專利名稱：一種利用內(nèi)酯酶制備光學(xué)純2-羥基-4-苯基丁酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及內(nèi)酯水解酶用于生產(chǎn)光學(xué)純2-羥基-4-苯基丁酸 的方法。
背景技術(shù)：
小分子羥基酸，例如乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸和葡萄糖酸等，在其分子結(jié)構(gòu)中 含有羥基以及羧基這兩種功能基團(tuán)，是化學(xué)合成中非常有用的中間體，是一類非常重要的 有機(jī)酸，在生物體內(nèi)具有特殊生理功能，而在食品/飼料工業(yè)上又是一類非常有用的功能 添加齊U。一些非天然的羥基酸，特別是具有光學(xué)活性的手性羥基酸，還可以作為"結(jié)構(gòu)砌塊" 用于許多天然產(chǎn)物和藥物的化學(xué)合成。 2-羥基-4-苯基丁酸作為a -羥基酸家族的重要一員，是合成眾多"普利"類血管 緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)的關(guān)鍵手性中間體。這些酶抑制劑切斷腎素-血管緊張素-醛 固酮系統(tǒng)，阻斷血管緊張素II的產(chǎn)生而擴(kuò)張血管、降低血壓，是一類安全有效的降壓藥。作 為合成切塊之一，手性羥基-4-苯基丁酸及其乙酯可與不同的氨基部分形成共價(jià)鍵，合成 如依拉普利、賴諾普利等藥物。由于手性2-羥基-4-苯基丁酸及其乙酯在該類藥物合成中 的重要價(jià)值以及原有的專利保護(hù)即將過(guò)期，吸引了許多研究人員的研究興趣，并有多種制 備方法被報(bào)道。 目前，光學(xué)純2-羥基-4-苯基丁酸的合成主要有3條路線(1)"經(jīng)典拆分"，即與 手性胺形成鹽，利用化學(xué)拆分法將相應(yīng)的某一對(duì)映體酸優(yōu)先成鹽并從溶液中結(jié)晶出來(lái)而達(dá) 到分離的目的(J. Chem. Soc. ， Perkin Trans. 1， 1986， 1011) 。 (2)不對(duì)稱合成。如分別以 D-蘋果酸衍生物或L-絲氨酸為起始原料進(jìn)行不對(duì)稱合成。a -乙酰-D-蘋果酸酸酐與苯 發(fā)生Friedel-Crafts反應(yīng)，得到(R) _ a -乙酰氧基_4_氧代_4_苯基丁酸，經(jīng)Pd/C還原即 得2-羥基-4-苯基丁酸，ee值100% (Tetrahedron :Asymmetry， 2001， 12， 1583)。但是該方 法需用昂貴的D-蘋果酸作為原料，且需要使用到較毒的苯，因而沒(méi)有實(shí)用價(jià)值。利用L-絲 氨酸在溴化鉀存在下，經(jīng)亞硝酸鈉重氮化得相應(yīng)的構(gòu)型保持的溴代酸，然后在氫氧化鈉的 作用下脫去溴化氫即得一個(gè)R構(gòu)型的環(huán)氧丙酸，再進(jìn)一步與有機(jī)金屬試劑在低溫下開(kāi)環(huán)而 得2-羥基-4-苯基丁酸。但是，該方法要求在無(wú)水和低溫下進(jìn)行，反應(yīng)條件較苛刻。(3)不 對(duì)稱催化包括不對(duì)稱水解和不對(duì)稱還原。利用不對(duì)稱催化氫化，可以由2-羰基-4-苯基 丁酸乙酯經(jīng)立體選擇性的均相或非均相催化氫化制得。其中非均相催化氫化以鉑作為催化 劑，三氧化二鋁作為載體，用10， 11- 二氫辛可尼定和甲基醚化的10， 11- 二氫辛可尼定等作 為修飾劑。利用微生物整細(xì)胞或者微生物產(chǎn)生的還原酶不對(duì)稱還原2-羰基-4-苯基丁酸 (及其乙酯)或者利用水解酶催化水解2-羥基-4-苯基丁酸消旋酯的對(duì)映選擇性水解拆分 也是一種已知的方法(Adv. Syn. Catal. 2008， 350， 426)，但是一般需要使用大量的微生物細(xì) 胞或酶，而且它們的效率都不高。如微生物還原反應(yīng)，底物/催化劑之比一般在較低的水平 (1/25 1/100g/g濕細(xì)胞)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是建立一種利用內(nèi)酯水解酶同時(shí)生產(chǎn)光學(xué)純2-羥
基-4-苯基丁酸兩種對(duì)映異構(gòu)體的新方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。 本發(fā)明所用的重組內(nèi)酯水解酶來(lái)源于Fusarium proliferatum ECU2002(保藏號(hào)
為CGMCC 1494)，是發(fā)明人從微生物體內(nèi)克隆出該酶基因，連接到表達(dá)載體pET-28a(+)上
并將其表達(dá)到大腸桿菌JM109 (DE3)和BL21 (DE3)中。該酶的基因序列已登陸在GenBank
上(EU596535)，并在已經(jīng)公開(kāi)的專利申請(qǐng)(PCT/CN2007/070598)中有詳細(xì)的說(shuō)明。 本發(fā)明的重組內(nèi)酯水解酶可以用于生產(chǎn)光學(xué)純的2-羥基-4-苯基-丁酸及其衍
生物，重組內(nèi)酯水解酶的生產(chǎn)方法包括如下的步驟 (1)重組大腸桿菌的培養(yǎng) 將表達(dá)Fusarium proliferatum內(nèi)酯水解酶基因的重組大腸桿菌采用本領(lǐng)域常規(guī) 的方法，在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)24 36h，溫度20 50°C ; 再以上述培養(yǎng)液作為種子，基于發(fā)酵培養(yǎng)基體積的接種量為1 10% (v/v)，接種 至50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在20 50。C下100 160rpm搖床上培養(yǎng)24 48h，離心得到靜 息細(xì)胞； 再以上述培養(yǎng)液作為種子，基于發(fā)酵培養(yǎng)基體積的接種量為1 10% (v/v)，接種
至5L的發(fā)酵罐中，在20 50。C下100 160rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)12 48h ;在10 40。C下加入誘導(dǎo)劑IPTG，在100 160rpm轉(zhuǎn)速下表達(dá)12 48h，離心收
集細(xì)胞并用生理鹽水洗3次； 所說(shuō)的發(fā)酵培養(yǎng)基可采用常規(guī)的培養(yǎng)基，其中各組分的含量如下3g/L， tryptone 10g/L，NaCl 5g/L，K2HP04 5g/L， pH 7.0。 [OOM] (2)底物的生物轉(zhuǎn)化 將收獲的靜息細(xì)胞，懸浮于pH為6. 0 8. 0的磷酸緩沖溶液中，靜息細(xì)胞的含量 為10 100g(濕重)/L;加入4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯，最終濃度為10 200mM，在 25 4(TC和100 160rpm的恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)30min 24h，然后從反應(yīng)液中收集產(chǎn)物 (2S)-4-苯基-2-羥基-4- 丁內(nèi)酯和(2R)-4-苯基-2 ，4- 二羥基丁酸。
將上述所得產(chǎn)物分別用冰醋酸溶解后，在常溫常壓Pd/C催化下氫化得到目標(biāo)化 合物。所述的光學(xué)純的(2S)-4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯、光學(xué)純的(2R)-4-苯基-2-羥 基-4-丁內(nèi)酯或光學(xué)純的(2R)-4-苯基-2，4-二羥基丁酸與Pd/C的重量比為1 : 0.01 0.05。獲得的化合物可以在有機(jī)溶劑中重結(jié)晶獲得精制品，如1，2-二氯乙烷有機(jī)溶劑。
由上述公開(kāi)的技術(shù)方案可見(jiàn)，采用本發(fā)明所述的生產(chǎn)光學(xué)純2-羥基-4-苯基_ 丁 酸及其乙醇酯的方法，不僅具有較好的催化效果，能夠同時(shí)合成光學(xué)純(對(duì)映體過(guò)量值ee > 98% )的2-羥基-4-苯基-丁酸的兩種對(duì)映異構(gòu)體，而且生物催化劑的用量非常少，底 物/催化劑的比率高達(dá)8. 8/1 (g/g干細(xì)胞)，反應(yīng)條件溫和、底物適應(yīng)性廣，具有很好的工業(yè) 應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。
具體實(shí)施例方式
下面將就部分實(shí)施例給出詳細(xì)的反應(yīng)條件、純化方法、物理常數(shù)和結(jié)構(gòu)確認(rèn)所需 的分析數(shù)據(jù)，需要指出的是本發(fā)明并不僅僅局限在下述實(shí)施例的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1生物催化劑的制備 配制LB培養(yǎng)基，成分如下yeast extract 5g/l，tryptone 10g/l， NaCl 10g/l。 另配制MLB培養(yǎng)基，組成如下葡萄糖3g/L， tryptone 10g/L， NaCl 5g/L， K2HP04 5g/L， pH 7.0。接種重組大腸桿菌JM109(DE3)或BL21(DE3)到3ml LB培養(yǎng)基中，以卡那霉素作為 抗生素，在37°C， 160rpm/min條件下進(jìn)行富集培養(yǎng)12h ;富集培養(yǎng)之后再作為種子液接種到 50ml LB培養(yǎng)基中，加入卡那霉素作為抗生素在37。C，160rpm/min條件下進(jìn)行富集培養(yǎng)4h ; 富集培養(yǎng)之后再作為種子液接種到3L MLB培養(yǎng)基中，在37°C， 160rpm/min下進(jìn)行發(fā)酵生長(zhǎng) 8 12h，維持pH 7. 0不變。降低發(fā)酵液的溫度到15°C ，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)12 24h。 最后離心收集菌體并用生理鹽水洗3遍。該濕細(xì)胞可作為催化劑直接用于水解反應(yīng)。
細(xì)胞酶的活力單位定義為在30°C 、pH7. 0的條件下，每分鐘催化水解1. 0 ii mol消 旋泛解酸內(nèi)酯(標(biāo)準(zhǔn)底物)所需要的細(xì)胞量。 實(shí)施例2利用靜息細(xì)胞催化制備(2S) -4-苯基-2-羥基_4_ 丁內(nèi)酯 將離心得到的重組大腸桿菌靜息細(xì)胞lg懸浮于100ml自來(lái)水中，加入乙腈(20%，
v/v)和底物4-苯基-2-羥基-4- 丁內(nèi)酯，使底物終濃度為lOOmM，用自動(dòng)電位滴定儀控制
反應(yīng)液pH 6.4，在3(TC攪拌反應(yīng)lh后，將反應(yīng)液以12，000Xg離心lOmin，除去細(xì)胞。在
上清液中加入NaCl至飽和，用50ml的乙酸乙酯萃取，重復(fù)三次。離心得到的細(xì)胞用20ml
乙酸乙酯浸泡，重復(fù)兩次，將這兩部分乙酸乙酯合并，然后用飽和NaCl溶液洗滌兩次，每次
50ml。得到的乙酸乙酯萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，得到產(chǎn)物粗
品，為兩種非對(duì)映異構(gòu)體的混合物的形式，但其光學(xué)純度都在99%以上。 實(shí)施例3利用靜息細(xì)胞制備(2R)-4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯 將離心得到的重組大腸桿菌靜息細(xì)胞lg懸浮于100ml自來(lái)水中，加入乙腈(20%，
v/v)和底物4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯，使其終濃度為100mM，用自動(dòng)電位滴定儀控制溶液
p朋.4，在3(TC和160rpm的恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)到轉(zhuǎn)化率達(dá)30%，將反應(yīng)液以12， OOOXg
離心10min，除去細(xì)胞。在上清液中加入NaCl至飽和，用50ml的乙酸乙酯萃取，重復(fù)八次以
徹底除去不需要的2S構(gòu)型的內(nèi)酯。得到的水相用鹽酸調(diào)pH到1. 0 2. O，在6(TC條件下
加熱lh，再用乙酸乙酯萃取，重復(fù)三次，得到的萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除
去乙酸乙酯，得到產(chǎn)物粗品，為兩種非對(duì)映異構(gòu)體的混合物的形式，但其光學(xué)純度都達(dá)93%以上。 實(shí)施例4利用靜息細(xì)胞制備(2R) -4-苯基_2， 4_ 二羥基-丁酸
將離心得到的重組大腸桿菌靜息細(xì)胞lg懸浮于100ml自來(lái)水中，加入乙腈(20%， v/v)和底物4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯，使其終濃度為100mM，用自動(dòng)電位滴定儀控制溶液 p朋.4，在3(TC和160rpm的恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)到轉(zhuǎn)化率達(dá)30%，將反應(yīng)液以12， OOOXg 離心10min，除去細(xì)胞。在上清液中加入NaCl至飽和，用50ml的乙酸乙酯萃取，重復(fù)八次以 徹底除去不需要的2S構(gòu)型的內(nèi)酯。得到的水相用鹽酸調(diào)pH到1. 0 2. O，直接用乙酸乙酯 萃取，重復(fù)八次，得到的萃取液用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，得到產(chǎn)物
粗品o 實(shí)施例5利用靜息細(xì)胞制備(2S)-羥基-4-苯基丁酸 將實(shí)施例2中得到的產(chǎn)物粗品用冰醋酸溶解后，加入5%的Pd/C，在常溫常壓下氫 化12h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去醋酸得到對(duì)映富集的(2S)-羥基-4-苯基丁酸的粗品。用l，2-二氯乙烷重結(jié)晶一次，目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)純度和光學(xué)純度都在99%以上。
實(shí)施例6利用靜息細(xì)胞制備(2R)-羥基-4-苯基丁酸 將實(shí)施例3 4中得到的產(chǎn)物粗品用冰醋酸溶解后，加入5%的Pd/C，在常溫常壓 下氫化12h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去醋酸，得到對(duì)映富集的(2R)-羥基-4-苯基丁酸的粗品。用l， 2-二氯乙烷重結(jié)晶一次，目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)純度在99%以上，光學(xué)純度達(dá)98%。
權(quán)利要求
一種利用內(nèi)酯酶制備光學(xué)純2-羥基-4-苯基丁酸的方法，其特征是包括如下步驟1)采用Fusarium proliferatum內(nèi)酯水解酶水解4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯(1)將保藏號(hào)為CGMCC 1494表達(dá)Fusarium proliferatum內(nèi)酯水解酶基因的重組大腸桿菌JM109(DE3)或BL21(DE3)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，離心洗滌得到靜息細(xì)胞；(2)將(1)收獲的靜息細(xì)胞懸浮于pH為6.0～7.0的磷酸鉀緩沖液中，加入4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯，在25～40℃反應(yīng)0.5～8h，然后采用常規(guī)的分離方法從反應(yīng)混合物中收集光學(xué)純的(2S)-4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯、(2R)-4-苯基-2，4-二羥基丁酸和(2R)-4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯；2)將步驟1)所獲得的光學(xué)純的(2S)-4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯、光學(xué)純的(2R)-4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯或光學(xué)純的(2R)-4-苯基-2，4-二羥基丁酸用冰醋酸溶解，在常溫常壓和Pd/C催化的條件下氫化12h，得到(S)-2-羥基-4-苯基丁酸、(R)-2-羥基-4-苯基丁酸或(R)-2-羥基-4-苯基丁酸；所述的光學(xué)純的(2S)-4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯、光學(xué)純的(2R)-4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯或光學(xué)純的(2R)-4-苯基-2，4-二羥基丁酸與Pd/C的重量比為10.01～0.05。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的步驟2)所獲得的化合物在有機(jī)溶劑中重 結(jié)晶獲得精制品。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征是步驟l)中所述的內(nèi)酯水解酶催化水解的底物 4-苯基-2-羥基-4- 丁內(nèi)酯為四種非對(duì)映異構(gòu)體混合物，其濃度為10 200mmol/L。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征是步驟l)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下葡萄糖 1 50g，蛋白胨1 20g， KH2P04 1 10g， K2HP04 1 10g， NaCl 0. 1 2g， MgS04 0. 1 2g，自來(lái)水1000ml， pH 3 8。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種化學(xué)-酶法制備光學(xué)純2-羥基-4-苯基丁酸的新方法。該方法利用表達(dá)Fusarium proliferatum內(nèi)酯酶基因的重組大腸桿菌細(xì)胞在優(yōu)化條件下發(fā)酵產(chǎn)酶，然后以一鍋煮的方式選擇性催化水解4-苯基-2-羥基-4-丁內(nèi)酯的非對(duì)映異構(gòu)體，再將所需的構(gòu)型在常溫常壓Pd/C催化氫化作用下，生成目標(biāo)化合物。其中(R)- 2-羥基-4-苯基丁酸的對(duì)映體過(guò)量值達(dá)98％，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)36％，(S)-2-羥基-4-苯基丁酸的對(duì)映體過(guò)量值達(dá)99％以上，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)46％。本發(fā)明所述的生物催化劑及其化學(xué)-酶法工藝不僅具有較好的催化效果，而且操作簡(jiǎn)便、安全，成本低廉，產(chǎn)物容易純化，對(duì)環(huán)境友好，具有工業(yè)開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P7/42GK101701227SQ20091019876
公開(kāi)日2010年5月5日 申請(qǐng)日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日
發(fā)明者許建和, 陳兵 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)