)為抗蟲單株，可能被計(jì)為不抗蟲單株。2)試驗(yàn)室抗蟲性鑒定隨機(jī)抽取CrylAb/Ac試紙條檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻單株各五株，每株采集12cm長的葉子各5片，置于底部裝有瓊脂的大試管中。從田間收集稻縱卷葉螟的幼蟲(約3齡)，每個試管中接蟲5頭，用保鮮膜覆蓋試管，并用針在保險(xiǎn)膜上刺出透氣孔，至于28°C光照培養(yǎng)箱中，4天后調(diào)查結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果顯示所有非轉(zhuǎn)基因植株的葉片接蟲4天后全部卷曲，葉片變枯白，為明顯的稻縱卷葉螟取食危害狀。而轉(zhuǎn)基因水稻葉片無明顯變化，葉綠(圖6)。打開試管，取出葉片和蟲子，發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因水稻葉片上的蟲子明顯比轉(zhuǎn)基因水稻的葉片上的蟲子大；被取食的葉片量也明顯不同，非轉(zhuǎn)基因水稻被吃成白色網(wǎng)狀，而轉(zhuǎn)基因水稻卻很少被取食(圖7)。序列表OrganizationApplicant----------------------Street農(nóng)科南路40號City:合肥市State:安徽省Country:中國PostalCode230031PhoneNumber:0551_5160535FaxNumber:0551_5160535EmailAddress:sfsl08il63.com<110>0rgmizationName安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所ApplicationProject-------------------<120>Title一種人工設(shè)計(jì)的Bt抗蟲基因及其應(yīng)用<130>AppFileReference一種人工設(shè)計(jì)的Bt抗蟲基因及其應(yīng)用<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate—____Sequence--------<213>0rganismName人工合成<400>PreSequenceStringatggacaacaacccgaacatcaacgagtgcatcccgtacaactgcctctccaacccggag60gtggaggtgctcggcggcgagcgcatcgagaccggctacaccccgatcgacatctccctc120tccctcacccagttcctcctctccgagttcgtgccgggcgccggcttcgtgctcggcctc180gtggacatcatctggggcatcttcggcccgtcccagtgggacgccttcctcgtgcagatc240gagcagctcatcaaccagaggatcgaggagttcgccaggaaccaggccatctccaggctc300gagggcctctccaacctctaccagatctacgccgagtccttcagggagtgggaggccgac360ccgaccaacccggccctccgcgaggagatgcgcatccagttcaacgacatgaactccgcc420ctcaccaccgccatcccgctcttcgccgtgcagaactaccaggtgccgctcctctccgtg480tacgtgcaggccgccaacctccacctcagcgtgctccgcgacgtgagcgtgttcggccag540aggtggggcttcgacgccgccaccatcaacagccgctacaacgacctcaccaggctcatc600ggcaactacaccgaccacgccgtgcgctggtacaacaccggcctcgagcgcgtgtggggc660ccggactccagggactggatcaggtacaaccagttcaggagggagctcaccctcaccgtg720ctcgacatcgtgtccctcttcccgaactacgactccaggacctacccgatccgcaccgtg780tcccagctcaccagggagatctacaccaacccggtgctcgagaacttcgacggcagcttc840cgcggctccgcccagggcatcgagggctccatcaggagcccgcacctcatggacatcctc900aacagcatcaccatctacaccgacgcccacaggggcgagtactactggtccggccaccag960atcatggcctccccggtgggcttcagcggcccggagttcaccttcccgctctacggcacc1020atgggcaacgccgccccgcagcagcgcatcgtggcccagctcggccagggcgtgtacagg1080accctctcctccaccctctacaggaggccgttcaacatcggcatcaacaaccagcagctc1140tccgtgctcgacggcaccgagttcgcctacggcacctcctccaacctcccgtccgccgtg1200tacaggaagagcggcaccgtggactccctcgacgagatcccgccgcagaacaacaacgtg1260ccgccgaggcagggcttctcccacaggctcagccacgtgtccatgttccgctccggcttc1320agcaacagctccgtgagcatcatcagggccccgatgttctcctggatccaccgcagcgcc1380gagttcaacaacatcatcccgtcctcccagatcacccagatcccgctcaccaagtccacc1440aacctcggctccggcacctccgtggtgaagggcccgggcttcaccggcggcgacatcctc1500aggaggacctccccgggccagatcagcaccctcagggtgaacatcaccgccccgctctcc1560cagaggtaccgcgtgaggatccgctacgcctccaccaccaacctccagttccacacctcc1620atcgacggcaggccgatcaaccagggcaacttctccgccaccatgtccagcggcagcaac1680ctccagtccggcagcttcaggaccgtgggcttcaccaccccgttcaacttctccaacggc1740tccagcgtgttcaccctcagcgcccacgtgttcaactccggcaacgaggtgtacatcgac1800cgcatcgagttcgtgccggccgaggtgaccttcgaggccgagtactga1848<212>Type:DNA<211>Length1848SequenceName:1SequenceDescription權(quán)利要求一種人工設(shè)計(jì)的Bt抗蟲基因，該基因核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2.一種表達(dá)盒，其特征在于引入了權(quán)利要求1描述的基因或DNA分子。3.—種表達(dá)載體，其特征在于包含權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。4.一種獲得轉(zhuǎn)基因植物或植物部分的方法，其特征是該方法應(yīng)用了權(quán)利要求1-3所述的基因、DNA分子、表達(dá)盒或載體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物包括糧食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物部分包括細(xì)胞、原生質(zhì)體、細(xì)胞組織培養(yǎng)物、愈傷組織、細(xì)胞塊、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、葉、根、根尖、花藥和種子。7.一種防治害蟲的方法，其特征是該方法應(yīng)用權(quán)利要求4-6的轉(zhuǎn)基因植物或植物部分防治昆蟲，所述害蟲是二化螟、三化螟、大螟、稻縱卷葉螟、玉米螟、棉鈴蟲、棉紅鈴蟲、粘蟲、甜菜夜蛾。8.一種利用物種密碼子偏好性設(shè)計(jì)和改造基因的方法，該方法使改造后基因每個氨基酸密碼子為1-2種。全文摘要本發(fā)明人工設(shè)計(jì)出一條全新的Bt基因，命名為mCry1Ab，同時(shí)構(gòu)建了mCry1Ab基因的表達(dá)盒和表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化水稻。Cry1Ab/Ac試紙條檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)存在BT毒蛋白，且BT毒蛋白的平均表達(dá)量達(dá)7.23ng/mg。室內(nèi)和田間抗蟲性鑒定都顯示轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的抗蟲效果。文檔編號C12N5/10GK101818157SQ20091018577公開日2010年9月1日申請日期2009年12月2日優(yōu)先權(quán)日2009年12月2日發(fā)明者倪大虎,呂玉萍,宋豐順,尚玉花,張毅,李浩,李笑寒,李莉,楊劍波,段永波,汪秀峰,陸徐忠申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所