專利名稱：青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-c-甲基-d-赤蘚醇激酶編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的編碼序列，具體是一種青蒿4-(5' -二 磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列。
背景技術(shù)：
青蒿"/^e啦'da a/ /7朋L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素是從 其地上部分分離出的一種含有過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物，是目前世界上公 認的最有效的治療瘧疾藥物，特別是對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前， 世界衛(wèi)生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯(lián)合療法(ACTs)。另 外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物還具有抗 炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)的功能，可見青蒿素是一種極具潛力的天然 藥物。
目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的 含量非常低，為0. 01%~1%，低含量使得青蒿素的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制。 由于青蒿素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成難度大、產(chǎn)量低、成本高，因此人工生產(chǎn)缺乏可 行性。也有人嘗試用組織培養(yǎng)和細胞工程的方法來生產(chǎn)青蒿素，然而青蒿素在愈 傷組織中的含量低于干重的0.1%，在芽中含量最高也只有干重的0. 16%,大多 數(shù)研究沒有檢測到青蒿素。因此，利用組織培養(yǎng)及細胞工程來生產(chǎn)青蒿素的也不 具備可行性。Dahua Chen等在《Plant Science》(植物科學(xué))2000年155 期179-185頁發(fā)表了題為"Expression of a chimeric farnesyl diphosphate synthase gene in Artemisia annua L transgenic plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation"(通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在青蒿植株中 表達法尼基焦磷酸合酶基因)的論文，文中評述，通過過量表達法尼基焦磷酸合 酶(farnesyl diphosphate synthase ，F(xiàn)PS)可在原有基礎(chǔ)上提高青蒿素含量2 倍-3倍，達到1%左右。
隨著近年來植物基因組學(xué)的發(fā)展，青蒿素合成途徑的基因分離、克隆和功能性研究已經(jīng)取得了突破性的進展。人們已經(jīng)初步完成了對參與青蒿素合成途徑關(guān) 鍵基因的分離和功能驗證工作，并分析了青蒿素合成途徑概貌。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，尚未見與青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(:-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列有關(guān)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種青蒿4-(5' -二磷酸胞 苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列。本發(fā)明可提高青蒿中青蒿素的含量以及 其他植物的異戊二烯類化合物含量，可以使含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(:-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的轉(zhuǎn)基因植物成為生物反應(yīng)器，實現(xiàn)青蒿素的大規(guī) 模生產(chǎn)和其他異戊二烯類化合物的生產(chǎn)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，
本發(fā)明涉及一種青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序 列，該序列如SEQ ID NO: 3中第15 1214位所示或者是SEQ ID NO: 3序列中 第15~1214位所示的核苷酸中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼 子取代后產(chǎn)生的序列。
所述青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列如SEQ ID NO: 3中第15 1214位所示。
本發(fā)明還涉及一種多肽，序列如SEQ ID NO: 4所示。
本發(fā)明還涉及一種利用所述青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇 激酶編碼序列提高植物青蒿素含量的方法，包括如下步驟
步驟一，將青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列連 于植物表達調(diào)控序列上，構(gòu)建含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇 激酶編碼序列的植物表達載體；
步驟二，將步驟一中的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入青蒿；
步驟三，通過抗生素篩選，獲得含有青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的轉(zhuǎn)化細胞，再生轉(zhuǎn)基因植株。
步驟二中，所述轉(zhuǎn)入采用凍融法。
本發(fā)明中，構(gòu)建步驟一中含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇 激酶編碼序列的植物表達載體時可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，例如質(zhì)粒，粘 粒等。本發(fā)明中，步驟三中，含有青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(:-甲基-0-赤蘚醇
合酶編碼序列的轉(zhuǎn)化細胞為真核細胞。進一步地，真核宿主細胞為酵母細胞、擬 南芥的生殖細胞或愈傷組織細胞、其他植物的生殖細胞或愈傷組織細胞。
術(shù)語"簡并"是指編碼氨基酸的大部分密碼子具有簡并性，即兩個或多個 密碼子編碼同一氮基酸。例如GM和GAG都編碼谷氨酰胺。 本發(fā)明具有如下的有益效果
本發(fā)明可提高青蒿素含量；同時本發(fā)明可使含青蒿4-(5' -二磷酸胞 苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的轉(zhuǎn)基因植物成為生物反應(yīng)器，實現(xiàn)異戊 二烯類化合物的大規(guī)模生產(chǎn)；利用本發(fā)明的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基 -D-赤蘚醇激酶蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與青蒿4-(5' -二磷酸 胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或 拮抗劑等。
本發(fā)明涉及的根癌農(nóng)桿菌EHA105已在《黃亞麗，蔣細良，田云龍，郭萍， 朱昌雄；根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的哈茨木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究，中國生物工程雜志， 2008, 28 (3) : 38 43》文獻中公開。根癌農(nóng)桿菌EHA105可通過公開市售的 商業(yè)渠道取得，如可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為Gambarl。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明 本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法， 通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊見New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的條件，或按照制造廠商 所建議的條件。
實施例
步驟一，青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列《M) 的克隆
(1) RNA的提取(RNA extraction) 取青蒿葉片組織，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1. 5mL Eppendorf (EP) 離心管中，充分振蕩后，按照TIANGEN試劑盒的說明書抽提總RNA。用甲醛變性 膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。(2)基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)
根據(jù)擬南芥中相關(guān)基因所編碼的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原 理，采用RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)方法(Clontech公司SMART RACE試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行
① 首鏈cDNA的合成
利用SMART RACE試劑盒所提供的5'-CDS primer A和SMART II A oligo 引物，以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成 5，-RACE -Ready cDNA;利用Clontech試劑盒所提供的3，-CDS primer A為引 物，以所提取的總RNA為模板，在PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成 3，-RACE-Ready cDNA。
② 3,-RACE
用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區(qū)設(shè)計的 基因特異引物2 (GSP2) (SEQ ID NO: 1)進行3'-RACE PCR反應(yīng)。用瓊脂糖凝 膠電泳進行檢測并對產(chǎn)物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到pMD18-T載 體上進行測序。
③ 5, -RACE
用Clontech試劑盒提供的通用引物序列(UPM)和利用擬南芥同源區(qū)設(shè)計的 基因特異引物l (GSP1) (SEQ ID NO: 2)進行5， -RACE PCR反應(yīng)。用瓊脂糖凝 膠電泳進行檢測并對產(chǎn)物進行膠回收，將膠回收的目的片段連接到PMD18-T載 體上進行測序。將測序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，得到該基因的完整編碼區(qū)序列。BLAST 分析結(jié)果證明從青蒿中得到的基因確為一個4-(5,-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶的相關(guān)基因。
通過上述步驟，獲得了青蒿中參與青蒿素合成的4-(5,-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO: 3)，其中，起始密碼子 為ATG，終止密碼子為TAA。本實施例中得到的新的青蒿C抓的全長cDNA長度 為1480bp，詳細序列見SEQ ID NO: 3,其中開放閱讀框位于15~1214位核苷 酸(1200個核苷酸，含終止密碼子)。根據(jù)所獲得的cDNA推導(dǎo)出青蒿4-(5'-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶的氨基酸序列， 共399個氨基酸殘基，詳 細序列見SEQ ID NO: 4。步驟二，青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(;-甲基-0-赤蘚醇激酶相關(guān)基因的序
列信息與同源性分析
步驟一中得到的青蒿C艦(4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶) 的全長cDNA長度為1200bp (SEQ ID NO: 3)，其中開放閱讀框位于第15-1214 位核苷酸，根據(jù)所獲得的cDNA推導(dǎo)出青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶的氨基酸序列(見SEQ ID NO: 4)，共399個氨基酸殘基，分子量 為43818. 44,等電點為7.15。利用vectorNTI 9. 0軟件對來源于各種植物的4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D"赤蘚醇激酶的相關(guān)氨基酸序列進行同源比對，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，克隆到的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列與 擬南芥(Arabidopsis thaliana)， 玉米 (Zea may)， 煙草 (Nicotiana Benthamiajm)，薄荷(Mentha x piperita)，番茄(Lycopersicon esculent咖) 以及甜葉菊(Stevia rebaudiana) 中同源基因所編碼的氨基酸序列相似性 分別為70%, 76%， 72%， 70%， 78%， 78%。由此可見，青蒿0^基因與其他高 等植物中的C服相關(guān)基因在所編碼的氨基酸水平上存在較高的同源性，可以認為 它們的產(chǎn)物在功能上也有較高的相似性。
步驟三，青蒿4-(5， -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶相關(guān)蛋白或多 肽在青蒿細胞中進行真核細胞表達
(1)含目的基因(青蒿CMK基因)的表達載體的構(gòu)建
根據(jù)青蒿C服的全長編碼序列(SEQ ID NO: 3)，設(shè)計擴增出完整編碼閱讀 框的引物，并在正反引物上分別引入^a/zHI和&cI限制性內(nèi)切酶位點，以便構(gòu) 建表達載體。以青蒿cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增后，將青蒿C服的編碼區(qū)序列連 接至中間載體pMD18-T中進行測序。將測序正確的C服的編碼區(qū)序列進一步克 隆到表達載體pCAMBIA2300中，接著將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，并進行PCR 驗證。結(jié)果表明，含青蒿Off基因的植物表達載體已成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株 中。
(2)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)C服基因轉(zhuǎn)化青蒿 ①外植體的預(yù)培養(yǎng)
青蒿種子用75% (v/v)乙醇浸泡1 min;再用20% (w/v) NaC10浸泡20 min; 無菌水沖洗3-4次；用無菌吸水紙吸干表面水分；接種于無激素的MS，該MS培 養(yǎng)基采用Murashige和Skoog在1962年發(fā)明的固體培養(yǎng)基，可以通過商業(yè)渠道獲得；25'C、 16小時的日光和8小時的黑夜培養(yǎng)，即可獲得青蒿無菌苗。待 苗長至5cm左右后，剪取無菌苗葉片外植體用于轉(zhuǎn)化。
② 農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)
將所述的葉片外植體，轉(zhuǎn)到1/2 MS和100 Mrnol/L AS組成的共培養(yǎng)培養(yǎng)基 中，滴加含活化好的所述含DEL0到DEL8基因植物雙元表達載體的根癌農(nóng)桿菌 工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28'C暗培養(yǎng)3d。以滴加在不 帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌的1/2 MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對照。
③ 抗性再生植株的篩選
將所述的共培養(yǎng)3d的青蒿外植體轉(zhuǎn)入到MS、0. 5 mg/L 6-BA、 0. 05 mg/L NAA、 50 mg/L Kan和500mg/L Cb組成的發(fā)芽篩選培養(yǎng)基上，于25'C、 16小時的日 光和8小時的黑暗中培養(yǎng)，每兩周繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過2-3次繼代后即可獲得 Kan抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢生芽剪下轉(zhuǎn)入1/2MS0和125mg/L Cb組成 的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。
④ 轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR檢測
根據(jù)目的基因所在表達盒p35s-CMK -nos序列p35s和C服分別設(shè)計正向引 物設(shè)計和反向引物對C服基因進行檢測。結(jié)果表明，利用所設(shè)計的PCR特異引 物，能擴增出特異DNA片段，而以非轉(zhuǎn)化青蒿基因組DNA為模板時，沒有擴增 出任何片段。
步驟四，利用HPLC-ELSD測定轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量 (1) HPLC-ELSD條件及系統(tǒng)適用性以及標(biāo)準溶液的配制
HPLC:采用water alliance 2695系統(tǒng)，色譜柱為C-18反相硅膠柱 (Sy咖etryShieldTMC18， 5 ^m, 250x4. 6咖，Waters),流動相甲醇(methanol): 水為70%:30%，柱溫30'C，流速1. OmL/min,進樣量10 靈敏度(AUFS:l. 0)， 理論塔板數(shù)按青蒿素峰計算不低于2000。
ELSD:采用water alliance 2420系統(tǒng)，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40 'C,放大系數(shù)(gain)為7，載氣壓力5 bar;
精密稱取青蒿素標(biāo)準品(Sigma公司)2.0 mg用1 mL甲醇完全溶解，得到 2 mg/mL青蒿素標(biāo)準品溶液，保存于-20'C備用。
本實施例中流動相甲醇(methanol):水為70%:30%時，青蒿素的保留時間 為5.1 min,峰型良好。理論塔板數(shù)按青蒿素計算不低于2000。(2) 標(biāo)準曲線的制作 將所述對照品溶液在相應(yīng)色譜條件下分別進樣2 nL, 4 ^L, 6 nL， 8 pL，
10nL記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對標(biāo)準品含量(X, pg)進行回歸分 析。通過研究，本實施例中青蒿素在4-20 pg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的log-log線性 關(guān)系。青蒿素對照品的log-log線性回歸方程為Y=l. 28e+000X+4. 71e+000， R=0.979546。
(3) 樣品的制備和青蒿素含量的測定
青蒿素的提取過程基于Van Nieuwerburgh et al. (2006)中報道的方法取 少量新鮮的青蒿葉片(1-2 g鮮重)，于50 ml試管中將其浸沒在10 ml氯仿中 搖蕩l分鐘，將浸出液倒入新的試管中使氯仿?lián)]發(fā)完全，取3ml無水乙醇充分 溶解提取物，用于HPLC檢測。同時，氯仿提取后的葉片收集放入60度烘箱進 行烘干，稱重(計算青蒿葉片的干重)；
采用HPLC-ELSD測定青蒿素含量，樣品進樣體積為20 根據(jù)峰面積代入 線形回歸方程計算出樣品中的青蒿素含量(mg)，再除以樣品的青蒿葉干重(g)， 從而計算出青蒿植株中青蒿素的含量。
在本實施例中編碼4-(5,-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶(6MD基 因的轉(zhuǎn)化顯著提髙了青蒿葉片中青蒿素含量，這使得轉(zhuǎn)基因植株中青蒿素的含量 超過對照非轉(zhuǎn)化普通青蒿的50%以上。由此可見，4-(5，-二磷酸胞苷)-2-C-甲基 -D-赤蘚醇激酶基因可作為一種獲得了青蒿素高產(chǎn)的青蒿植株的候選基因，用于 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提髙植物青蒿素含量和其他異戊二烯類化合物的研究和產(chǎn)業(yè)化 生產(chǎn)中。
9序列表
〈110>上海交通大學(xué)
<120>青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶蛋白編碼序列 〈160> 4
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1 <211> 25 <212〉 DNA
<213> 青蒿(Artemisia annua L ) <400> 1
aggccgtgga aaatacgatg ctgtt 25
<210> 2 〈211〉 25 <212> 醒
〈213> 青蒿(Artemisia annua L ) 〈400〉 2
cccgtctggc ctcttattgg ttatt 25
<210> 3 <211> 1480 〈212〉 DNA
〈213> 青蒿(Artemisia annua L.) <400> 3
ggtaactaac caccatggca acaatggctg ctgcttcttc tcacttgttt gtatatcatc aaaattcaac aaatcctcca ttactttaaa acaatcttcg agaattgcag aaattttaga acccatttgg、 tggttaaagc ttcttcatct acaccaaaaa tggaagaaaa caagaggagt tggtgtataa tcttgatgag gattagctga tgaggtggat atgaatgctg gattgtcaag actctctttg gtaagatcaa tgttttctta agaataacca ataagaggcc agacgggttt catctctatt tcatgtaatc agcttagggg ataagataaa gttctcctta aaactacaga tcgcctctca actaatgtgc caggaattcc acttgatgaa
tac幼caatg 60
ttttatcata 120
gataataatg 180
aagctaaatc 240
ttttctcctt 300
catgacctag 360
tcaccatcga 420
agaaatttga 480taataaaggc cttaaatcta tatcggaaga agacgggaag tgacaaattc ttttgggtac 540
atgttgataa aaaggttcca actggggctg ggcttggtgg cggaagtagt aatgctgcaa 600
ccgcactttg ggcagcaaac caattcagtg gttgcctagc aacggagcaa gaactccaag 660
aatggtctgg tgagattggt tcagatgtcc ccttcttctt ctccaatgga gccgcctatt 720
gcacgggtag aggcgaggtt gttcaagata taccttcacc tgtacctttt gacttaccaa "780
tggttctgat taagcctcca gaggcatgct ctactgctga agtttacaag cgtttccggt 840
tggatgtatc aagtactgct gatcctttag cattgctgga gaagatctca aaaatatggaa 900
tatcacaaga tgtttgcata aacgatttgg aaccgcctgc ttttgaagtt cttccgtctc 960
tgaagagact aaaacaacgc atagttgctg caggccgtgg aaaatacgat gctgttttta 1020
tgtctggaag tggaagcacc atagtaggcg tgggttctgc agatccccca caatttttat 1080
atgatgaatga ggattataag gacgtctttc tatccgaagc taacttcatc acacgcacag 1140
agaaccaatg gtaccaagaa ccatcttcgt caaatactac ttcatttgta gatcaatcca 1200
gttgacaggt ttcaacatta tcaaacatcg
atagtccgat
gctacgctgc aatttaggat atctgttata ttgcggcc犯aaatcattta tcttattgcc aaagtttgat
tatggatgtg tcctttatat
tatgattctt gtctagtcac
tgttgtaaga tcggcttaga eigtcatagaa gtgagcatca atgtagcatc ctttctaaat agttattgtg
tttttatctt ataactttac
〈210> 4 〈211〉 399 〈212〉 PRT
<213> 青蒿(Artemisia annua L ) 〈400〉 4
Met Ala Thr Met Ala Ala Ala Ser Ser His Leu Phe Tyr Asn Asn Gly
5 10
15
1260 1320 1380 1440 1480
lie Ser Ser Lys Phe Asn Lys Ser Ser lie Thr Leu Lys Gin Ser Ser
20 25
30Phe Tyr His Lys Asn Cys Arg Asn Phe Arg Thr His Leu Val Val Lys 35 40 45
Ala Ser Ser Ser Asp Asn Asn Asp Thr Lys Asn Gly Arg Lys Gin Glu 50 55 60
Glu Leu Val Tyr Asn Leu Asp Glu Lys Leu Asn Arg Leu Ala Asp Glu 65 70 75 80
Val Asp Met Asn Ala Gly Leu Ser Arg Leu Ser Leu Phe Ser Pro Cys 85 90 95
Lys lie Asn Val Phe Leu Arg lie Thr Asn Lys Arg Pro Asp Gly Phe 100 105 110
His Asp Leu Ala Ser Leu Phe His Val lie Ser Leu Gly Asp Lys lie 115 120 125
Lys Phe Ser Leu Ser Pro Ser Lys Thr Thr Asp Arg Leu Ser Thr Asn 130 135 140
Val Pro Gly lie Pro Leu Asp Glu Arg Asn Leu lie lie Lys Ala Leu 145 150 155 160
Asn Leu Tyr Arg Lys Lys Thr Gly Ser Asp Lys Phe Phe Trp Val His 165 170 175
Val Asp Lys Lys Val Pro Thr Gly Ala Gly Leu Gly Gly Gly Ser Ser 180 185 190
Asn Ala Ala Thr Ala Leu Trp Ala Ala Asn Gin Phe Ser Gly Cys Leu 195 200 205
Ala Thr Glu Gin Glu Leu Gin Glu Trp Ser Gly Glu lie Gly Ser Asp 210 215 220
Val Pro Phe Phe Phe Ser Asn Gly Ala Ala Tyr Cys Thr Gly Arg Gly 225 230 235 240Glu Val Val Gin Asp lie Pro Ser Pro Val Pro Phe Asp Leu Pro Met 245 250 255
Val Leu lie Lys Pro Pro Glu Ala Cys Ser Thr Ala Glu Val Tyr Lys 260 265 270
Arg Phe Arg Leu Asp Val Ser Ser Thr Ala Asp Pro Leu Ala Leu Leu 275 280 285
Glu Lys lie Ser Lys Asn Gly lie Ser Gin Asp Val Cys lie Asn Asp 290 295 300
Leu Glu Pro Pro Ala Phe Glu Val Leu Pro Ser Leu Lys Arg Leu Lys 305 310 315 320
Gin Arg lie Val Ala Ala Gly Arg Gly Lys Tyr Asp Ala Val Phe Met 325 330 335
Ser Gly Ser Gly Ser Thr lie Val Gly Val Gly Ser Ala A印Pro Pro 340 345 350
Gin Phe Leu Tyr Asp Glu Glu Asp Tyr Lys Asp Val Phe Leu Ser Glu 355 360 365
Ala Asn Phe lie Thr Arg Thr Glu Asn Gin Trp Tyr Gin Glu Pro Ser 370 375 380
Ser Ser Asn Thr Thr Ser Phe Val Asp Gin Ser Ser Tyr Ala Ala 385 390 39權(quán)利要求
1、一種青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列，其特征是，該序列如SEQ ID NO3中第15～1214位所示或者是SEQ ID NO3序列中第15～1214位所示的核苷酸中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子取代后產(chǎn)生的序列。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列，其特征是，該序列如SEQ ID NO: 3中第15 1214位所示。
3、 一種多肽，其特征在于，序列如SEQ ID NO: 4所示。
4、 一種利用權(quán)利要求l所述的青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列提高植物青蒿素含量的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，將青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-(:-甲基-0-赤蘚醇激酶編碼序列連于植物表達調(diào)控序列上，構(gòu)建含青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的植物表達載體；步驟二，將步驟一中的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入青蒿；步驟三，通過抗生素篩選，獲得含有青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的轉(zhuǎn)化細胞，再生轉(zhuǎn)基因植株。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用青蒿4-(5' -二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列提高植物青蒿素含量的方法，其特征是，步驟二中，所述轉(zhuǎn)入具體為采用凍融法進行轉(zhuǎn)入。
全文摘要
一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列，序列如SEQ ID NO3中第15～1214位所示或者是SEQ ID NO3序列中第15～1214位所示的核苷酸中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子取代后產(chǎn)生的序列；利用所述編碼序列提高植物青蒿素含量的方法包括如下步驟將所述編碼序列連于植物表達調(diào)控序列上，構(gòu)建含青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的植物表達載體；將步驟一中的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入青蒿；通過抗生素篩選，獲得含有青蒿4-(5’-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶編碼序列的轉(zhuǎn)化細胞，再生轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明可提高青蒿中青蒿素的含量以及其他植物的異戊二烯類化合物含量。
文檔編號C12N15/54GK101665796SQ20091019517
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月4日
發(fā)明者唐克軒, 可 楊, 王玥月, 翁純純 申請人:上海交通大學(xué)