專利名稱：基因?qū)氩牧霞爸苽浞椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因?qū)爰夹g(shù)。
背景技術(shù)：
基因?qū)胂到y(tǒng)或方法可以分為兩類病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)，以逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病 毒、腺相關(guān)病毒為載體；非病毒型基因?qū)?，如顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀、陽離子脂 質(zhì)體法、以及新興的納米基因?qū)氩牧?。由于病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)存在許多嚴(yán)重的不足，如 病毒轉(zhuǎn)染有可能激活原癌基因等，故非病毒型轉(zhuǎn)染方式是目前的研究熱點(diǎn)，在上述非病毒 式轉(zhuǎn)染中，顯微注射一次只能處理一個細(xì)胞；基因槍穿透力十分有限；磷酸鈣共沉淀法結(jié) 果不穩(wěn)定；僅陽離子脂質(zhì)體法表現(xiàn)了良好的轉(zhuǎn)染效率，但是過高的毒性又限制了它的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種基因?qū)氩牧霞爸苽浞椒ǎ哂辛己玫募?xì) 胞相容性和穩(wěn)定且較高的轉(zhuǎn)染效率。 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明基因?qū)氩牧系募夹g(shù)方案為一種基因?qū)氩牧?，它?碳酸鈣和植酸鈣組成的復(fù)合材料，平均粒徑為200納米左右，其中碳酸鈣含量為80%，植酸 鈣含量為20%。 所述基因?qū)氩牧虾途G色熒光蛋白質(zhì)?；騪GFP以非共價方式結(jié)合形成基因?qū)?入系統(tǒng)，用于基因轉(zhuǎn)染。 制備基因?qū)氩牧系姆椒榘ㄈ缦虏襟E(l)取分析純的氯化鈣、碳酸銨在乙 醇中超聲，然后依次用雙蒸水、洗液、雙蒸水、丙酮清洗，最后在空氣中晾干；(2)用去離子 水溶解氯化f丐制備0. 01M新制的氯化f丐溶液；(3)在80mL0. 01M氯化f丐溶液中加入80mg植 酸，攪拌混勻后將其分裝在4個燒杯中，所述每個燒杯中裝有0. 25mL植酸，起始濃度為lg/ L，起始ra二 3.0 ;(4)將所述燒杯用parafilm封口，并在parafilm上對稱地扎三個針眼。 放置于干燥器上層，干燥器下層擺放3個對稱放置的10mL小燒杯，每個小燒杯中裝滿研磨 細(xì)的碳酸銨粉末，小燒杯也以parafilm封口，并在parafilm上對稱地扎三個針眼；(5)蓋 上干燥器蓋進(jìn)行擴(kuò)散法反應(yīng)；(6) 6小時后取出樣品，在8000r/m速度離心，之后用雙蒸水洗 至ra = 7，再用乙醇洗，然后在室溫下晾干。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的基因?qū)氩牧暇哂幸韵聝?yōu)點(diǎn)(l)具有較高的轉(zhuǎn)染效 率，在人血管平滑肌細(xì)胞中可以達(dá)到40%左右；(2)低毒性，因碳酸鈣、磷酸鈣都具有良好 的生物相容性，細(xì)胞生存率很高；(3)材料分散性良好，符合對轉(zhuǎn)染的要求；(4)非常低的成 本，植酸是食品添加劑，成本很低，另外實驗中使用的化學(xué)藥品，氯化鈣和氨水都是常見廉 價試劑；(5)材料制備反應(yīng)簡單易操作，可重復(fù)性好。


圖1為本發(fā)明基因?qū)氩牧系膾呙桦婄R圖片；
圖2為基因?qū)氩牧系耐渡潆婄R圖片； 圖3為轉(zhuǎn)染后的倒置熒光顯微鏡下的熒光圖片； 圖4為轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生存率圖片； 圖5為轉(zhuǎn)染效率圖； 圖6為轉(zhuǎn)染試驗圖。 圖7為綠色瑩光蛋白(GFP)基因表之圖。
具體實施例方式
—、本發(fā)明基因?qū)氩牧?ACC，經(jīng)過植酸鈣修飾后功能化的納米無定形碳酸鈣) 的制備 1、原料準(zhǔn)備 分析純的氯化f丐、碳酸銨、植酸(分子量，麗660)，前述原料均是Aldrich公司產(chǎn) 品。所有的原料制備用玻璃器皿，均在乙醇中超聲5分鐘，然后雙蒸水清洗，并用洗液1120/ HN03(65% )/H202 (35% ) (1 : 1 : 1，v/v/v)清洗，之后再用雙蒸水、丙酮依次清洗，最后在 空氣中晾干。 2、基因?qū)氩牧现苽浞椒?用去離子水溶解氯化*丐制備0. 01M新制的氯化^溶液，首先，在80mL0. OIM氯化牽丐 溶液中加入80mg植酸，攪拌混勻后，將其分裝在4個25mL的燒杯中，每個燒杯中20mL，起始 植酸濃度為lg/L，起始PH = 3. 0。 25mL燒杯用paraf ilm封口 ，并在paraf ilm上對稱地扎 三個針眼。放置于干燥器上層，干燥器下層擺放3個對稱放置的10mL小燒杯，每個燒杯中 裝滿研磨細(xì)的碳酸銨粉末，燒杯以parafilm封口，并在parafilm上對稱地扎三個針眼。蓋 上干燥器蓋進(jìn)行擴(kuò)散法反應(yīng)。6小時后取出樣品，在8000r/m速度離心，之后用雙蒸水洗至 ra = 7，乙醇洗，最終樣品在室溫下晾干。請參閱圖1和圖2，分別為ACC的掃描電鏡SEM和 透射電鏡TEM圖。
二、結(jié)合性能的測定
1、主要材料 綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-Cl) ;HEPES平衡鹽溶液(自配)；電泳緩沖液 (0. 5XTBE，自配);DNA上樣緩沖液；溴化乙啶(EB)。
2、主要方法 1 ii LACC溶液(5mgACC溶解在500 y L雙蒸水中)與1 y LpEGFP-Cl水溶液 (0. 1 ii g/ ii L)以及8 iil雙蒸水(pH = 7. 4water)在1. 5mL離心管中混合，置于室溫下30
分鐘讓其充分結(jié)合。Acc和pEGFP-ci的質(zhì)量比分別用ioo : 1，50 : 1，30 : i，io : i，
1:1。在5000rpm的速度下離心5min。將沉淀物加載到1 %的瓊脂糖(EBO. 1 y g/mL)在 TAE的緩沖下，在100V電壓下跑40min，然后在320nm處觀察條帶。
3、結(jié)果 結(jié)果觀察，有多種條帶出現(xiàn)，這是因為pEGFP-Cl有多種構(gòu)型所致。在質(zhì)量比
30 : i，io : i，i : i處條帶清晰明顯，說明在這些質(zhì)量比之下，DNA和納米顆粒結(jié)合不是 很好，到了ioo : 1，50 : i條帶消失，說明結(jié)合完全了。 這些結(jié)果表明帶正電荷的pEGFP-Cl和ACC有一個最佳的結(jié)合比，超出50 : l以后過多的納米顆粒顯得不再重要，所以使用50 : i進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 三、轉(zhuǎn)染
1、主要材料 人血管平滑肌細(xì)胞(HUSMC) ;ACC@pEGFP-Cl聯(lián)合體(上述制備)；DMEM培養(yǎng)基；胎
牛血清FBS;6孔培養(yǎng)板。 2、主要方法 (1)細(xì)胞的培養(yǎng)將HUSMC用胰蛋白酶-EDTA消化下來，計數(shù)后加入到6孔板中 (5 X 106/孔)，用含F(xiàn)BS10 %的DMEM溶液并加轉(zhuǎn)染優(yōu)化試劑培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60 % 70 % 的融合度。 (2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗將培養(yǎng)好的細(xì)胞上清除去，換新的培養(yǎng)液并加入質(zhì)量比50 : 1 的ACC@pEGFP-Cl聯(lián)合體，培養(yǎng)48小時后分別對其熒光、細(xì)胞存活率(碘化吡啶標(biāo)識，流式 細(xì)胞儀檢測)、轉(zhuǎn)染效率(流式細(xì)胞儀檢測)進(jìn)行測定。
3、結(jié)果分析 請參閱圖3，熒光圖可以看出有明顯綠色熒光，并且覆蓋面比較大；請參閱圖4，分 別為無添加物、ACC@pEGFP-Cl聯(lián)合體、lipofectamine 2000@ pEGFP-Cl聯(lián)合體的生存率， 可以看到ACC@pEGFP-Cl聯(lián)合體對細(xì)胞生存率的影響是很小的。比lipofectamine 2000@ pEGFP-Cl聯(lián)合體的影響小很多。請參閱圖5，可以看到ACC@pEGFP-Cl聯(lián)合體可以達(dá)到約 40%的轉(zhuǎn)染效率，這是在保證了細(xì)胞生存率的前提下達(dá)到了一個如此的轉(zhuǎn)染效率。雖然不 及l(fā)ipofectamine 2000高，但是其高細(xì)胞相容性是lipofectamine 2000所無法比擬的，表 現(xiàn)出了 ACC做為轉(zhuǎn)染試劑的巨大潛力；請參閱圖6，在轉(zhuǎn)染試驗中，碳酸鈣顆粒與DNA結(jié)合
并將其轉(zhuǎn)入到人主動脈平滑肌細(xì)胞中，通過熒光顯微鏡，在細(xì)胞內(nèi)觀察到綠色熒光。 綜上，由碳酸鈣等生物相容性好且低毒的材料組成的復(fù)合材料，表現(xiàn)出良好的細(xì)
胞相容性，穩(wěn)定且較高的轉(zhuǎn)染效率，其原理為植酸和鈣離子配位，然后碳酸根和鈣離子反 應(yīng)，自組裝形成無定形碳酸鈣和植酸鈣的復(fù)合物。由于其表面鈣離子的正電性，使其具備成 為轉(zhuǎn)染材料的潛力。植酸可以控制生成的無定形碳酸鈣為球形的形貌，通過反應(yīng)時間的控 制可以控制顆粒的平均粒徑在200nm左右，符合轉(zhuǎn)染要求。
權(quán)利要求
一種基因?qū)氩牧?，其特征在于，它為碳酸鈣和植酸鈣組成的復(fù)合材料，平均粒徑為200納米左右，其中碳酸鈣含量為80％，植酸鈣含量為20％。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的基因?qū)氩牧希涮卣髟谟?，它和綠色熒光蛋白質(zhì)?；?pGFP以非共價方式結(jié)合形成基因?qū)胂到y(tǒng)，用于基因轉(zhuǎn)染。
3. —種基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟?，它包括如下步驟(1) 取分析純的氯化鈣、碳酸銨在乙醇中超聲，然后依次用雙蒸水、洗液、雙蒸水、丙酮 清洗，最后在空氣中晾干；(2) 用去離子水溶解氯化鈣制備0. 01M新制的氯化鈣溶液；(3) 在80mL0. 01M氯化f丐溶液中加入80mg植酸，攪拌混勻后將其分裝在4個燒杯中，所 述每個燒杯中裝有0. 25mL植酸，起始濃度為lg/L，起始ffl = 3. 0 ;(4) 將所述燒杯用parafilm封口，并在parafilm上對稱地扎三個針眼。放置于干燥器 上層，干燥器下層擺放3個對稱放置的10mL小燒杯，每個小燒杯中裝滿研磨細(xì)的碳酸銨粉 末，小燒杯也以parafilm封口 ，并在parafilm上對稱地扎三個針眼；(5) 蓋上干燥器蓋進(jìn)行擴(kuò)散法反應(yīng)；(6) 6小時后取出樣品，在8000r/m速度離心，之后用雙蒸水洗至ffl = 7，再用乙醇洗，然后在室溫下晾干。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因?qū)氩牧?，它為碳酸鈣和植酸鈣組成的復(fù)合材料，平均粒徑為200納米左右，其中碳酸鈣含量為80％，植酸鈣含量為20％。本發(fā)明還公開了一種基因?qū)氩牧系闹苽浞椒?。本發(fā)明的基因?qū)氩牧暇哂休^高的轉(zhuǎn)染效率，在人血管平滑肌細(xì)胞中可以達(dá)到40％左右；低毒性，因碳酸鈣具有良好的生物相容性，細(xì)胞生存率很高；材料分散性良好，符合對轉(zhuǎn)染的要求；非常低的成本，植酸是食品添加劑，成本很低，另外實驗中使用的化學(xué)藥品，氯化鈣和氨水都是常見廉價試劑；材料制備反應(yīng)簡單易操作，可重復(fù)性好。
文檔編號C12N15/85GK101792772SQ20091019376
公開日2010年8月4日 申請日期2009年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月9日
發(fā)明者劉勇, 葉財盛, 周鴻雁, 常光其, 張德元, 徐安武, 王冕, 王深明, 胡作軍 申請人:王深明;徐安武;張德元