專利名稱：：蛋白質(zhì)酶的微水介質(zhì)固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于酶的固定化領(lǐng)域，涉及及蛋白質(zhì)酶的微水介質(zhì)固定化方法。種用于固定化蛋白質(zhì)酶的新方法，尤其是涉
背景技術(shù)：
：酶的固定化技術(shù)是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)進行其特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)利用的技術(shù)。至今，固定化酶已經(jīng)應(yīng)用到異相生物催化劑、專一性吸附齊U、控制釋放蛋白藥物、分析檢測儀、固相蛋白質(zhì)化以及能源開發(fā)等多個領(lǐng)域中。目前最常用的固定化方法主要有4種吸附法、共價交聯(lián)法、交聯(lián)法以及包埋法。這些方法都各有優(yōu)勢和不足。自20世紀(jì)50年代至今，酶的共價交聯(lián)是酶固定化技術(shù)的重要手段之一。酶的共價交聯(lián)固定化技術(shù)是指酶分子的非必需基團與載體表面的活性功能基團通過形成化學(xué)共價鍵實現(xiàn)不可逆結(jié)合的酶固定方法，該方法固定的酶與載體連接牢固，不易發(fā)生脫落，有良好的穩(wěn)定性及可操作性，且使用壽命長，尤其在生物反應(yīng)器的制備中發(fā)揮著重要的作用。但該法反應(yīng)劇烈，易引起酶構(gòu)象的發(fā)生不可逆變化，嚴(yán)重影響了固定化酶的活力。目前，提高固定化酶的酶活回收率，穩(wěn)定性和使用性方面的方法大致有幾種合適載體的選擇，固定化條件的優(yōu)化，以及各種抑制劑的添加(Improvementofenzymeactivity,stabilityandselectivityviaimmobilizationtechniques.EnzymeMicroTechnol，2007，N0.6)。這些方法都對固定化酶的效果起到了重要的作用。這些技術(shù)基本上都是基于水相的條件下(即水介質(zhì)條件下)進行的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有共價固定化技術(shù)的不足，從固定化所用介質(zhì)出發(fā)，提供一種新的蛋白質(zhì)酶的固定化方法，即微水介質(zhì)固定化方法，該方法能夠更好地保存酶活力，提高固定化酶的穩(wěn)定性，比傳統(tǒng)的水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化酶具有更大的優(yōu)勢。本發(fā)明所述的一種蛋白質(zhì)酶的微水介質(zhì)固定化方法，包括以下步驟A.蛋白質(zhì)酶的預(yù)處理將擬固定化的蛋白質(zhì)酶置于具備該蛋白質(zhì)酶酶活力的最適緩沖液條件的緩沖液中，凍干備用；B.固定化載體的活化；C.微水有機介質(zhì)的制備；D.將步驟A得到的蛋白質(zhì)酶置于步驟C所制備的微水有機介質(zhì)中，與步驟B已活化的載體進行共價交聯(lián)固定化，去除微水有機介質(zhì)后，即得到微水介質(zhì)固定化酶。根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)酶的微水介質(zhì)固定化方法的進一步特征，所述的步驟B中，是用交聯(lián)劑對載體進行活化。根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)酶的微水介質(zhì)固定化方法的進一步特征，所述的步驟C中，所采用的有機介質(zhì)為非水溶性并能使所述的微水蛋白質(zhì)酶在該溶劑內(nèi)仍可保持其活性的有機溶劑；將該有機溶劑制成含水量為0.4%1.2%的微水有機溶劑，即為固定化酶所使用的微水有機介質(zhì)。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)酶的微水介質(zhì)固定化方法，主要是利用有一定含水量的微水有機溶劑把經(jīng)預(yù)處理的微水蛋白質(zhì)酶共價交聯(lián)到載體上。因此，本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)酶的微水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化方法能夠減少蛋白質(zhì)酶在與載體進行共價交聯(lián)時因構(gòu)象變化而導(dǎo)致的活力的下降，并提高固定化酶的穩(wěn)定性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(l)本發(fā)明所述的微水介質(zhì)固定化方法比傳統(tǒng)的水相固定化方法能夠更好地保存固定化酶的活力；(2)利用本發(fā)明所述固定化方法得到的固定化酶與傳統(tǒng)水介質(zhì)中得到的固定化酶相比，前者具有更高的穩(wěn)定性；(3)本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)酶的微水介質(zhì)固定化方法，操作簡單方便，便于應(yīng)用。本發(fā)明可應(yīng)用于控釋藥物的研制，生物傳感器的制備，功能多肽的固定化，生物芯片的制作，生物反應(yīng)器的制作，以及抗體的固定化等領(lǐng)域。圖1為微水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶與傳統(tǒng)水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶的最佳溫度的比較；圖中，_□-表示微水介質(zhì)固定化酶；--表示水介質(zhì)固定化酶。圖2為微水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶與傳統(tǒng)水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶的最佳pH的比較；圖中，-□_表示微水介質(zhì)固定化酶；__表示水介質(zhì)固定化酶。圖3為微水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶與傳統(tǒng)水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶的熱穩(wěn)定性的比較；圖中，_□-表示微水介質(zhì)固定化酶；_-表示水介質(zhì)固定化酶。圖4為微水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶與傳統(tǒng)水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶的pH穩(wěn)定性的比較；圖中，-□-表示微水介質(zhì)固定化酶；_-表示水介質(zhì)固定化酶。圖5為微水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶與傳統(tǒng)水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶的操作穩(wěn)定性的比較；圖中，_□_表示微水介質(zhì)固定化酶；__表示水介質(zhì)固定化酶。圖6為微水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶與傳統(tǒng)水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶的去除效果的比較；圖中，_□-表示微水介質(zhì)固定化酶；_-表示水介質(zhì)固定化酶。圖7為微水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶與傳統(tǒng)水介質(zhì)共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶修飾電極后對過氧化氫的循環(huán)伏安法(CV)掃描結(jié)果；圖中，a:水介質(zhì)中酶園定修飾電極在沒有&02存在下的(^掃描圖；b:微水介質(zhì)中酶固定修飾電極在沒有&02存在下的CV掃描圖；c:水介質(zhì)中酶固定修飾電極在3X10-4mol/LH202存在下的CV掃描圖；d:微水介質(zhì)中酶固定修飾電極在3X10-4mol/LH202存在下的CV掃描圖。具體實施例方式實施例一微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶的制備本實施例所述的微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶的制備，包括辣根過氧化物酶的預(yù)處理，固定化載體的活化，微水有機介質(zhì)的配制，將辣根過氧化物酶于微水有機介質(zhì)中與載體進行共價交聯(lián)固定化，去除有機介質(zhì)后，得到微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶。本實施例中，所采用的固定化交聯(lián)劑可選自戊二醛己二醛、順丁烯二酸酐、雙重氮聯(lián)苯胺等；所采用的固定化載體可選自殼聚糖微球、玻璃微球、陶瓷、海藻酸鈉等；所采用的有機溶劑可選自1，4-二氧六環(huán)、氯仿、正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯等。典型的具體方法如下(—)、材料的準(zhǔn)備(1)辣根過氧化物酶購于上海生工公司。(2)殼聚糖微球稱取2.5g脫乙酰度為8590%的殼聚糖粉末加入到99mL蒸餾水中，磁力攪拌10min，然后再加入lmL冰乙酸，室溫下攪拌混合3h，紗布過濾，收集濾液，制成濃度為2.5%的殼聚糖溶液，注入到含有10X的Na0H(W/V)和16.67%的95%乙醇(V/V)的凝結(jié)液中，形成2mm左右的殼聚糖微球，過濾收集殼聚糖珠，用蒸餾水洗滌至中性，制成殼聚糖微球。8590%的殼聚糖粉末購自浙江澳興生物科技有限公司。(3)25%戊二醛國藥集團化學(xué)試劑有限公司。(4)1，4_二氧六環(huán)天津市福晨化學(xué)試劑廠。(二)、辣根過氧化物酶的預(yù)處理將辣根過氧化物酶溶解于pH7.0、0.2mol/L磷酸鹽緩沖液中，制成0.lmg/mL的酶液。凍干，備用。(三)、共價交聯(lián)固定化辣根過氧化物酶所用戊二醛的配制本實施例配制了0.05%，0.1%，0.2%，0.3%等4個濃度的戊二醛，作為制備固定化辣根過氧化物酶所用的交聯(lián)劑。(四)、微水有機介質(zhì)的配制；本實施例配制了含水量分別為O.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%等5個1，4_二氧六環(huán)微水有機介質(zhì)，作為制備固定化辣根過氧化物酶的微水介質(zhì)。(五)、微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶的制備取含0.5mg預(yù)處理后的辣根過氧化物酶，置于10mL的1，4_二氧六環(huán)微水溶液(1，4-二氧六環(huán)H20，V/V=99:1)中，再加入lg已活化的干燥的殼聚糖微球，冰上振蕩lh，然后于4t:下靜置過夜，使酶與載體共價交聯(lián)結(jié)合。過濾，用吹風(fēng)筒冷風(fēng)將殘留的1，4-二氧六環(huán)除去，得到微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶。(六)、固定化辣根過氧化物酶活力測定沃辛通(Worthington)法測定辣根過氧化物酶活性。定義一個過氧化物酶單位相當(dāng)于在規(guī)定條件下，于25t:、pH7.0，每分鐘分解liimol過氧化氫所需的酶量。固定化酶酶活(U/g)為lg固定酶(濕重)所具有的酶活力。固定化酶酶活固定率(％)=固定化后固定酶的總活力/加入溶液酶的活力X100%(七)、固定化辣根過氧化物酶的蛋白結(jié)合率的測定使用Bradford法測定吸附上的蛋白的含量，由加入的總蛋白量與殘液中的蛋白總量的差值來決定。蛋白結(jié)合率=(加入蛋白總量-殘液中蛋白總量)X100%/加入蛋白總量本實施例中，用水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶做對比(除了固定化介質(zhì)以外，其他條件一致)，結(jié)果如表1所示，在幾乎固定上等量蛋白酶量的情況下，微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶顯示出更優(yōu)的活力回收率，酶活是水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶的6倍以上。表1微水介質(zhì)固定化酶與水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶效果的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例二微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶的性質(zhì)分析(—)、最佳溫度將兩種介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶于259(TC下測定酶活力，結(jié)果如圖1所示，微水介質(zhì)和水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶酶促反應(yīng)最適溫度均在60°C，但微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶更具高酶活。(二)、最佳pH將固定化酶于pH5.58.0下測定酶活力，結(jié)果如圖2所示兩種介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶在P朋.5處表現(xiàn)最大酶活力，但是微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶的酶活遠遠高于水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶。(三)、溫度穩(wěn)定性將兩種介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶分別分成若干份置于70°C中孵育，每隔30min取出于最適條件下測活，結(jié)果如圖3所示孵育30min后，水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶僅保留15.4%的酶活，比活力4.36U/g，而微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶可以保留75.42%的酶活，比活力為152.84U/g;孵育60min后，微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶殘留酶活為71.48%，而水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶活力幾乎完全喪失。這表明微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶具有更高的熱穩(wěn)定性。(四)、pH穩(wěn)定性在考察固定化辣根過氧化物酶的pH穩(wěn)定性時發(fā)現(xiàn)(見圖4):室溫下在各種pH值的緩沖液中放置24h后，微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶在pH7.0時酶活損失最少，在pH5.57.0之間穩(wěn)定，有較好的耐酸性，而水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶在pH7.08.0之間顯示一定的耐堿性，但殘留酶活明顯不如微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶。(五)、操作穩(wěn)定性把兩種介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶在6(TC下連續(xù)測定其活力來考察固定化酶的操作穩(wěn)定性，每次測定之后用去離子水洗滌固定化辣根過氧化物酶，吸干水分之后再進行下一次操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5):經(jīng)一次使用后，微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶損失了8.22%的酶活，比活力為194.39U/g，而水介質(zhì)中固定化辣根過氧化物酶活力損失34.26%，活力僅為17.98U/g;而操作到第5次時，微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶殘留酶活為77.69%，酶活力仍有164.5U/g，而水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶殘留活力僅存16.67%，比活僅有4.56U/g。該結(jié)果表明在1，4-二氧六環(huán)微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶比水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶具有更好的操作穩(wěn)定性。實施例三微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶去除苯酚的評價將實施例一中制備的微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶用于水溶液中苯酚的去除，評價其效果步驟如下反應(yīng)總體積為10mL，在三角瓶中先加入終濃度為2mmol/L的苯酚溶液和pH7.0，0.lmol/L磷酸鹽緩沖液置于三角瓶中振搖，溶液溫度達到3(TC時，加入終濃度為2mmol/L的H202溶液，使[苯酚/H202]的摩爾比為1，再加入lg的不同介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶，每隔5min取樣0.4mL，濾去凝聚物，稀釋至2.4mL，于比色杯中加入0.3mL83.4mmol/L鐵氰化鉀和0.3mL20.8mmol/L4-氨基安替比林，505nm下測定吸光度，對空白照用2.4mL的水代替樣品。苯酚去除率的計算[苯酚]%=(A_A0)*100%/A其中，A:每次取樣的樣品吸光值；A0:沒有加酶之前的樣品吸光值。在本實施例中，兩種介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶去除苯酚的結(jié)果如圖6所示在相同條件下反應(yīng)5min后，微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶對苯酚的去除率可達到63.86%，而水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶對苯酚的去除效率僅為34.16%;反應(yīng)15min以后，微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶對苯酚的去除效率已經(jīng)達到最高，為84.9%，而水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶在反應(yīng)20min后才達到最大值，去除率僅為72.51%。這表明了微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶在苯酚的去除中更具優(yōu)勢。實施例四微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶修飾電極檢測H202的效果評價本實施例在微水有機介質(zhì)中將辣根過氧化物酶固定到殼聚糖修飾的金電極上，具體方法如下將金電極(Au)依次用0.3mmol/L和0.05mmol/L的A1203粉拋光后，分別用無水乙醇和雙蒸水超聲3min后于紅外燈下烘干，備用。將2mg單壁碳納米管(SWCNTs)分散在5mL的0.5%的殼聚糖(CS)溶液中，超聲分散得到均勻的CS-SWCNTs混懸液，取5ulCS-SWCNTs混懸液滴于Au上自然晾干后得到CS-SWCNTs/Au修飾電極，滴加0.3%的戊二醛交聯(lián)后室溫晾干，然后按溶劑酶=10yL:0.05mg(V/W)比例分別于緩沖液條件下和1，4-二氧六環(huán)水99:1(v/v)微水介質(zhì)中進一步共價交聯(lián)辣根過氧化物酶，其中用于修飾電極的酶為預(yù)處理后的辣根過氧化物酶。上述溶液各取10iiL滴于CS-SWCNTs載體中，4°C固定過夜，分別制作得CS-WHRP(水介質(zhì)中固定的)-SWCNTs/Au酶修飾電極和CS-MAMHRP(微水有機介質(zhì)中固定的)-SWCNTs/Au酶修飾電極。采用CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，三電極系統(tǒng)Ag/AgCl(飽和KC1)電極為參比電極、Pt絲電極為對電極、修飾Au電極為工作電極，選擇循環(huán)伏安掃描模式，設(shè)置電化學(xué)參數(shù)如下工作電位范圍-600mv+800mv;掃描速率100mv/s;靜息時間2s;設(shè)置好參數(shù)后，分別用不同的修飾電極對8ml0.1M，pH7.0PBS的底液以及相同底液體系中加入不同濃度的過氧化氫進行循環(huán)伏安掃描檢測。測試效果如圖7所示，扣除背景電流(曲線a，b)后(空白對照不加11202)，CS-MAMHRP-SWCNTs/A電極對H202的還原峰電流(曲線d)響應(yīng)信號比CS-WHRP-SWCNTs/Au電極(曲線c)提高了2.5倍，表明這種微水介質(zhì)固定化酶制備的辣根過氧化物酶修飾電極有更好的檢測靈敏度。需要明確的是，上述各實施例中關(guān)于微水介質(zhì)固定化辣根過氧化物酶的闡述僅僅是一個示例性的說明，而不是對本發(fā)明的保護范圍的限制。通過上述描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠?qū)⒈景l(fā)明所述的蛋白質(zhì)酶的微水介質(zhì)固定化方法應(yīng)用于其他的更多的酶，而不僅限于辣根過氧化物酶。權(quán)利要求一種蛋白質(zhì)酶的微水介質(zhì)固定化方法，其特征在于，包括以下步驟A.蛋白質(zhì)酶的預(yù)處理將擬固定化的蛋白質(zhì)酶置于具備該蛋白質(zhì)酶酶活力的最適緩沖液條件的緩沖液中，凍干備用；B.固定化載體的活化；C.微水有機介質(zhì)的制備；D.將步驟A得到的蛋白質(zhì)酶置于步驟C所制備的微水有機介質(zhì)中，與步驟B已活化的載體進行共價交聯(lián)固定化，去除微水有機介質(zhì)后，即得到微水介質(zhì)固定化酶。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)酶的微水介質(zhì)固定化方法，其特征在于所述的步驟B中，是用交聯(lián)劑對載體進行活化。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)酶的微水介質(zhì)固定化方法，其特征在于所述的步驟C中，所采用的有機介質(zhì)為非水溶性并能使所述的微水蛋白質(zhì)酶在該溶劑內(nèi)仍可保持其活性的有機溶劑；將該有機溶劑制成含水量為0.4%1.2%的微水有機溶劑，即為固定化酶所使用的微水有機介質(zhì)。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于固定化蛋白質(zhì)酶的新方法。本發(fā)明所述的一種蛋白質(zhì)酶的微水介質(zhì)固定化方法，包括以下步驟A.蛋白質(zhì)酶的預(yù)處理將擬固定化的蛋白質(zhì)酶置于具備該蛋白質(zhì)酶酶活力的最適緩沖液條件的緩沖液中，凍干備用；B.固定化載體的活化；C.微水有機介質(zhì)的制備；D.將步驟A得到的蛋白質(zhì)酶置于步驟C所制備的微水有機介質(zhì)中，與步驟B已活化的載體進行共價交聯(lián)固定化，去除微水有機介質(zhì)后，即得到微水介質(zhì)固定化酶。通過本發(fā)明所述方法得到的固定化酶能夠更好地保存酶活力，提高酶的穩(wěn)定性，而且該方法操作簡單，便于應(yīng)用。本發(fā)明可應(yīng)用于控釋藥物、生物傳感器、功能多肽的固定化、生物芯片、生物反應(yīng)器以及抗體的固定化等領(lǐng)域。文檔編號C12N11/00GK101717766SQ20091019427公開日2010年6月2日申請日期2009年12月1日優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日發(fā)明者劉大嶺,姚冬生,蔡奕璇,謝春芳申請人:暨南大學(xué)