專利名稱：替比夫定耐藥變異檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測個(gè)體替比夫 定耐藥變異遺傳的試劑盒，通過檢測替比夫定用藥靶向位點(diǎn)基因多態(tài)性來評(píng)估個(gè)體替比夫 定耐藥性。
背景技術(shù)：
替比夫定，其化學(xué)名為1-(05，4札5幻-4-羥基-5-羥甲基四氫呋喃-211)-5-甲 基-IH-嘧啶-2，4- 二酮；為天然胸腺嘧啶脫氧核苷的自然L-對(duì)映體，是人工合成的胸腺嘧 啶脫氧核苷類抗乙肝病毒HBV藥物，對(duì)HBV復(fù)制有強(qiáng)大的抑制作用，優(yōu)于拉米夫定，且耐藥 基因突變率低于拉米夫定。對(duì)人類DNA聚合酶無影響，對(duì)哺乳動(dòng)物無細(xì)胞毒反應(yīng)，故耐受良 好。替比夫定為天然胸腺嘧啶脫氧核苷的自然L-對(duì)映體，是人工合成的胸腺嘧啶脫 氧核苷類抗乙肝病毒DNA聚合酶藥物。替比夫定在細(xì)胞激酶的作用下被磷酸化為有活性的 代謝產(chǎn)物——腺苷，腺苷的細(xì)胞內(nèi)半衰期為14小時(shí)。替比夫定5’-腺苷通過與乙肝病毒中 自然底物胸腺嘧啶5’ -腺苷競爭，從而抑制乙肝病毒DNA聚合酶的活性；通過整和到乙肝 病毒DNA中造成乙肝病毒DNA鏈延長終止，從而抑制乙肝病毒的復(fù)制。核苷類抗乙肝病毒藥物具有交叉耐藥的特點(diǎn)。發(fā)生rtM204I變異或者rtLlSOM/ rtM204V雙變異的對(duì)拉米夫定耐藥的乙肝病毒對(duì)替比夫定抗病毒應(yīng)答率(效果)降低超過 1000倍。替比夫定對(duì)與rtM204V變異有關(guān)的拉米夫定耐藥的病毒仍有效(效果降低1. 2 倍)，表現(xiàn)出中度的抗病毒活性。在細(xì)胞培養(yǎng)中，與阿德福韋酯耐藥有關(guān)的rtA181V變異的 病毒對(duì)替比夫定的敏感度減低3到5倍；與阿德福韋酯耐藥有關(guān)的N236T變異的病毒對(duì)替 比夫定仍然敏感。替比夫定與拉米夫定同屬于L-核苷(酸)類似物，因此與拉米夫定具有幾乎相同 的耐藥性位點(diǎn)，即YMDD位點(diǎn)突變?yōu)閅IDD。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種檢測個(gè)體替比夫定耐藥變異遺傳靶向位點(diǎn)基因多態(tài)性的試劑盒。該試劑盒包括檢測YMDD基因rtM204位點(diǎn)多態(tài)性的特異性引物對(duì)及特異性熒光 探針對(duì)，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，反應(yīng)緩沖液，去離子水。本試劑盒中所述的特異性引物和熒光探針對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是能 夠輕易完成設(shè)計(jì)的，特異性引物和熒光探針對(duì)可用常規(guī)的DNA合成技術(shù)進(jìn)行合成。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例檢測試劑盒的使用
步驟1:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2 熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)的體系為總 體積10 μ 1，包含濃度為20ng/ μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、 0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mMMgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合 酶、20 μ M的有義引物和反義引物各0. 225 μ 1、10 μ M的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針 各0. 25μ 1，去離子水5. 325 μ 1。在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán) 的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟4:基因型分析根據(jù)試劑盒使用說明書標(biāo)示的基因分型圖示對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示 的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測的SNP位點(diǎn)的基因 型。
權(quán)利要求
1. 一種檢測個(gè)體替比夫定耐藥變異遺傳的試劑盒，包括特異性引物對(duì)及特異性熒光探 針對(duì)，Taq酶，dNTP混合液，MgCl2溶液，熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液和去離子水，其特征在于 所述的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)是針對(duì)YMDD基因rtM204位點(diǎn)多態(tài)性設(shè)計(jì)的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測個(gè)體替比夫定耐藥變異遺傳的試劑盒。該試劑盒包括檢測替比夫定耐藥變異位點(diǎn)YMDD基因rtM204位點(diǎn)多態(tài)性的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、熒光定量PCR常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測替比夫定用藥靶向位點(diǎn)基因多態(tài)性來評(píng)估個(gè)體替比夫定耐藥性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102108389SQ20091020049
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者馮哲民, 賀憲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司