專利名稱：一種來源于擬南芥的抗鹽、抗干旱的cpk蛋白激酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種來源于擬南芥的抗鹽、抗干旱的CPK 蛋白激酶基因。
背景技術(shù)：
高等植物與動(dòng)物不同，其中最重要的一點(diǎn)是它們更容易受到外界環(huán)境的影響。 在長(zhǎng)期的進(jìn)化與馴養(yǎng)中，植物漸漸形成了一套適應(yīng)環(huán)境變化的機(jī)制。這些機(jī)制涉及到解 剖學(xué)、生理學(xué)、生化學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育學(xué)、進(jìn)化學(xué)、分子生物學(xué)等許多范疇，其中分子生物學(xué) 在植物應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的機(jī)制中是最重要的，這個(gè)多維的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)涉及到基因表達(dá)與 調(diào)控的各個(gè)水平，包括環(huán)境信號(hào)的識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號(hào)輸出、信號(hào)響應(yīng)和表型變化等。 生物體內(nèi)普遍存在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)方式是蛋白激酶(protein kinase)和蛋白磷酸酶 (proteinphosphatase)催化蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化，這一過程幾乎涉及所有的生理及病 理過程，如糖代謝、光合作用、細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、基因表達(dá)、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放，甚至癌 變等等，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中占有極其重要的位置。擬南芥(Arabidopsis thaliana)，十字花科植物。因其植株小、生長(zhǎng)發(fā)育周 期短、種子多、基因組小、自花授粉、基因高度純合等優(yōu)點(diǎn)，被選作模式植物，是植物生理 研究中的重要試才。常用的生態(tài)型有三種Landsberg erecta(Ler)，Columbia(Col)， Wassilewak(Ws)，其中Col的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，所以，對(duì)它的各種宏觀生理研究都可 以十分方便地與微觀的分子水平的研究相聯(lián)系。鈣依賴型蛋白激酶(Ca2+-cbpendent Protein Kinase, CPK)是植物蛋白激酶的研 究熱點(diǎn)，它廣泛分布于植物、藻類和一些原生動(dòng)物中，但在細(xì)菌、真菌和高等動(dòng)物中尚未發(fā) 現(xiàn)。CPKs在植物體內(nèi)分布廣泛在器官水平上，根、莖、葉、花、果實(shí)和種子中無處不在；在 細(xì)胞水平上，分生細(xì)胞、木質(zhì)部細(xì)胞、花粉細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞和胚細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)；在亞細(xì)胞水 平上，質(zhì)膜、液泡膜、線粒體外膜、葉綠體類囊體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等膜系統(tǒng)和胞質(zhì)、核質(zhì)中均有 蹤跡。CPKs在植物鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有非常重要的作用。植物細(xì)胞在外界(非生物和 生物)刺激下，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生瞬間、持續(xù)或振蕩變化。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化通過 Ca2+結(jié)合蛋白(CPK)進(jìn)行識(shí)別、放大和向下游傳導(dǎo)。通過一系列的級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)，從而出現(xiàn)細(xì)胞 分裂、細(xì)胞伸長(zhǎng)、氣孔運(yùn)動(dòng)、各種脅迫反應(yīng)以及生長(zhǎng)發(fā)育等過程。參與環(huán)境脅迫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo) 是CPKs的重要作用之一。干旱、冷害、鹽害、營(yíng)養(yǎng)饑餓、光、低滲透等多種環(huán)境因子都能引起 CPKs基因的特異性表達(dá)和CPKs mRNA的特異性積累。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種來源于擬南芥的抗鹽、抗干旱的CPK蛋 白激酶基因，進(jìn)一步將其應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)化，以提高植物對(duì)鹽、干旱的耐受性。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)上述目的—種來源于擬南芥的抗鹽、抗干旱的CPK蛋白激酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo 1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。所述CPK蛋白激酶基因的制備方法如下設(shè)計(jì)一對(duì)引物(AtCPK6-F:5，-AAGGATCCATGGGCAATTCATGTCGTGG-3，和 AtCPK6_R 5，-AAGAGCTCTA CACATCTCTCATGCTG-3，)，為了克隆鑒定等構(gòu)建需要，引物兩端分別引入Bam H I和Me I的酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系10XPCR buffer 5. 0 μ 1 ；dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ 1 ；擬南芥 cDNA模版 1 μ 1 (20ng)；引物 AtCPK6-F 0· 5 μ 1 ；引物 AtCPK6_R 0. 5 μ 1 ；Εχ-TaqO. 4 μ 1 (預(yù)變性后加 入)；加無菌水定容至50 μ 1。PCR反應(yīng)程序94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸2min，共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，再 72°C延伸 IOmin0所得PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后，克隆到大連寶生物工程有限公司的 pMD-18-Simple T載體上進(jìn)行克隆鑒定和序列測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因?yàn)镃PK蛋白激酶 AtCPK6基因，長(zhǎng)1635bp，編碼的蛋白質(zhì)含544個(gè)氨基酸。轉(zhuǎn)AtCPK6基因的擬南芥植株與野生型植株相比，前者對(duì)鹽、干旱的耐受性明顯提 高。鹽處理后，轉(zhuǎn)AtCPK6基因的擬南芥植株平均成活率為78.8%，野生型植株為12.3% ； 干旱處理后，轉(zhuǎn)AtCPK6基因的擬南芥植株平均成活率為70. 8 %，野生型植株為14. 1 %。有益效果本發(fā)明克隆了擬南芥CPK蛋白激酶基因，S卩AtCPK6基因。對(duì)該轉(zhuǎn)AtCPK6基因的擬 南芥植株和野生型擬南芥植株鹽、干旱脅迫的耐受性試驗(yàn)結(jié)果表明野生型和轉(zhuǎn)AtCPK6基 因擬南芥植株在存活率上有明顯的差異，轉(zhuǎn)基因植株比野生型有明顯的抗鹽、抗干旱能力， 這也表明本發(fā)明的AtCPK6基因的轉(zhuǎn)入提高了擬南芥植株的抗鹽、抗干旱的能力。


圖1為瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA產(chǎn)物的結(jié)果。圖2為PCR擴(kuò)增所得序列為SEQ ID No 1的AtCPK6基因電泳圖，其中1為PCR擴(kuò) 增得到的CPK蛋白激酶基因，2為DNA Marker。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中，所用的試驗(yàn)材料及其來源包括WMJ^· (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia)白勺禾中〒(ν/ν)罾自 粉消毒后種植在黑土 珍珠巖蛭石(3 1 9)混合基質(zhì)中，22°C、IMi光照培養(yǎng)(1 光 照，8h黑暗，冷光源)生長(zhǎng)20d。大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所植物基 因工程研究室保存。植物RNA小量抽提試劑盒購(gòu)自杭州維特潔生化技術(shù)有限公司?？寺≥d 體Rnd-18-Simp 1 e T、各類限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶、連接酶、dNTPUOXPCR buffer和DNA marker購(gòu)自寶生物工程大連有限公司。所有的化學(xué)試劑都從美國(guó)西格瑪化學(xué)公司和上海國(guó) 藥化學(xué)試劑公司購(gòu)買。ABI PRIAM Bio-DyeTerminator DNA測(cè)序試劑盒購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng) 公司。
下述實(shí)施例中常規(guī)的基因操作參照分子克隆文獻(xiàn)進(jìn)行Sambook J, FretsE F， Mannsdes T et al. In :Molecular Cloning. 2nd ed.Cold Spring HarborLaboratory Press,1989。實(shí)施例1擬南芥幼苗RNA的抽提和cDNA合成(一 )試驗(yàn)方法1. RNA抽提及基因組DNA的去除稱取0. Ig植物材料倒入液氮使材料保持凍結(jié)和易碎的狀態(tài)，研磨。研磨后的細(xì)粉轉(zhuǎn)移至試劑盒中的緩沖液中，并按試劑盒操作說明提取RNA。RNA沉淀用50 μ 1 DEPC處理的去離子水輕柔溶解，用氯仿-異戊醇混合液抽提，以 除去殘留的少量基因組DNA，4°C，12000g離心30min。上清液轉(zhuǎn)移至另一新的管子，加入2倍體積_20°C冰冷的無水乙醇，充分混合，放 置在_20°C條件下2h，沉淀總RNA。12000g，4°C離心30min，用75wt%乙醇漂洗兩次，保留RNA，真空風(fēng)干。用20 μ IDEPC處理的去離子水重新熔解，取少量用于RNA質(zhì)量和濃度的檢測(cè)，其余 儲(chǔ)存與_70°C，備用。2. cDNA 合成加入Oligo (dT) 20 (IOpmol/μ 1)1μ 1 ；總 RNA IO-IOOng ；補(bǔ)足 RNase Free H2O 至Ij 12μ 1。65°C，5min后，立即置于冰上。再力口入 5 X RT Buffer 4 μ 1 ；dNTP Mixture (各 IOmM) 2 μ 1 ；RNase Inhibitor (10U/μ 1) 1 μ 1 ；反轉(zhuǎn)錄酶 1μ 1。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)?0°CIOmin ；42°C 20min ；85°C 5min ；4°C 5min。瞬間離心，保存。( 二)試驗(yàn)結(jié)果采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA產(chǎn)物的結(jié)果見圖1，圖中可見明顯的RNA條帶。實(shí)施例2PCR方法獲得擬南芥抗鹽、抗干旱的CPK蛋白激酶(AtCPK6)基因片段(一 )試驗(yàn)方法本發(fā)明設(shè)計(jì)一對(duì)引物(AtCPK6_F和AtCPK6_R)，為了克隆鑒定等構(gòu)建需要，引物兩 端分別引入Bam H I和Mc I的酶切位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)體系10 X PCR buffer 5. 0 μ 1 ；dNTPs (各 2. 5mM)4y 1 ；擬南芥 cDNA 模版 1 μ 1 (20ng)；引物 AtCPK6-F 0· 5 μ 1 ；引物 AtCPK6_R 0. 5 μ 1 ；Εχ-TaqO. 4 μ 1 (預(yù)變性后加 入)；加無菌水定容至50 μ 1。PCR反應(yīng)程序94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸2min，共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，再 72°C延伸 IOmin0( 二)試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過1. 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物為一條約1600bp的片段(參見圖 2)。
實(shí)施例3克隆鑒定、序列測(cè)定(一 )試驗(yàn)方法擴(kuò)增片段采用杭州維特潔生化技術(shù)有限公司DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后 克隆到大連寶生物工程有限公司的pMD-18-Simple T載體上進(jìn)行克隆鑒定和序列測(cè)定。本發(fā)明通過核苷酸序列測(cè)定分析，最終獲得擬南芥抗鹽、抗干旱蛋白激酶AtCPK6 基因，其堿基和氨基酸序列信息如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示。( 二)試驗(yàn)結(jié)果測(cè)序分析結(jié)果顯示擬南芥抗鹽、抗干旱的AtCPK6蛋白激酶基因編碼閱讀框長(zhǎng) 163^p，編碼的蛋白質(zhì)含544個(gè)氨基酸。實(shí)施例4擬南芥轉(zhuǎn)化(一 )試驗(yàn)方法1.農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備1)挑取農(nóng)桿菌單菌接種于5mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)20h。2)取ImL菌液轉(zhuǎn)接入20_30mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250 轉(zhuǎn) / 分鐘培養(yǎng)約 12h，測(cè) OD 600 ^ 1. 5。3)8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C，IOmin離心收集菌體，重懸于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化滲透液(5wt%蔗 糖，0. 05wt% Silwet L-77)并稀釋至 OD 600 ^ 0. 8。2.擬南芥蘸花法轉(zhuǎn)化1)將擬南芥的花薹浸入滲透液中，輕輕攪動(dòng)約IOs后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后，托盤 中加入水，用保鮮膜罩住擬南芥，以保持濕潤(rùn)環(huán)境，水平放置22°C避光培養(yǎng)，24h后去掉保
鮮膜直立培養(yǎng)。2)初次轉(zhuǎn)化四天后，可再進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化，重復(fù)兩次，總共轉(zhuǎn)化三次，這樣可以對(duì)花 序上發(fā)育的不同時(shí)期的花蕾進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率。3)生長(zhǎng)約兩個(gè)月后，收集種子，4°C冰箱儲(chǔ)存待用。( 二)試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過蘸花法轉(zhuǎn)化的擬南芥生長(zhǎng)約兩個(gè)月后，正常開花結(jié)子。實(shí)施例5擬南芥種子的篩選(一 )試驗(yàn)方法1)稱25-30mg種子放入1. 5ml離心管。2) Iml 75wt%乙醇消毒Imin (不停搖晃振蕩)，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5s，去上清。3)加入Iml過濾后的漂白粉(5wt% )消毒15min (不停搖晃振蕩，充分消毒)， 8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5s，去上清。4)無菌水洗滌3-4次。5)將種子均勻的播撒到V2MS平板(潮霉素50μ g/mL)上，Paraf i Im膜封口，4°C 冰箱放置兩天，220C，16h光照培養(yǎng)6天。
將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進(jìn)行GUS活性檢測(cè)，選出陽(yáng)性植株(Ttl)培 養(yǎng)至開花結(jié)實(shí)，收集Ttl植株上所結(jié)T1種子。實(shí)施例6CPK蛋白激酶(AtCPK6)轉(zhuǎn)化植株后的抗逆分析(一 )試驗(yàn)方法將轉(zhuǎn)基因擬南芥自交純和兩代，獲得3個(gè)純化轉(zhuǎn)化株系，收取種子。播種后，幼苗 生長(zhǎng)10-20天，分別用NaCl、PEG處理，觀察植株的耐鹽，耐干旱效果。(二)試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明野生型和轉(zhuǎn)AtCPK6基因擬南芥再存活率上有明顯的差異，轉(zhuǎn)基因植株 比野生型擬南芥抗鹽和干旱能力有明顯提高。經(jīng)過鹽、干旱處理的轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥 的存活率如表1所示。表1轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥的鹽、干旱處理后存活率
權(quán)利要求
1.一種來源于擬南芥的抗鹽、抗干旱的CPK蛋白激酶基因，其特征在于，其核苷酸序列 如SEQ ID No 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CPK蛋白激酶基因，其特征在于，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序 列如SEQ ID No 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CPK蛋白激酶基因，其特征在于，所述CPK蛋白激酶基因是 AtCPK6 基因。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的CPK蛋白激酶基因在制備抗鹽、抗干旱的轉(zhuǎn)基因植物 中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的CPK蛋白激酶基因在植物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來源于擬南芥的抗鹽、抗干旱的CPK蛋白激酶基因。所述CPK蛋白激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。該基因長(zhǎng)1635bp，含544個(gè)氨基酸，是AtCPK6基因。本發(fā)明的CPK蛋白激酶基因用于植物轉(zhuǎn)化，以提高植物對(duì)鹽、干旱的耐受性。
文檔編號(hào)C12N15/54GK102108364SQ200910200679
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 熊愛生, 田永生, 許晶, 趙偉, 高峰 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院