專利名稱：：一種采用不同接種方式來提高紅樹林內(nèi)生真菌產(chǎn)抗癌蒽醌類化合物產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過六種接種方式培養(yǎng)種子從而提高紅樹林內(nèi)生真菌Fusariumproliferatum(No.1403)產(chǎn)蒽醌類抗癌化合物1403C產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
：紅樹林內(nèi)生真菌(Endophyticfungi)1403#為Fusariumproliferatum.，來自中國南海紅樹林樹葉內(nèi)部，由香港城市大學(xué)Vri加oed教授等分離得到。中山大學(xué)林永成教授帶領(lǐng)的研究組已從其發(fā)酵液中分離出20多種化合物，包括灰黃霉素(Griseofulvin)和多種蒽醌(Anthraquinone)、萘醌(Naphthoquinone)和咕噸酮(Xanthone)類等物質(zhì)，這些化合物大多具有抗腫瘤、抗菌活性。1403C是已分離化合物中的一種結(jié)構(gòu)新穎的蒽醌類化合物(姜廣策林永成周世寧等.中國南海紅樹林內(nèi)生真菌No.1403次級代謝物研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué))，2000，39(6):68-72)，經(jīng)中山大學(xué)黎孟楓教授等評定，該物質(zhì)能明顯抑制體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞系且毒副作用小。在Fusariumproliferatum(No.1403)的搖瓶發(fā)酵中，采用常規(guī)的接種及發(fā)酵方式，1403C產(chǎn)量極低(約為1.3mg/L，見姜廣策林永成周世寧等.中國南海紅樹林內(nèi)生真菌No.1403次級代謝物研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué))，2000，39(6):68-72)，難以滿足進(jìn)一步的藥理藥效研究，因此有必要提高1403C的發(fā)酵產(chǎn)量，為開發(fā)新型、高效、低毒的抗腫瘤候選藥物奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明旨在通過對接種方式的優(yōu)化，以期獲得高產(chǎn)量的1403C。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的在于解決1403C產(chǎn)量過低的問題，提供了不同的接種方式來培養(yǎng)種子從而提高1403C產(chǎn)量。為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術(shù)路線如下—種通過改變接種方式來提高1403C產(chǎn)量的方法，利用海洋絲狀內(nèi)生真菌Fusariumproliferatum(No.1403).CCTCCM201018,采用不同的接種方式來培養(yǎng)種子，從而獲得較高產(chǎn)量的1403C。所述的不同的接種方式是通過帶擋板的錐形瓶培養(yǎng)種子進(jìn)行研磨接種、帶擋板的錐形瓶培養(yǎng)的種子直接接種或者在普通錐形瓶中加入一到十顆玻璃珠培養(yǎng)種子進(jìn)行接種。在普通錐形瓶中加入一到十顆玻璃珠培養(yǎng)種子進(jìn)行接種時(shí)，在上述普通錐形瓶中加入一到十顆玻璃珠，裝入種子培養(yǎng)基，經(jīng)常規(guī)滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。加入的玻璃珠的直徑推薦為l-10mm，進(jìn)一步推薦l-3mm。采用帶擋板的錐形瓶培養(yǎng)種子進(jìn)行研磨接種或者帶擋板的錐形瓶培養(yǎng)的種子直接接種時(shí)，在上述帶擋板的錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基，經(jīng)常規(guī)滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中，待種子生長好，進(jìn)行或不進(jìn)行無菌研磨。所述的帶擋板的錐形瓶中的擋板推薦為16塊，進(jìn)一步推薦帶擋板的錐形瓶中的擋板為3塊。所述的錐形瓶推薦為500ml的，所述的帶擋板的錐形瓶中擋板的位置推薦瓶中擋板中心離瓶口13-19cm，離瓶底部O.l-lcm，擋板軸向葉端寬度0.l-2cm，較佳的范圍18.4-18.6cm，離瓶底部0.40.6cm，擋板軸向葉端寬度0.8-lcm。例如擋板中心離瓶口18.5cm，離瓶底部0.5cm，擋板軸向葉端寬度0.9cm。上述帶擋板的錐形瓶中的擋板與瓶子主體為一體吹制而成。具體例如Ml:采用帶有三個(gè)擋板的500mL錐形瓶，裝入100mL種子培養(yǎng)基，經(jīng)12rC、20min滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。待種子生長好，進(jìn)行無菌研磨。M2采用帶有三個(gè)擋板的500mL錐形瓶，裝入100mL種子培養(yǎng)基，經(jīng)121°C、20min滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。M3采用無擋板的500mL普通錐形瓶，加入十顆玻璃珠，裝入100mL種子培養(yǎng)基，經(jīng)121°C、20min滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。M4采用無擋板的500mL普通錐形瓶，加入六顆玻璃珠，裝入100mL種子培養(yǎng)基，經(jīng)121°C、20min滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。M5采用無擋板的500mL普通錐形瓶，加入三顆玻璃珠，裝入100mL種子培養(yǎng)基，經(jīng)121°C、20min滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。M6采用無擋板的500mL普通錐形瓶，加入一顆玻璃珠，裝入100mL種子培養(yǎng)基，經(jīng)121°C、20min滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。菌株本發(fā)明所用的內(nèi)生真菌1403保存在中國典型微生物保藏中心(CCTCC中國武漢大學(xué))，編號為CCTCCM201018。菌種由中山大學(xué)林永成教授提供提供。培養(yǎng)基菌種保存用斜面培養(yǎng)基葡萄糖10g;酵母粉lg;蛋白胨2g;pH7;人工海水(ASW)1000mL:瓊月旨15_20g。種子培養(yǎng)基葡萄糖10g;酵母粉lg;蛋白胨2g;pH7;人工海水(ASW)1000mL。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10g;酵母粉lg;蛋白胨2g;pH7;人工海水(ASW)200mL;去離子水800mL。培養(yǎng)方法從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的菌體，接入經(jīng)121°C(0.IMP)高溫滅菌20min的種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)3d后接入同樣經(jīng)高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量5X(相對于培養(yǎng)基的體積百分比)。將250mL錐形瓶放在搖床上轉(zhuǎn)速170r/min，培養(yǎng)溫度28°C。培養(yǎng)時(shí)間160h。分析方法(1)1403C的粗提取搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，吸取發(fā)酵液10ml加入到含20顆3mm直徑的玻璃珠的250ml三角瓶中并與加入30mL的乙酸乙酯萃取，汲取上層有機(jī)相萃取液減壓蒸餾濃縮后，用1.5ml甲醇溶解后用RP-HPLC檢測。(2)1403C的含量測定用HP1100液相色譜儀，KramasilC18反相柱(250X4.6mm，5ym)，溫度26°C，進(jìn)樣量15ii1，檢測波長為280nm，流速lml/min，流動(dòng)相為1%冰醋酸水溶液(A相)和甲醇(B相)，進(jìn)行梯度洗脫，方法見表1。1403C含量根據(jù)色譜峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積對比以及濃縮倍數(shù)計(jì)算。表1HPLC梯度洗脫表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明通過不同的接種方式來培養(yǎng)種子，應(yīng)用該發(fā)明，能夠獲得相對于對照組產(chǎn)量的不同程度的提高，Ml、M2、M3、M4、M5、M6最終產(chǎn)量分別為1.13g/L、0.97g/L、0.8g/L、0.74g/L、0.7g/L、0.6g/L，比對照組的最終產(chǎn)量0.29g/L分別提高了289.7%、234.5%、175.9%、155.2%、141.4%、106.9%。本發(fā)明大大提高了抗癌蒽醌化合物1403C的產(chǎn)量，對進(jìn)一步進(jìn)行Fusariumproliferatum(No.1403)的藥理藥效實(shí)驗(yàn)具有重要的意義。圖1反映了采用不同接種方式對抗癌蒽醌化合物1403C產(chǎn)量的影響，其中圖1(Ml)采用接種方式Ml進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量的過程曲線；圖1(M2)采用接種方式M2進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量的過程曲線；圖1(M3)采用接種方式M3進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量的過程曲線；圖1(M4)采用接種方式M4進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量的過程曲線；圖1(M5)采用接種方式M5進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量的過程曲線；圖1(M6)采用接種方式M6進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量的過程曲線；圖1(對照)采用常規(guī)的接種方式(對照)進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量的過程曲線。具體實(shí)施例方式為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說明。對照例l采用常規(guī)的接種方式進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量采用500mL普通錐形瓶，裝入100mL種子培養(yǎng)基，經(jīng)12rC、20min滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。待種子生長好，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。如圖l(對照)所示，25h后1403C產(chǎn)量緩慢增加，在發(fā)酵106h后產(chǎn)量達(dá)到最大，為0.29g/L。實(shí)施例l采用接種方式M1進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量采用帶有三個(gè)擋板的500mL錐形瓶(擋板中心離瓶口18.5cm，離瓶底部0.5cm，擋板軸向葉端寬度0.9cm。擋板形狀為梯形，擋板與瓶子主體為一體吹制而成)，裝入lOOmL種子培養(yǎng)基，經(jīng)12rC、20min滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。待種子生長好，進(jìn)行無菌研磨。以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。如圖l(Ml)所示，25h后1403C產(chǎn)量迅速增加，在發(fā)酵130h后產(chǎn)量達(dá)到最大，為1.13g/L，比對照組0.29g/L提高了289.7%。實(shí)施例2采用接種方式M2進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量采用帶有三個(gè)擋板的500mL錐形瓶(擋板中心離瓶口18.5cm，離瓶底部0.5cm，擋板軸向葉端寬度O.9cm。擋板形狀為梯形，該帶擋板的錐形瓶中的擋板與瓶子主體為一體吹制而成)，裝入100mL種子培養(yǎng)基，經(jīng)121°C、20min滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。待種子生長好，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。如圖1(M2)所示，36h后1403C產(chǎn)量迅速增加，在發(fā)酵130h后產(chǎn)量達(dá)到最大，為0.97g/L，比對照組0.29g/L提高了234.5%。實(shí)施例3采用接種方式M3進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量采用無擋板的500mL錐形瓶，加入十顆玻璃珠(直徑3mm)，裝入100mL種子培養(yǎng)基，經(jīng)12rC、20min滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。待種子生長好，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。如圖1(M3)所示，36h后1403C產(chǎn)量迅速增加，在發(fā)酵130h后產(chǎn)量達(dá)到最大，為0.8g/L，比對照組0.29g/L提高了175.9%。實(shí)施例4采用接種方式M4進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量采用無擋板的500mL錐形瓶，加入六顆玻璃珠(直徑3mm)，裝入100mL種子培養(yǎng)基，經(jīng)12rC、20min滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。待種子生長好，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。如圖1(M4)所示，36h后1403C產(chǎn)量迅速增加，在發(fā)酵130h后產(chǎn)量達(dá)到最大，為0.74g/L，比對照組O.29g/L提高了155.2%。實(shí)施例5采用接種方式M5進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量采用無擋板的500mL錐形瓶，加入三顆玻璃珠(直徑3mm)，裝入100mL種子培養(yǎng)基，經(jīng)12rC、20min滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。待種子生長好，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。如圖1(M5)所示，36h后1403C產(chǎn)量迅速增加，在發(fā)酵130h后產(chǎn)量達(dá)到最大，為0.7g/L，比對照組0.29g/L提高了141.4%。實(shí)施例6采用接種方式M6進(jìn)行發(fā)酵所獲得1403C產(chǎn)量采用無擋板的500mL錐形瓶，加入一顆玻璃珠(直徑3mm)，裝入100mL種子培養(yǎng)基，經(jīng)121°C、20min滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。待種子生長好，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。如圖1(M6)所示，36h后1403C產(chǎn)量迅速增加，在發(fā)酵130h后產(chǎn)量達(dá)到最大，為0.6g/L，比對照組0.29g/L提高了106.9%。權(quán)利要求本發(fā)明提供了一種采用不同接種方式來提高紅樹林內(nèi)生真菌Fusariumproliferatum(No.1403)CCTCCM201018抗癌蒽醌類化合物1403C產(chǎn)量的方法，其特征在于采用如下接種方式通過帶擋板的錐形瓶培養(yǎng)種子進(jìn)行研磨接種、帶擋板的錐形瓶培養(yǎng)的種子直接接種或者在普通錐形瓶中加入一到十顆玻璃珠培養(yǎng)種子進(jìn)行接種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接種方法，其特征在于采用帶擋板的錐形瓶培養(yǎng)種子進(jìn)行研磨接種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接種方法，其特征在于采用帶擋板的錐形瓶培養(yǎng)種子直接進(jìn)行接種。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的接種方法，其特征在于在普通錐形瓶中加入一到十顆玻璃珠培養(yǎng)種子進(jìn)行接種。5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的接種方法，其特征在于所述的玻璃珠的直徑為l-10mm。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的接種方法，其特征在于所述的玻璃珠的直徑為l-3mm。7.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5所述的接種方法，其特征在于在無擋板的普通錐形瓶中加入一到十顆玻璃珠，裝入種子培養(yǎng)基，經(jīng)常規(guī)滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中。8.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的接種方法，其特征在于所述的帶擋板的錐形瓶中的擋板為1-6塊。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的接種方法，其特征在于所述的帶擋板的錐形瓶中的擋板為3塊。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的接種方法，其特征在于在帶有三個(gè)擋板的錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基，經(jīng)常規(guī)滅菌，從斜面培養(yǎng)基上挑取生長良好的種子接入上述瓶中，待種子生長好，進(jìn)行或不進(jìn)行無菌研磨。全文摘要本發(fā)明提供了一種采用不同接種方式來提高紅樹林內(nèi)生真菌Fusariumproliferatum(No.1403)產(chǎn)抗癌蒽醌類化合物1403C產(chǎn)量的方法。采用帶擋板的錐形瓶培養(yǎng)種子進(jìn)行研磨接種、帶擋板的錐形瓶培養(yǎng)的種子直接接種、在普通錐形瓶中加入玻璃珠培養(yǎng)種子進(jìn)行接種，發(fā)酵所得1403C產(chǎn)量比采用傳統(tǒng)接種方式培養(yǎng)種子(對照組)進(jìn)行發(fā)酵所得產(chǎn)量均有不同程度的提高，其中最大1403C產(chǎn)量為1.13g/L，比對照組產(chǎn)量0.29g/L提高了289.7％。本發(fā)明對于進(jìn)一步進(jìn)行1403C的抗癌藥理藥效實(shí)驗(yàn)具有重要的意義。文檔編號C12P15/00GK101701230SQ20091019911公開日2010年5月5日申請日期2009年11月20日優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日發(fā)明者余超,周祥山,孫學(xué)謙,康麗,張?jiān)d,鄒武申請人:華東理工大學(xué)