專利名稱：用于評價動物腸道微生物群落多樣性的dna提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的DNA提取方法。
背景技術：
動物腸道內(nèi)存在著大量的微生物菌群，這些微生物對機體的營養(yǎng)、免疫、生長發(fā)育等方面有著巨大的影響。它們的分離和鑒定對于研究腸道菌群功能及與機體的相互關系非常重要。傳統(tǒng)方法主要是把腸道微生物通過選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)后，再進行純菌的分類鑒定。該技術不僅費時、費力，只能檢測可培養(yǎng)微生物，而對腸道中大量未知的不可培養(yǎng)微生物無能為力。隨著近年來現(xiàn)代生物技術的快速發(fā)展，大量分子生物學技術應用于腸道微生態(tài)學研究中，從動物腸道中提取基因組DNA是非常有用的方法，可用于檢測不可培養(yǎng)的微生物，反映腸道微生物之間及微生物與宿主間的真實相互關系，使我們能夠?qū)δc道微生物有更完整的評價，也可以用來揭示腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)中的基因的多樣性及其隨腸道環(huán)境的變化。這就要求從動物糞便樣品中抽提和純化腸道微生物基因組DNA。通過對樣品中微生物基因組DNA的研究從而間接了解其中微生物的分布和組成情況。而建立高效、準確的DNA提取方法也成為了腸道微生物分子生態(tài)學研究的一個技術關鍵所在。
基因組DNA提取的主要目標是獲得最高的DNA回收，從而從微生物群落中獲得最具代表性的DNA，并進行進一步的分子操作(如PCR、 SSCP、 DGGE、 TGGE、 AFLP等)。但是來自動物腸道的樣品含有非常復雜的成分，尤其是脂類、酸類等有機物質(zhì)在基因組DNA提取過程中很難去除，直接影響后續(xù)的PCR擴增、雜交、內(nèi)切酶消化和細菌轉(zhuǎn)化等。此外，細胞裂解后粗提DNA的每一個純化步驟，例如在DNA分子研究之前進行的重復性純化步驟，不可避免的引起了 DNA的損失。大部分基因組DNA提取方法全都存在缺陷，例如細胞裂解不完全，DNA吸附于樣品表層，樣品提取物中含有酶抑制劑以及DNA的丟失、降解和剪切。另外，目前還大多沿用傳統(tǒng)的DNA制備方法，即酚/氯仿抽提法。該技術操作步驟復雜，樣品需要量大，DNA收率低，難以快速處理大量標本。另外，酚、氯仿等有機溶劑易造成環(huán)境污染，有損操作者的健康。 因此，需要研究適用于動物腸道微生物DNA提取的方便、快捷、實用的方法，以解決使用常規(guī)方法所獲得的DNA樣品存在酸類等PCR抑制物以及細胞裂解率低、DNA損失嚴重等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的DNA提取方法，以解決在于腸道微生物細胞裂解后，純化步驟存在污染物去除困難和DNA回收率低等問題。 為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案來實現(xiàn) —種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的DNA提取方法，包括以下步驟
(1)向0. l-5g動物糞便樣品中加入1. 5-10ml樣品浸洗液A，漩渦震蕩5_20分鐘
4分鐘，6000-15000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5-10分鐘，棄去上清液，重復3次。 (2)向由上述步驟(1)得到的樣品中加入1. 5ml樣品浸洗液B，冰上放置5_30分鐘，漩渦震蕩5-20分鐘分鐘，6000-15000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，重復3次。
(3)向由上述步驟(2)得到的樣品中加入O. l-lg石英砂和l-5粒直徑為4mm的玻璃珠，并加入978-5000 iil pH = 8. 0的磷酸緩沖液C到樣品中，漩渦震蕩2-10分鐘。
(4)向由上述步驟(3)得到的樣品懸濁液加入100-500 ii 1細胞裂解液D到樣品中，漩渦震蕩5-20分鐘，6000-15000rmp離心5-10min，沉淀碎片。 (5)將由上述步驟(4)得到上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入250-1500 iU蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5-10分鐘，8000-15000rmp離心3-10min以沉淀蛋白質(zhì)。 (6)將由上述步驟(5)得到上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (7)將由上述步驟(6)得到混合液加入2ml收集管中結(jié)合柱中，室溫放置l-5min，3000-10000rmp離心l_3min，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。 (8)將由上述步驟(7)收集管中結(jié)合柱放置在一個新的離心管中，加入500 iU洗滌液G到結(jié)合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (9)將由上述步驟(8)收集管中結(jié)合柱重新放回收集管中，并加入650 iU洗滌液H到結(jié)合柱中，8000-15000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次。
(10)將由上述步驟(9)收集管中結(jié)合柱重新放回收集管，8000-15000rmp離心l一5min。 (11)將由上述步驟(10)收集管中結(jié)合柱裝入新的1.5ml離心管中，室溫放置，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30-50 iU洗脫液I，不要戳破膜，室溫放置2min，8000-15000rmp離心l-3min，離心管中即為分離的DNA，貯存于_20°C 。其中洗脫液I為0.lmM Tris-HCl， pH = 9. 0。 其中，上述提取方法中，所述樣品浸提液A由20-400mM Tris、 15_200mMEDTA、50-250mM NaCl、5wt % TEEP0L組成，pH = 8. 0-10 ;優(yōu)選由40mM Tris、60mM EDTA、150mMNaCl、5wt% TEEP0L組成，pH = 9. 5。 所述樣品浸提液B為60-95wt^的乙醇；優(yōu)選80wt^乙醇。 所述細胞裂解液D由lwt% SDS、20-60mM Tris、 100_200慮NaCl、40-100mM EDTA、0. 1XPVP組成，pH二8.0 ;優(yōu)選由lwt%SDS、40mM Tris、150mM NaCl、60mM EDTA、0. 1%PVP組成，pH二 8.0。 所述蛋白去除液E由2-5M KAc、2-8wt^冰醋酸組成；優(yōu)選由3M KAc、4wt^冰醋酸組成。所述DNA聯(lián)接液F由6-10M異硫氰酸胍、200-600mM醋酸鉀組成，pH為4. 5_6. 0 ;
優(yōu)選由8M異硫氰酸胍、500mM醋酸鉀組成，pH = 5. 5。 所述洗滌液G由5. 5M異硫氰酸胍、23mM檸檬酸鈉組成。 所述洗滌液H由70wt%乙醇、200mM醋酸鉀組成，pH = 5. 0。 本發(fā)明的提取方法，具有以下優(yōu)點
1.本發(fā)明所述的DNA提取方法操作簡單，不需要較為復雜的設備，常規(guī)生物化學或微生物學實驗室就可完成；并且涉及的試劑均為常規(guī)分析、分子生物學使用的試劑，相對于市場上的試劑盒成本低。 2.本發(fā)明所述的DNA提取方法是在細胞裂解以前對樣品進行前處理，將胞外DNA及污染物進行去除，避免了純化步驟存在污染物去除困難和DNA回收率低的問題。
3.本發(fā)明所述的DNA提取方法適用性強，提取的腸道微生物DNA的0D260/0D230及0D260/0D280接近標準值，可直接應用于分子操作，來評價動物腸道微生物群落多樣性。
4.提取過程不使用酚、氯仿，減少對實驗人員的身體健康傷害、所獲DNA完整，分子片段大于10kb，產(chǎn)量高。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術方案。Tris (三羧基甲基氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)、NaCl、乙醇、SDS(十二烷基
硫酸鈉)、PVP (聚乙烯基吡咯烷酮，百分含量單位g/L) 、 TEEPOL (仲烷基硫酸鈉與烷基苯磺
酸鈉的混合物)、KAc(醋酸鉀)、冰醋酸、異硫氰酸胍、醋酸鉀、檸檬酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分
析純藥品。 實施例1 (1)向0. 5g小白鼠動物糞便樣品，加入1. 5ml樣品浸洗液A，漩渦震蕩10分鐘，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，重復3次。 (2)加入1. 5ml樣品浸洗液2，冰上放置5分鐘，漩渦震蕩10分鐘，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，重復3次。 (3)加入0. 3g石英砂和1粒直徑為4mm的玻璃珠，并加入978 y 1磷酸緩沖液C (pH=8. 0)到樣品中。漩渦震蕩5分鐘。 (4)加入122 ill細胞裂解液D到樣品中，漩渦震蕩5-20分鐘。13000rmp離心lOmin，沉淀碎片。 (5)將上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入250ia蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rmp離心5min。 (6)將上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (7)將混合液加入2ml收集管中結(jié)合柱中，室溫放置2min。 6000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。 (8)將結(jié)合柱放置在一個新的離心管中，加入500ii1洗滌液G到結(jié)合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (9)將結(jié)合柱重新放回收集管中，并加入650ii1洗滌液H到結(jié)合柱中，13000rpm
離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次。 (10)將結(jié)合柱重新放回收集管，13000rmp離心2min。 (11)將結(jié)合柱裝入新的1. 5ml離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30-2 iil洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2min。 13000rmp離心lmin，離心管中即為分離的DNA，貯存于-20°C 。 以上溶液的加入量均可根據(jù)提取樣品的量的增加，而成比例增加。用分光光度計測定0D23。、 0D26。和0D28。，結(jié)果表明OD26。/OD23。 = 2. O3， OD26。/OD280 =
1. 84，接近于標準值(注OD26。/OD23。標準值為2. 0， OD26。/OD28。標準值為1.6)，可直接應用于
分子操作，來評價評價動物腸道微生物群落多樣性。
實施例2 (1)向O. 5g大鼠糞便樣品，加入1. 5ml樣品浸洗液A，漩渦震蕩10分鐘分鐘，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，重復3次。 (2)加入1. 5ml樣品浸洗液2，冰上放置5分鐘，漩渦震蕩10分鐘分鐘，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，重復3次。 (3)加入0. 3g石英砂和1粒直徑為4mm的玻璃珠，并加入978 y 1磷酸緩沖液C (pH=8. 0)到樣品中。漩渦震蕩5分鐘。 (4)加入122 ill細胞裂解液D到樣品中，漩渦震蕩5-20分鐘。13000rmp離心lOmin，沉淀碎片。 (5)將上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入250ia蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rmp離心5min。 (6)將上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (7)將混合液加入2ml收集管中結(jié)合柱中，室溫放置2min。 6000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。 (8)將結(jié)合柱放置在一個新的離心管中，加入500ii1洗滌液G到結(jié)合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (9)將結(jié)合柱重新放回收集管中，并加入650ii1洗滌液H到結(jié)合柱中，13000rpm
離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次。 (10)將結(jié)合柱重新放回收集管，13000rmp離心2min。 (11)將結(jié)合柱裝入新的1. 5ml離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30-50 ii 1洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2min。 13000rmp離心lmin，離心管中即為分離的DNA，貯存于-20°C 。 以上溶液的加入量均可根據(jù)提取樣品的量的增加，而成比例增加。用分光光度計測定0D23。、 0D26。和0D28。，結(jié)果表明OD26。/OD23。 = 2. O9， OD26。/OD280 =
1. 87，接近于標準值(注OD，/OD，標準值為2. O，OD，A)D，標準值為1. 6)，可直接應用于
分子操作，來評價評價動物腸道微生物群落多樣性。
實施例3 (1)向O. 5g家兔糞便樣品，加入1. 5ml樣品浸洗液A，漩渦震蕩IO分鐘分鐘，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，重復3次。 (2)加入1. 5ml樣品浸洗液2，冰上放置5分鐘，漩渦震蕩10分鐘分鐘，10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，重復3次。 (3)加入0. 3g石英砂和1粒直徑為4mm的玻璃珠，并加入978 y 1磷酸緩沖液C (pH
7=8. 0)到樣品中。漩渦震蕩5分鐘。 (4)加入122 iil細胞裂解液D到樣品中，漩渦震蕩5-20分鐘。13000rmp離心10min，沉淀碎片。 (5)將上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入250iU蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rmp離心5min。 (6)將上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (7)將混合液加入2ml收集管中結(jié)合柱中，室溫放置2min。 6000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。 (8)將結(jié)合柱放置在一個新的離心管中，加入500ii1洗滌液G到結(jié)合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (9)將結(jié)合柱重新放回收集管中，并加入650ii1洗滌液H到結(jié)合柱中，13000rpm
離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次。 (10)將結(jié)合柱重新放回收集管，13000rmp離心2min。 (11)將結(jié)合柱裝入新的1. 5ml離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30-50 ii 1洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2min。 13000rmp離心lmin，離心管中即為分離的DNA，貯存于-20°C 。 以上溶液的加入量均可根據(jù)提取樣品的量的增加，而成比例增加。
用分光光度計測定0D23。、 0D26。和0D28。，結(jié)果表明OD26。/OD23。 = 2. O5， OD26。/OD280 =1. 82，接近于標準值(注OD，/OD，標準值為2. O，OD，A)D，標準值為1. 6)，可直接應用于分子操作，來評價評價動物腸道微生物群落多樣性。 最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
權(quán)利要求
一種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟(1)向0.1-5g動物糞便樣品中加入1.5-10ml樣品浸洗液A，漩渦震蕩5-20分鐘分鐘，6000-15000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5-10分鐘，棄去上清液，重復3次；(2)向由上述步驟(1)得到的樣品中加入1.5ml樣品浸洗液B，冰上放置5-30分鐘，漩渦震蕩5-20分鐘分鐘，6000-15000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，重復3次；(3)向由上述步驟(2)得到的樣品中加入0.1-1g石英砂和1-5粒直徑為4mm的玻璃珠，并加入978-5000μl pH＝8.0的磷酸緩沖液C到樣品中，漩渦震蕩2-10分鐘；(4)向由上述步驟(3)得到的樣品懸濁液加入100-500μl細胞裂解液D到樣品中，漩渦震蕩5-20分鐘，6000-15000rmp離心5-10min，沉淀碎片；(5)將由上述步驟(4)得到上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入250-1500μl蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5-10分鐘，8000-15000rmp離心3-10min以沉淀蛋白質(zhì)；(6)將由上述步驟(5)得到上清轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻1-5min；(7)將由上述步驟(6)得到混合液加入2ml收集管中結(jié)合柱中，室溫放置1-5min，3000-10000rmp離心1-3min，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢；(8)將由上述步驟(7)收集管中結(jié)合柱放置在一個新的離心管中，加入500μl洗滌液G到結(jié)合柱中，13000rmp離心1min，倒掉收集管中的廢液；(9)將由上述步驟(8)收集管中結(jié)合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗滌液H到結(jié)合柱中，8000-15000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復上述步驟一次；(10)將由上述步驟(9)收集管中結(jié)合柱重新放回收集管，8000-15000rmp離心1-5min；(11)將由上述步驟(10)收集管中結(jié)合柱裝入新的1.5ml離心管中，室溫放置，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30-50μl洗脫液I，不要戳破膜，室溫放置2min，8000-15000rmp離心1-3min，離心管中即為分離的DNA，貯存于-20℃，其中洗脫液I為0.1mM Tris-HCl，pH＝9.0。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的提取方法，其特征在于，所述樣品浸提液A由20-400mM Tris、15-200mM EDTA、50-250mM NaCl、5wt% TEEP0L組成，pH = 8. 0-10。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述樣品浸提液A優(yōu)選由40mM Tris、60mM EDTA、150mMNaCl、5wt% TEEPOL組成，pH = 9. 5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述樣品浸提液B為60-95wt^的乙醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述浸提液B優(yōu)選為80wt %乙醇。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述細胞裂解液D由lwt% SDS、20-60mM Tris、100-200mM NaCl、40-100mM EDTA、0. 1% PVP組成，pH = 8. 0。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述胞裂解液D優(yōu)選由lwt% SDS、40mM Tris、150mM NaCl、60mM EDTA、0. 1 % PVP組成，pH = 8. 0。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述蛋白去除液E由2-5M KAc、 2-8wt^冰醋酸組成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述蛋白去除液E優(yōu)選由3M KAc、 4wt^冰醋酸組成。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述DNA聯(lián)接液F由6-10M異硫氰 酸胍、200-600mM醋酸鉀組成，pH為4. 5_6. 0。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的提取方法，其特征在于，所述DNA聯(lián)接液F優(yōu)選由8M異硫 氰酸胍、500mM醋酸鉀組成，pH = 5. 5。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述洗滌液G由5. 5M異硫氰酸胍、 23mM檸檬酸鈉組成。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述洗滌液H由70wt^乙醇、200mM 醋酸鉀組成，pH = 5.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于評價動物腸道微生物群落多樣性的DNA提取方法。在細胞裂解以前先對樣品進行前處理，將胞外DNA及污染物進行去除，避免了純化步驟存在污染物去除困難和DNA回收率低的問題。本發(fā)明提取過程不使用酚、氯仿，減少了對實驗人員的身體健康傷害、所獲DNA完整，分子片段大于10kb，產(chǎn)量高。所提取的腸道微生物DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近標準值，可直接應用于分子操作，以評價動物腸道微生物群落多樣性。
文檔編號C12Q1/68GK101712953SQ20091020068
公開日2010年5月26日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者劉華, 吳瀟, 唐雪明, 朱宏, 王利剛, 王金斌, 蔣玲曦, 譚芙蓉, 趙凱, 陶世如 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院