專利名稱：Φc31介導(dǎo)的基因重組和用于紅霉素產(chǎn)生菌的遺傳改造的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)工程領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及用于在紅色糖多孢菌細(xì)胞中表達(dá)目的基因的方法、組合物和系統(tǒng)。本發(fā)明也涉及通過這種方法用于紅霉素產(chǎn)生菌種的遺傳改造。

背景技術(shù)：
自從紅霉素作為一種廣譜抗生素藥物進(jìn)入臨床以來，以提高其產(chǎn)生菌種發(fā)酵單位為目的的常規(guī)遺傳育種和菌種選育工作一直未曾停止。近年來，基因工程技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)明顯地涉及了紅霉素生產(chǎn)菌種改良領(lǐng)域。利用這些技術(shù)，對紅霉素生產(chǎn)有益的基因可以引入菌種中，并且可以很快地獲得改良的菌種，從而避免了其傳統(tǒng)常規(guī)育種方法的漫長過程。但是在技術(shù)策略上，這些研究都是通過同源重組的方式把對紅霉素產(chǎn)量或者組份有影響的基因?qū)氲郊t霉素生產(chǎn)菌染色體內(nèi)。同源重組包含單交換和雙交換兩種方式。采用同源重組單交換獲得的菌種在連續(xù)傳代過程中，由于同源重組的可逆性容易使插入的目的基因丟失，從而導(dǎo)致基因工程菌的回復(fù)突變，而且通過同源重組插入目的基因使原有基因遭受破壞。而采用同源重組雙交換的方式進(jìn)行基因重組，操作過程繁瑣，而且對于插入的目的片斷包含有與宿主基因組同源的序列時，成功率極低。因此采用同源重組這一策略對紅霉素生產(chǎn)菌種進(jìn)行遺傳改造在實(shí)際應(yīng)用過程中受到了極大的限制。
人們發(fā)現(xiàn)來自鏈霉菌噬菌體ΦC31的整合酶，能夠有效介導(dǎo)噬菌體基因組中attP位點(diǎn)與細(xì)菌染色體上attB位點(diǎn)間的重組反應(yīng)，而且在介導(dǎo)整合時具有嚴(yán)格的位點(diǎn)特異性。該酶只催化attP/attB之間的重組從而形成雜合位點(diǎn)attL和attR，卻不介導(dǎo)attL/attR之間的剪切。因此與細(xì)菌自身催化發(fā)生的同源重組不同的是，經(jīng)該酶催化的重組是不可逆的，外源基因插入到細(xì)菌染色體的特異位點(diǎn)attB后能夠穩(wěn)定地傳代。
雖然ΦC31整合酶所識別的附著位點(diǎn)序列attB在一般鏈霉菌基因組中是一種常見的序列，但在紅霉素的生產(chǎn)菌種紅色糖多孢菌基因組中卻不存在這一特異序列。因此，基于ΦC31整合酶的基因重組體系無法直接應(yīng)用于紅霉素產(chǎn)生菌種紅色糖多孢菌的遺傳改造中。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便、快速、穩(wěn)定的基因重組的方法，具體涉及一種利用ΦC31位點(diǎn)特異性整合機(jī)制介導(dǎo)的整合子系統(tǒng)的方法，尤其涉及一種利用整合子系統(tǒng)將目的基因插入到紅色糖多孢菌染色體上特定位點(diǎn)的基因重組方法。
本發(fā)明的目的還在于提供了該重組系統(tǒng)在紅霉素產(chǎn)生菌遺傳改造上的應(yīng)用，用于在紅霉素發(fā)酵生產(chǎn)過程中雜質(zhì)組份的改善和產(chǎn)量的提高。
本方法采用ΦC31位點(diǎn)特異性整合機(jī)制介導(dǎo)的整合子系統(tǒng)作為工具，首先構(gòu)建染色體上含有細(xì)菌附著位點(diǎn)attB序列的宿主細(xì)胞，然后將目的基因克隆到含有整合酶和噬菌體附著位點(diǎn)attP的載體上。目的基因在宿主菌表達(dá)ΦC31整合酶的情況下，能夠定點(diǎn)地插入到宿主細(xì)胞染色體的attB位點(diǎn)中。
實(shí)踐證明，本方法簡便易行，只需常規(guī)簡單的基因克隆操作，就可以將目的基因插入到宿主菌染色體DNA上構(gòu)建的特定位點(diǎn)中。使用本發(fā)明所述的整合子系統(tǒng)還可以避免通過同源重組插入基因的可逆反應(yīng)，提高了基因重組的穩(wěn)定性和效率。
本發(fā)明提出的上述體系制備與應(yīng)用具體如下 1.制備染色體中含有細(xì)菌編碼附著位點(diǎn)attB序列的紅霉素工業(yè)生產(chǎn)菌。
首先在紅色糖多孢菌中采用PCR的方法擴(kuò)增出兩段在染色體位置相隔不遠(yuǎn)，大小相近的DNA片段。把這兩個片段按與染色體一致的方向連接到載體pKC1139中。然后在這兩個片段之間插入一段attB序列。然后采用屬間接合轉(zhuǎn)移的方法把這個質(zhì)粒轉(zhuǎn)移進(jìn)紅色糖多孢菌中，篩選出兩個片段之中任一同源片段發(fā)生單交換的陽性克隆。通過反復(fù)傳代的方法使單交換陽性克隆的阿普拉霉素抗性丟失，從而篩選出同源雙交換菌株，在這個同源雙交換菌株里，attB靶序列被穩(wěn)定地整合進(jìn)了紅霉素工業(yè)生產(chǎn)菌的染色體中。
2.在含有ΦC31整合酶及對應(yīng)attP位點(diǎn)的載體中插入對紅霉素合成有利的目的DNA片段 a.對于插入目的DNA片段較小(小于25kb)，采用質(zhì)粒pSET152及其類似質(zhì)粒為載體，其質(zhì)粒骨架上已經(jīng)包含有ΦC31整合酶及對應(yīng)attP序列，并含有屬間接合轉(zhuǎn)移元件oriT。通過限制性內(nèi)切酶酶切、T4連接酶連接等常用的分子生物學(xué)手段把目的DNA片段插入載體中。
b.對于插入目的DNA片段較大(大于25kb)，采用pOJ436及其類似質(zhì)粒為載體，其質(zhì)粒骨架上已經(jīng)包含有ΦC31整合酶及對應(yīng)attP序列，并含有屬間接合轉(zhuǎn)移元件oriT。通過篩選以pOJ436及類似質(zhì)粒為母體構(gòu)建文庫的方法得到含有目的DNA片段的黏粒。
3.將步驟2所得到的載體通過屬間接合轉(zhuǎn)移，導(dǎo)入由步驟1所構(gòu)建的菌株中。
4.篩選陽性克隆菌株。



圖1表示單交換同源重組事件。供體質(zhì)粒的B區(qū)域與受體細(xì)胞染色體上的B區(qū)域多核苷酸序列同源，兩者在受體細(xì)胞自身的同源重組酶系的催化下，同源區(qū)域發(fā)生交換，供體質(zhì)粒插入受體細(xì)胞染色體B區(qū)域。
圖2表示雙交換同源重組事件。供體質(zhì)粒在A區(qū)域和B區(qū)域分別與受體細(xì)胞染色體上的A區(qū)域和B區(qū)域多核苷酸序列同源，A區(qū)域首先在受體細(xì)胞自身的同源重組酶系的催化下，同源區(qū)域發(fā)生交換，供體質(zhì)粒插入受體細(xì)胞染色體A區(qū)域。隨后，受體細(xì)胞染色體兩段同源的B區(qū)域再次在同源重組酶系的催化下發(fā)生交換，質(zhì)粒骨架被刪除。
圖3表示制備染色體中含有細(xì)菌編碼附著位點(diǎn)attB靶序列的紅色糖多孢菌的流程。靶序列attB的導(dǎo)入是通過同源重組雙交換得以實(shí)現(xiàn)的。
圖4表示由ΦC31整合酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組事件。細(xì)菌附著位點(diǎn)attB在靶細(xì)胞的染色體上，噬菌體附著位點(diǎn)attP在供體質(zhì)粒上。向靶細(xì)胞和供體分子引入ΦC31整合酶，從而形成由ΦC31整合酶介導(dǎo)的重組產(chǎn)物attL、attR。
圖5表示一種示例性質(zhì)粒pSET152的結(jié)構(gòu)，其包含ΦC31整合酶基因序列、噬菌體附著位點(diǎn)attP序列。
圖6表示一種示例性質(zhì)粒pOJ436的結(jié)構(gòu)，其包含ΦC31整合酶基因序列、噬菌體附著位點(diǎn)attP序列及構(gòu)建柯斯黏粒文庫所必需的cos位點(diǎn)序列。
圖7表示細(xì)菌附著位點(diǎn)attB靶序列插入紅色糖多孢菌染色體所需要的同源雙交換整合質(zhì)粒pKC-nrps-attB構(gòu)建流程圖。
圖8表示對出發(fā)菌株S.erythraea HL3168 E3和重組菌發(fā)酵液進(jìn)行HPLC分析 圖9(1)、(2)、(3)表示LC-MS檢測紅霉素A、B、C組分。
圖10出發(fā)菌株S.erythraea HL3168E3和重組菌紅霉素產(chǎn)量的分析。
符號說明 附圖1中，target gene目的基因chromosome染色體；tsr表示硫鏈絲菌素抗性基因。
附圖2中，chromosome染色體neo表示新霉素抗性基因；tsr表示硫鏈絲菌素抗性基因；bla表示氨芐青霉素抗性基因。
附圖3中，PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
附圖7中，EcoRI，BamHI，HindIII，BglII為限制性核酸內(nèi)切酶；pKC1139為鏈霉菌溫敏型穿梭質(zhì)粒；left arm PCR product左臂PCR產(chǎn)物；right arm PCR product右臂PCR產(chǎn)物；8attB sequence八個attB序列。
附圖8所示的發(fā)酵液HPLC測定結(jié)果，其中I為紅霉素A(Er-A)、B(Er-B)、C(Er-C)標(biāo)準(zhǔn)品；II為S.erythraea HL3168 E3；III為整合了羥基化酶EryK基因和碳霉糖甲基化酶EryG基因的菌株S.erythraea E3-KGK。
附圖9所示發(fā)酵液LC-MS結(jié)果，其中(1)為紅霉素A，分子量734.35；(2)為紅霉素B，分子量718.41；(3)為紅霉素C，分子量720.42。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用，但不能限制本方面的內(nèi)容。
實(shí)施例1構(gòu)建在染色體中含有細(xì)菌附著位點(diǎn)attB靶序列的紅色糖多孢菌 按照文獻(xiàn)(《鏈霉菌遺傳學(xué)操作手冊》Norwich，EnglandThe John Innes Foundation；2000)所述的方法，通過同源重組雙交換構(gòu)把含有細(xì)菌附著位點(diǎn)attB序列的多核苷酸插入紅色糖多孢菌染色體中。在本實(shí)施例中，我們選擇把a(bǔ)ttB序列插入在紅色糖多孢菌染色體一段功能缺失的NRPS基因簇中。為了增加ΦC31整合酶介導(dǎo)的整合效率以及在發(fā)生第一次位點(diǎn)特異性重組的基礎(chǔ)上進(jìn)行第二次或者多次重組，我們選擇了含有8個拷貝的attB序列作為插入片段整合入紅色糖多孢菌染色體中。此片段的插入不會對紅色糖多孢菌的生長及紅霉素的合成產(chǎn)生任何不利的影響。具體構(gòu)建步驟如下 1.同源雙交換整合質(zhì)粒的構(gòu)建 (1)以紅色糖多孢菌(S.erythraea HL3168E3)基因組DNA為模板，以PCR方法擴(kuò)增基因組上一段功能缺失的NRPS基因簇上的兩段序列作為同源重組雙交換的左、右兩臂。
擴(kuò)增左臂所用的引物為 上游5’-AAAGAATTCCGGAACCTGCTGGCCGACCA-3’(SEQ ID NO5) 下游5’-TTTGGATCCGAGAAGTCGAAGGCGTAGGA-3’(SEQ ID NO6) 擴(kuò)增右臂所用的引物為 上游5’-TTTGGATCCCTGGAGCTGGACCGCGAGCA-3’(SEQ ID NO7) 下游5’-AAAAAGCTTGGATCACCCTCCGCACCGAG-3’(SEQ ID NO8) (2)合成具有8個拷貝的attB靶序列片段(SEQ ID NO9)，把左同源臂、8個拷貝的attB靶序列片段、右同源臂連接入鏈霉菌溫敏型質(zhì)粒pKC1139，得重組質(zhì)粒pKC-nrps-attB。質(zhì)粒構(gòu)建流程圖如圖7所示。
2.質(zhì)粒pKC-nrps-attB從大腸桿菌向紅色糖多孢菌的屬間接合轉(zhuǎn)移 培養(yǎng)含有適當(dāng)質(zhì)粒的E.coli ET12567(pUZ8002)至OD600＝0.5-0.6，25mL培養(yǎng)液中的細(xì)菌細(xì)胞離心收集，用等體積的LB洗兩次，重懸于2mL LB中，作為大腸桿菌供體細(xì)胞。取適量凍存于-80℃的S.erythraea HL3168E3的20％甘油孢子懸液500μL，用等體積的TES buffer洗兩次，重懸于等體積的TES buffer，50℃熱激10min使孢子萌發(fā)。再加等體積的TSB，37℃溫育2-5hr。離心重懸于0.5-1mL LB中作為鏈霉菌受體細(xì)胞。將不同濃度的受體細(xì)胞100μL與等體積的供體細(xì)胞混合直接涂布在含有10mMMgCl2的MS平板上，30℃培養(yǎng)20hr后，采用無菌水輕輕洗滌平板表面以洗去大部分大腸桿菌，在每一平板的表面覆蓋含萘啶酮酸(終濃度為50ng/μL)和相應(yīng)抗生素的1mL無菌水。30℃培養(yǎng)5天以上挑取接合子。
3.雙交換突變菌株的篩選 將獲得的阿普拉抗性(AmR)的接合子轉(zhuǎn)移至37℃阿普拉抗性MS平板培養(yǎng)，挑單菌落經(jīng)非抗性TSB液體培養(yǎng)基松弛培養(yǎng)后，涂布非抗性MS平板，培養(yǎng)7天后影印至含阿普拉抗性平板，篩選表型為阿普拉霉素敏感的菌株，這些菌株則可能為雙交換插入8個拷貝數(shù)attB序列的突變株。
4.雙交換突變株的基因型驗(yàn)證 在雙交換重組位點(diǎn)的外圍設(shè)計(jì)一對引物，引物序列如下 上游5’-TCGCCGCCGCACTACTGAA-3’(SEQ ID NO10) 下游5’-GCACCAGGCTGTTGACGAAGAA-3’(SEQ ID NO11) 提取表型為阿普拉霉素敏感菌株的基因組DNA為模板，以此引物PCR擴(kuò)增目的片段。目的片段采用引物5’-CGCCCGCCACGTACATCTCA-3’(SEQ ID NO12)進(jìn)行測序驗(yàn)證，篩選測序結(jié)果中含有8個拷貝attB序列的陽性片段。最終驗(yàn)證得一菌株其基因組一段功能缺失的NRPS基因簇中插入了8個拷貝的attB序列，菌株命名為S.erythraea E3-attB。
實(shí)施例2把紅霉素生物合成過程中大環(huán)骨架上碳12位羥基化酶EryK基因和碳霉糖甲基化酶EryG基因定向整合到紅色糖多孢菌(S.erythraea E3-attB)attB靶序 列中 本實(shí)施例是在本發(fā)明人已經(jīng)申請發(fā)明名稱為‘一種優(yōu)化紅霉素發(fā)酵組分的菌種、構(gòu)建方法和用途’的中國專利的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行改造，構(gòu)建可以穩(wěn)定強(qiáng)化表達(dá)紅霉素生物合成過程中大環(huán)骨架上碳12位羥基化酶EryK和碳霉糖甲基化酶EryG的紅霉素生產(chǎn)菌株，從而改善紅霉素雜質(zhì)組份和產(chǎn)量。
質(zhì)粒構(gòu)建 為構(gòu)建基于ΦC31整合酶介導(dǎo)的基因插入整合質(zhì)粒，選擇含有ΦC31整合酶基因及噬菌體附著位點(diǎn)attP序列的質(zhì)粒pSET152(圖5)作為質(zhì)粒母體。用EcoRI/SpeI消化含有ermE*-eryK-eryG-eryK結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒pCY4-16-8(見中國專利申請一種優(yōu)化紅霉素發(fā)酵組分的菌種、構(gòu)建方法和用途)，回收4.6kb目的片段，與EcoRI/XbaI消化的pSET152連接，得到質(zhì)粒pSET-eryKGK。
參照實(shí)施例1方法從大腸桿菌向紅色糖多孢菌(S.erythraea E3-attB)進(jìn)行屬間接合轉(zhuǎn)移。篩選含有阿普拉抗性的接合子。提取接合子染色體DNA，采用PCR驗(yàn)證。PCR驗(yàn)證引物為 上游5’-GACGCTGTTCCACTCCTACGCC-3’(SEQ ID NO13) 下游5’-CGCCCGCCACGTACATCTCA-3’(SEQ ID NO12) 對照采用紅色糖多孢菌(S.erythraea E3-attB)基因組DNA為模板，能擴(kuò)增出500bp條帶，而以接合子總DNA為模板能擴(kuò)出約10kb的目的條帶，把目的條帶進(jìn)行DNA測序進(jìn)一步證明重組質(zhì)粒pSET-eryKGK分別正確插入染色體細(xì)菌附著位點(diǎn)attB中。插入重組質(zhì)粒pSET-eryKGK的菌株分別命名為S.erythraea E3-KGK。
將重組菌株和對照菌株接種到搖瓶發(fā)酵，通過HPLC和LC-MS對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定量和組分分析，搖瓶發(fā)酵條件如下 紅霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株HL3168E3和它的重組菌株在斜面培養(yǎng)基[/L10g玉米淀粉，10ml玉米漿，3g氯化鈉，3g硫酸銨，5g碳酸鈣，pH7.0，2g瓊脂粉]34℃培養(yǎng)7天生長孢子，作為液體發(fā)酵的種子。
液體發(fā)酵時，從斜面培養(yǎng)基上取1cm2大小方塊接入50ml發(fā)酵種子培養(yǎng)基[/L50g玉米淀粉，18g黃豆餅粉，13ml玉米漿，3g氯化鈉，1.2g硫酸銨，1.2g硝酸銨，5ml豆油，6g碳酸鈣，pH6.8～7.0]，在34℃，250rpm培養(yǎng)2天。然后將5ml的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到50ml發(fā)酵培養(yǎng)基[/L40g玉米淀粉，30g黃豆餅粉，30g糊精，2g硫酸銨，10ml豆油，6g碳酸鈣，pH自然]，在34℃，250rpm培養(yǎng)6天。接種24小時后補(bǔ)加0.5ml的正丙醇。
紅霉素發(fā)酵液產(chǎn)物抽提和組份分析 在100ml燒杯中，準(zhǔn)確量取適量發(fā)酵液以NaOH調(diào)pH至8.9。若樣品冰凍，應(yīng)融化后混合均勻定量轉(zhuǎn)移至250ml容量瓶中，以水定容，混合均勻，8000～9000離心10min。
取25ml上述溶液于125ml分液漏斗中，加25ml正己烷，震蕩5min，收集水相(下層)于離心管中，用水洗滌己烷層2次后，水相與離心管水相混合，加入10ml氯仿，激烈震蕩5min，2500離心5min，依樣品情況，可能會在界面形成乳狀液，可用玻棒分散或再次離心，棄水相，將氯仿(下層)移至10ml的小瓶中，濃縮。
組份分析采用HPLC和LC-MS對紅霉素組分進(jìn)行的定性和定量鑒定 HPLC條件 色譜柱Luna 5u CN 100R(250×4.6mm，phenomenex) 流動相55％A(32mM K2HPO4)45％B(CH3CN∶CH3OH 80/20) 檢測條件流速1mL/min，UV檢測波長215nm，分析時間為25分鐘。
LC-MS條件 色譜柱Eclipse Plus C18(150×4.6mm，Agilent USA) 流動相A 5mM乙酸銨(0.05％甲酸)B乙腈∶甲醇 80∶20(0.05％甲酸) 0min 85％A15％B 3min 85％A15％B 6min 60％A40％B 12min 60％A 40％B 19min 45％A 55％B 25min 15％A 85％B 檢測條件流速1mL/min，UV檢測波長215nm，在LC-MS上分析時間為25分鐘。
分析測定發(fā)酵液中紅霉素A、B、C三種物質(zhì)的組分，如圖9所示，菌株S.erythraea E3-KGK發(fā)酵液中紅霉素A的產(chǎn)量與對照S.erythraea E3相比較，提高了20％左右，而且S.erythraea E3-KGK重組菌雜質(zhì)組份紅霉素B及紅霉素C和對照菌株相比也顯著降低。
本發(fā)明所涉及的序列
SEQ ID NO1 ggtgccaggg cgtgcccttg ggctccccgg gcgcg 35
SEQ ID NO2 ccccaactgg ggtaaccttt gagttctctc agttggggg 39
SEQ ID NO3 ggtgccaggg cgtgcccttg agttctctca gttggggg 38
SEQ ID NO4 ccccaactgg ggtaaccttt gggctccccg ggcgcg 36
SEQ ID NO5 aaagaattcc ggaacctgct ggccgacca 29
SEQ ID NO6 tttggatccg agaagtcgaa ggcgtagga 29
SEQ ID NO7 tttggatccc tggagctgga ccgcgagca 29
SEQ ID NO8 aaaaagcttg gatcaccctc cgcaccgag 29
SEQ ID NO9
tcgagatctc gggtgccagg gcgtgccctt gggctccccg ggcgcgtaac tagtggatct 60
cgggtgceag ggcgtgccct tgggctcccc gggcgcgtaa ctagtggate tcgggtgcca 120
gggcgtgccc ttgggctccc cgggcgcgta actagtggat ctcgggtgcc agggcgtgcc 180
cttgggctcc ccgggcgcgt aactagtgga tctcgggtgc cagggcgtgc ccttgggctc 240
cccgggcgcg taactagtgg atctcgggtg ccagggcgtg cccttgggct ccccgggcgc 300
gtaactagtg gatctcgggt gccagggcgt gcccttgggc tccccgggcg cgtaactagt 360
ggatctcggg tgccagggcg tgcccttggg ctccccgggc gcgtaactag tggatccctg 420
g
SEQ ID NO10 tcgccgccgc actactgaa 19
SEQ ID NO11 gcaccaggct gttgacgaag aa 22
SEQ ID NO12 cgcccgccac gtacatctca 20
SEQ ID NO13 gtaggatcca gcggtgttag accagcaaac ca3權(quán)利要求
1.一種在紅霉素產(chǎn)生菌中獲得位點(diǎn)特異性DNA重組的方法，該方法包括
向紅色糖多孢菌中染色體中引入包含ФC31整合酶所識別的細(xì)菌附著位點(diǎn)靶序列attB；
向含有靶序列attB的細(xì)胞中引入ФC31整合酶基因序列、ФC31整合酶所識別的噬菌體附著位點(diǎn)靶序列attP，以及目的基因序列的復(fù)合體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)菌附著位點(diǎn)靶序列attB含有一個或多個的attB核心核苷酸序列拷貝，attB核心核苷酸序列為SEQ ID NO1。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述所述的噬菌體附著位點(diǎn)靶序列attP的核心核苷酸序列為SEQ ID NO2。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，前特征在于，所述的細(xì)菌附著位點(diǎn)靶序列attB和噬菌體附著位點(diǎn)靶序列attP，兩者在ФC31整合酶介導(dǎo)下發(fā)生重組，形成雜合位點(diǎn)attL和attR，其核心核苷酸序列分別為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的復(fù)合體為一種質(zhì)?；蝠ち＃@種質(zhì)?；蝠ち＿€含有抗性選擇標(biāo)記以及進(jìn)行屬間接合轉(zhuǎn)移所必需的元件oriT。
6.如權(quán)利5所述的方法，其特征在于，所述的質(zhì)?；蝠ち?，其所包含的目的基因片段為但不僅限于紅霉素生物合成基因簇的全部或者一部分。
7.一種如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組質(zhì)?；蝠ちＳ糜诩t霉素生產(chǎn)菌種的遺傳改造，具體步驟如下(1)把對紅霉素生產(chǎn)有影響的目的DNA片段克隆至如權(quán)利要求4所述的載體中，這種載體通常為pSET152或pOJ436及其類似的載體；(2)把步驟1所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ET12567，和權(quán)利要求1所述的染色體中含有attB序列的細(xì)胞進(jìn)行屬間接合轉(zhuǎn)移，所述質(zhì)粒或黏粒將在ФC31整合酶的作用下通過位點(diǎn)特異重組定向插入至宿主細(xì)胞染色體中；(3)通過載體所含有的抗性基因進(jìn)行篩選接合子，把篩選出來的接合子進(jìn)行基因型驗(yàn)證，并進(jìn)一步發(fā)酵，考查其生產(chǎn)紅霉素的能力。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于ΦC31介導(dǎo)的基因重組和用于紅霉素產(chǎn)生菌的遺傳改造。利用ΦC31位點(diǎn)特異性整合機(jī)制介導(dǎo)的基因重組的方法，使目的基因能夠穩(wěn)定地整合入宿主細(xì)胞基因組預(yù)先構(gòu)建的位點(diǎn)上。本發(fā)明還涉及該方法在紅霉素產(chǎn)生菌遺傳改造上的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/80GK101649326SQ200910194419
公開日2010年2月17日 申請日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者文 劉, 張嗣良, 吳杰群, 張慶林, 瑋 鄧 申請人:中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 華東理工大學(xué)