專利名稱：風(fēng)疹病毒熒光定量pcr試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬病原體核酸檢測領(lǐng)域，特別涉及一種風(fēng)疹病毒熒光定量PCR檢測試劑 盒，同時(shí)，本發(fā)明還涉及一種熒光定量PCR試劑盒檢測風(fēng)疹病毒的方法，熒光定量PCR是通 過實(shí)時(shí)監(jiān)控收集PCR體系中的熒光信號，對樣品中的初始模板進(jìn)行定量，可廣泛應(yīng)用于醫(yī) 學(xué)、生物學(xué)等相應(yīng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
風(fēng)疹病毒(rubella virus，RV)是披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的唯一成員，是臨床上常 見的呼吸道感染，引起出疹性疾病(有時(shí)也無癥狀)的病原體之一，人是其唯一宿主。孕婦， 特別是妊娠早期的孕婦感染風(fēng)疹病毒可導(dǎo)致胎兒先天性風(fēng)疹綜合征(congenital rubel lasyndrome, CRS) 0目前對其預(yù)防僅限于接種RV減毒活疫苗，并取得一定成效。在發(fā)達(dá)國 家，風(fēng)疹已幾乎被實(shí)施疫苗計(jì)劃免疫所消滅，只是在未免疫人群中仍有少數(shù)發(fā)生。但在免疫 項(xiàng)目開展不好的國家，風(fēng)疹仍在流行。另據(jù)報(bào)道，在許多國家免疫后的人群仍有一部分保 持著對RV的敏感性，我國雖已有減毒活疫苗問世，但尚未將此列入高危人群的計(jì)劃免疫范風(fēng)疹病毒基因組為單股正鏈RNA，長度為9757個(gè)核苷酸，G+C含量較高(69. 5%). 病毒基因組包含40sRNA，含帽狀結(jié)構(gòu)，具有真核細(xì)胞典型的mRNA功能；2hRNA連接于 40sRNA3'末端，它負(fù)責(zé)編碼一個(gè)分子量IlOX IO3的多肽鏈，此肽鏈為RV結(jié)構(gòu)蛋白前體。風(fēng)疹病毒有4種結(jié)構(gòu)蛋白，它們分別是胞膜糖蛋白El (分子量58 X IO3)、E2a (分 子量47 XlO3)、E2b(分子量42 X IO3)和核殼蛋白C (分子量33 X IO3)。El、E2a、E2b結(jié)構(gòu)相 似，均為糖蛋白，位于病毒顆粒的包膜上。其中Eh、E2b由同一基因編碼，多肽組成相同，兩 者分子量的差異因糖基側(cè)鏈不同而致。C蛋白不含糖基側(cè)鏈，與RNA相連，包繞病毒基因共 同組成核衣殼。El的多肽部分由412 481個(gè)氨基酸殘基組成，富含脯氨酸和半胱氨酸。 作為抗原，El較E2具有較好的免疫原性，能刺激產(chǎn)生針對各決定簇的單克隆抗體，相應(yīng)單 抗能抑制RV的凝血功能，并表現(xiàn)出中和活性。此外，RV感染可產(chǎn)生特異性免疫球蛋白IgG、 IgM、IgA，它們均具有致病意義和診斷價(jià)值。目前風(fēng)疹病毒的臨床檢測常用病毒分離法、血清診斷技術(shù)(包括血凝試驗(yàn)、酶免 疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)和熒光免疫技術(shù)等)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)。病毒分離是一種很準(zhǔn) 確的方法，但培養(yǎng)周期長，操作復(fù)雜，生物影響因素多，不宜被一般實(shí)驗(yàn)室采用。免疫學(xué)方法 是一種常用的方法，它不需要對血清樣本進(jìn)行預(yù)處理，臨床應(yīng)用操作簡便，適用于RV感染 的實(shí)驗(yàn)室診斷和大規(guī)?，F(xiàn)場調(diào)查，但該方法易受抗體產(chǎn)生時(shí)間的限制，可由于采血時(shí)間不 當(dāng)而引起假陰性反應(yīng)；并且一些其它病毒如EB病毒等感染還可引起假陽性反應(yīng)。核酸雜交 法也可用于診斷RV感染且優(yōu)于免疫學(xué)方法，不會(huì)造成假陽性反應(yīng)。目前PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用 于生物科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，其中RT-PCR具有快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，適用于RV感 染的初步和早期診斷，也可用于大樣本的初篩工作。近年來發(fā)展起來的熒光定量PCR(Fluoroenetic Quantitative PCR, FQ-PCR)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已在病原體的定性檢測(Mcgolddrik A， Lowing J P, Ibata G, et al. A Novel Approach to the Detection of Classical Swine Fever Virus by RT-PCR with aFluorogenic Probe (TaqMan)[J]. J Virol Methods, 1998,72 :125-135 ；Bhudevi B, Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan) for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J]. Vet. Microbiol., 2001,83 :1-10)、定量檢測(Desire N, Dehee A, Schneider V, etal. Quantification if Human Immndeficiency Virus Type I Proviral Load by a TaqMan Real-Time PCR Assay[J], J. Clin. Microbiol, 2001, 39 :1301-1310 ；Martell Μ, Gomez J, Esteban H, etal. High-Throughput Real-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA[J], J. Clin. Microbiol, 1999,37 :327-332 ；Kearns AM, Turner AJL, Eltringham GJA, et al. Rapid Detection and Quantification of CMV DNA in Uring Using Lightcycler-based Real-Time PCR[J], J. Clin, Virol,2002,24 :131-134 ； Florence KP,Glaucia PB,Mireille S,et al. Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry [J] · J. Virol. Methods，2001，95 :111-119)、腫瘤基因檢測(Gelmini S et al. Clin Chem. 1997,43(5) :752-758 ；Bieche I et al. Int J Cancer. 1998,78(5) 661-666)、免疫分析(Lang R et al. J Immunol Methods. 1997，203 (2) : 181-192)、基因表 達(dá)水平分析(Hirayama Y et al. Blood, 1998,92(1) :46-52 ；Shimokama T et al. Biochem Biophys Res Commun,1998,246(1) :287-292 ；Nellemann C, Vinggaard AM, Dalgaard Μ, et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determined by LightCycler ^Technology [J]· ^Toxicology，2001，163 :29-38)及其多態(tài)性(Ibrhim MS et al. Mol Cell Probes, 1997,11 (2) :143-147)的研究等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。對感染者體內(nèi)風(fēng)疹病毒的直 接檢測和定量研究，不僅對于了解患病程度，預(yù)測、評價(jià)治療效果有十分重要意義，同時(shí)也 使對病原體感染發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)入量化階段，點(diǎn)面而且對新藥的研究與試用等極為重 要。國內(nèi)外在相關(guān)的這些方面研究很多，雖然也研制開發(fā)出許多檢測試劑盒，但幾乎均為免 疫法檢測。經(jīng)檢索尚無檢測風(fēng)疹病毒的熒光定量PCR試劑盒的的開發(fā)和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種風(fēng)疹病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，能快速、靈敏、 準(zhǔn)確的檢測風(fēng)疹病毒。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了 一種熒光定量PCR風(fēng)疹病毒檢測方法，該方法簡 便，檢測速度快，操作方便安全，省時(shí)效率高。本發(fā)明的熒光定量PCR試劑盒在快速定量檢測風(fēng)疹病毒中可廣泛應(yīng)用。為了解決上述任務(wù)，本發(fā)明有取以下措施一種風(fēng)疹病毒熒光定量PCR檢測試劑 盒，其特征在于，該試劑盒包括RNA提取液；RT-PCR反應(yīng)液；混合酶；RV陽性標(biāo)準(zhǔn)模板；陽性 對照和陰性對照。所述的RT-PCR反應(yīng)液含PCR 81^€61~;0.1 1(^]\1濃度的引物？1、？2;0.1 10 μ M濃度的熒光探針RVFP ；0. 1 ImM的dNTPs溶液和1 IOmM的MgCl2。所述的PCR反應(yīng)液中引物(P1、P2)和探針(RVFP)為風(fēng)疹病 毒El基因片段，其中弓丨物Pl序列為5，-ACGCGCAGCTGGCCTCTTAC-3，，引物P2序列為5，-ACGGTCTTGTGAGGGTGCTG-3，，RV熒光標(biāo)記探針RVFP序列為 5’ -CCACCGACACCGTGATGAGCGT-3’ ；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。所述的熒光探針標(biāo)記的發(fā)光基團(tuán)為FAM、HEX、JOE、ΤΕΤ、Cy3、Cy5、ROX, Fluorescein、Rhodamine> Rhodamine Red、Rhodamine 6G、Orengon Green 488、Orengon Green 500、Orengon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、FITC 或 Acridine orange 中 的任意一種；熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL或DABSl中的任意一種。所述的混合酶由1 IOOU的逆轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptIII和1 IOU的iTaq DNA聚 合酶配制而成。所述的RV標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為含有風(fēng)疹病毒El基因片段SEQ ID NO. 1與PGEM-T Easy 載體構(gòu)成的PGEMT181-1重組質(zhì)粒SEQ ID N0. 2，SEQ ID NO. 1序列為5’ -ACGCGCAGCTGGCCTCTTACTTCAACCCTGGCGGCAGCTACTACAAGCAGTACCACCCTACCGCGT GCGAGGTTGAACCTGCCTTCGGACACAGCGACGCGGCCTGCTGGGGCTTCCCCACCGACACCGTGATGAGCGTGTTC GCCCTTGCTAGCTACGTCCAGCACCCTCACAAGACCGT-3'該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α增殖后用超純質(zhì)粒提取試劑盒提取純化，用紫外分光 光度計(jì)測A26tl定量并稀釋至1 X IO7拷貝數(shù)/ μ 1，-20°C保存，使用前10倍稀釋至1 X IO6拷 貝數(shù)/μ IUXlO5拷貝數(shù)/μ IUXlO4拷貝數(shù)/μ 1。所述的陽、陰性對照分別為RV陽性培養(yǎng)物(滅活)；陰性對照為無模板熒光定量 反應(yīng)液。所述的RNA提取液為提取效率>80%、RNA完整性好、穩(wěn)定性好且操作簡便的核酸 提取液。根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒，采用風(fēng)疹病毒檢測試劑盒，按以下步驟進(jìn)行(a)采RNA提取液從待測標(biāo)本中提取RNA ；(b)將RV標(biāo)準(zhǔn)陽性模板進(jìn)行10倍梯度稀釋；(c)分別取第(a)步中的RNA和第(b)步中的RV陽性標(biāo)準(zhǔn)品，加入到含有混合酶 的RT-PCR反應(yīng)體系中，與標(biāo)準(zhǔn)陰性質(zhì)控品一起用熒光定量PCR檢測儀進(jìn)行RT-PCR檢測；(d)通過比較待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值而對待測樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定 量，在熒光定量PCR儀自帶軟件生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出待測樣品對應(yīng)的拷貝數(shù)濃度。所述的待檢樣本為含漱液或咽拭子抽提液。在本發(fā)明提供檢測風(fēng)疹病毒的熒光定量PCR試劑盒中，有一條兩端標(biāo)記有熒光基 團(tuán)和淬滅基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5’端 熒光報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而被3’端淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中沒有熒 光信號的變化，在PCR退火和伸延過程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨引物的延伸，Taq DNA 聚合酶利用其5’ 一 3’外切酶活性對探針進(jìn)行切割，釋放出報(bào)告基團(tuán)，破壞了兩基團(tuán)之間的 FRET，從而脫離了 3’端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢 測儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對風(fēng)疹病毒的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(CtJhroshold Cycle)相比較得出。Ct值與起始模板數(shù)呈一 定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽性梯度 標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測樣本的Ct值可準(zhǔn)確測出該樣本的起始拷貝數(shù)。在本發(fā)明提供風(fēng)疹病毒的熒光定量PCR試劑盒中，針對風(fēng)疹病毒中的特殊性， 對不同的靶序列進(jìn)行反應(yīng)體系(引物和探針濃度、Mg2+濃度、退火溫度等)的優(yōu)化，并將 FQ-PCR技術(shù)與定量檢測系統(tǒng)相結(jié)合，將其用于風(fēng)疹病毒的定量檢測，通過優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí) 驗(yàn)，建立了定量檢測風(fēng)疹病毒(RV)的方法，并研制出風(fēng)疹病毒定量檢測試劑盒，該試劑盒 的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢測IO1個(gè)病毒粒子。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)特異性更強(qiáng)，靈敏度更高，由于多使用了一條可與模板互補(bǔ)配對的熒光探針， 提高了特異性，而且所設(shè)計(jì)的引物和探針與RV特異性結(jié)合，與其它病原體無明顯的同源 性，特異性極高。另外，由自動(dòng)化儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，結(jié)果可靠， 又進(jìn)一步提高了靈敏度，即使僅存在單拷貝的目的片段也可得到有效的檢測。(2)全封閉反應(yīng)，無須PCR后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠可重復(fù)。(3)分析PCR產(chǎn)物的對數(shù)期，摒棄常規(guī)PCR受多因素干擾的終點(diǎn)分析法，使得定理 更準(zhǔn)確可靠，而且定量范圍可寬達(dá)10個(gè)數(shù)量級。(4)在線性實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光，結(jié)果客觀又直觀。(5)可實(shí)現(xiàn)單管雙檢或多檢，還可設(shè)計(jì)針對性對標(biāo)，監(jiān)控模板抽提效率及排除抑制 干擾。(6)不接觸有毒試劑，操作安全，省時(shí)高效。(7)檢測速度快，整個(gè)檢測過程共僅需2 3小時(shí)。(8)可同時(shí)進(jìn)行大批量的樣本檢測，有利于規(guī)?；?，自動(dòng)化。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 風(fēng)疹病毒熒光定量PCR檢測試劑盒的制備(1) RNA 提取液，dNTPs (25mM)，逆轉(zhuǎn)錄酶 Superscript III (200U/ μ 1)，RNA 酶抑制 劑(40U/ μ 1)，Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)，MgCl2 (IOOmM)。(2)熒光 PCR 5 X buffer 組成50mM Tris-HCl (PH8. 3)，250mM KCl，lmg/ml 明膠。(3)混合酶組成1. 5U/μ 1 逆轉(zhuǎn)錄酶 Superscript III, 1. 5U/μ 1 Taq DNA 聚合酶，5U/yl RNA 酶 抑制劑。(4)熒光定量PCR反應(yīng)液PCR 5Xbuffer 6 μ 1，PI、P2 各 0. 3 μ 1 Q5 μ Μ)，熒光探針 FP 0. 2 μ 1 (25 μ Μ), MgCl2 0· 9 μ 1 (IOOmM)，dNTPs 0. 24 μ 1 (25mM)，DEPC 處理水 15. 86 μ 1。實(shí)施例2 用熒光定量PCR試劑盒檢測風(fēng)疹病毒(1)取離心處理過的含漱水或咽拭子抽提液500 μ 1，加入Iml RNA提取液，再加入 200 μ 1氯仿，振蕩15s，室溫孵化lOmin。4°C 12000g離心lOmin，RNA位于上層。將上層更 換至新的1. 5ml的EP管，加入500 μ 1異丙醇，_20°C下孵化lOmin，再室溫下12000g離心IOmin0棄上清，加入Iml 75%的乙醇洗RNA沉淀，振蕩混勻，4°C 12000g離心5min。棄上 清，37°C干燥5min，從而得到病毒RNA。(2)將標(biāo)準(zhǔn)陽性模板10倍稀釋至1 X IO6拷貝數(shù)/ μ 1、1 X IO5拷貝數(shù)/ μ 1、1 X IO4 拷貝數(shù)/μ 。(3)取熒光定量PCR反應(yīng)液M μ 1，分別加2 μ 1混合酶，再加入第1步提取的RNA 和第2步稀釋好的陽性標(biāo)準(zhǔn)模板各4 μ 1，另外一管加(f)標(biāo)準(zhǔn)陰性質(zhì)控液，在熒光定量PCR 檢測儀(ABI 7500)上平行做PCR檢測。循環(huán)條件為先在37°C反應(yīng)30分鐘，然后94°C保 溫5分鐘，再按94°C 10秒一600C 45秒循環(huán)40次，60°C采集FAM熒光通道的信號。(4)循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)行ABI 7500PCR檢測儀自帶軟件，讀取待測樣品拷貝數(shù)。(5)結(jié)果為陽性標(biāo)準(zhǔn)模板1 X IO6拷貝數(shù)/ μ 1、1 X IO5拷貝數(shù)/ μ 1、1 X IO4拷貝 數(shù)/ μ 1其Ct值分別為20. 27、23. 52、26. 90。檢測的樣品Ct值為29. 87，換算為每毫升檢 測樣本中含有7. 48 X IO4拷貝個(gè)病原體。核苷酸序列表SEQUENCE LISTING<110>上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司<120>風(fēng)疹病毒熒光定量PCR試劑盒及其檢測方法<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>181<212>DNA<213>Rubella virus<400>1acgcgcagct ggcctcttacccgcgtgcga ggttgaacctccgacaccgt gatgagcgtgt<210>2<211>1443<212>DNA<213>Rubella virus<400>2gaggaggcct tcacctacctgtgcgcctcg ctggcgtccgtgggacctcg aggccactggggcttggggg cctgggtaccgcgtgcacct tctgggctgt
tacttcaacc ctggcggcag
ttcaaccctggcggcagctactacaagcagtaccacccta60gccttcggacacagcgacgcggcctgctggggcttcccca120ttcgcccttgctagctacgtccagcaccctcacaagaccg180181ctgcactgcaCCggggtgCgccactcaaacacctgtcccc60ctttgagtccaagattgtggacggcggctgctttgcccca120agcctgcatttgcgagatccccactgacgtctcgtgcgag180cacagccccttgcgcgcgcatctggaatggcacacagcgc240caacgcctactcctctggcgggtacgcgcagctggcctct300ctactacaagcagtaccaccctaccgcgtgcgaggttgaa360
cctgccttcggacacagcgacgcggcctgctggggcttccccaccgacaccgtgatgagc420
gtgttcgcccttgctagctacgtccagcaccctcacaaga ccgtccgggtcaagttccat480
acagagaccaggaccgtctggcaactctccgttgccggcg tgtcgtgcaa cgtcaccaca540
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gctggcctactcgcttgctgtgccaaatgcttgtactacttgcgcggcgctatagcgccg1440
CgC144權(quán)利要求
1.一種風(fēng)疹病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括RNA提取液； RT-PCR反應(yīng)液；混合酶；RV陽性標(biāo)準(zhǔn)模板；陽性對照和陰性對照。
2.如權(quán)利要求1所述的含有內(nèi)對照系統(tǒng)的風(fēng)疹病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的 RT-PCR反應(yīng)液含PCR Buffer ；0. 1 10 μ M濃度的引物Pl、P2 ；0. 1 10 μ M濃度的熒光探 針 RVFP ；0. 1 ImM 的 dNTPs 溶液和 1 IOmM 的 MgCl2。
3.如權(quán)利要求2所述的風(fēng)疹病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的RT-PCR反 應(yīng)液中引物(P1、P2)和探針(RVFP)為風(fēng)疹病毒El基因片段，其中引物Pl序列為 5，-ACGCGCAGCTGGCCTCTTAC-3，，引物 P2 序列為5，-ACGGTCTTGTGAGGGTGCTG-3，，RV 熒光標(biāo) 記探針 RVFP 序列為5，-CCACCGACACCGTGATGAGCGT-3，；或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；或者與上述序列同源性大于85%的序列；或者上述序列的堿基互補(bǔ)序列；或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
4.如權(quán)利要求3所述的風(fēng)疹病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的熒光探針標(biāo)記的發(fā) 7 FAM> HEX> JOE> TET> Cy3> Cy5> ROX> Fluorescein、Rhodamine> Rhodamine Red、 Rhodamine 6G、Orengon Green 488、Orengon Green 500、Orengon Green 514、Texas Red、 TAMRA, Inosine, FITC 或 Acridine orange 中的任意一種；熒光淬滅基團(tuán)為 TAMRA、BHQU BHQ2、BHQ3、DABCYL 或 DABSYL 中的任意一種。
5.如權(quán)利要求1所述的風(fēng)疹病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的混合酶由1 IOOU 的逆轉(zhuǎn)錄酶Superscripts和1 IOU的Taq DNA聚合酶配制而成。
6.如權(quán)利要求1所述的風(fēng)疹病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的RV標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為 含有風(fēng)疹病毒El基因片段SEQ ID NO. 1與PGEM-T Easy載體構(gòu)成的PGEMT181-1重組質(zhì)粒 SEQ ID NO. 2。
7.如權(quán)利要求1所述的風(fēng)疹病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽、陰性對照分別為 RV陽性培養(yǎng)物(滅活)；陰性對照為無模板熒光定量反應(yīng)液。
8.如權(quán)利要求1所述的風(fēng)疹病毒檢測試劑盒，其特征在于，其特征在于，所述的RNA提 取液為提取效率> 80%、RNA完整性好、穩(wěn)定性好且操作簡便的核酸提取液。
9.一種風(fēng)疹病毒檢測方法，其特征在于，采用風(fēng)疹病毒檢測試劑盒，按以下步驟進(jìn)行(a)采RNA提取液從待測標(biāo)本中提取RNA；(b)將RV標(biāo)準(zhǔn)陽性模板進(jìn)行10倍梯度稀釋；(c)分別取第(a)步中的RNA和第(b)步中的RV陽性標(biāo)準(zhǔn)品，加入到含有混合酶的 RT-PCR反應(yīng)體系中，與標(biāo)準(zhǔn)陰性質(zhì)控品一起用熒光定量PCR檢測儀進(jìn)行RT-PCR檢測；(d)通過比較待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值而對待測樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量，在 熒光定量PCR儀自帶軟件生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出待測樣品對應(yīng)的拷貝數(shù)濃度。
10.如權(quán)利要求9所述的風(fēng)疹病毒檢測方法，其特征在于，所述的待檢樣本為含漱液或 咽拭子抽提液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種風(fēng)疹病毒(Rubella virus，RV)檢測試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒包括RNA提取液、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板、Taq DNA聚合酶、熒光定量PCR反應(yīng)液和標(biāo)準(zhǔn)陰性質(zhì)控品。利用該試劑盒，首先提取待測樣品中病毒RNA，然后與標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品一起作熒光定量RT-PCR，根據(jù)熒光定量PCR儀器所帶有的軟件計(jì)算出待測樣本中風(fēng)疹病毒的起始濃度。本發(fā)明檢測速度快、操作方便安全，省時(shí)效率高，可有效的對風(fēng)疹病毒感染患者進(jìn)行病毒RNA檢測，從而達(dá)到了早期診斷和有效預(yù)防風(fēng)疹病毒感染。
文檔編號C12Q1/68GK102061341SQ20091019890
公開日2011年5月18日 申請日期2009年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月17日
發(fā)明者何劍軍, 吳大治, 夏懿, 沈維祥 申請人:上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司