專(zhuān)利名稱：用于評(píng)價(jià)植物根系微生物群落多樣性的土壤dna間接提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于評(píng)價(jià)植物根系微生物群落多樣性的土壤DNA間接提取方法。
背景技術(shù)：
大多數(shù)土壤微生物似乎極其適應(yīng)它所處的環(huán)境并在一般的實(shí)驗(yàn)室條件下是不能培養(yǎng)的。從自然環(huán)境中提取基因組DNA是非常有用的方法，可用于檢測(cè)不可培養(yǎng)的微生物，跟蹤某些目標(biāo)菌株或重組基因在自然環(huán)境中的行為；也可以用來(lái)揭示植物根際土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)中的基因的多樣性及其隨環(huán)境的變化。這就要求從環(huán)境樣品中抽提和純化土壤微生物基因組DNA。 基因組DNA提取的主要目標(biāo)是獲得最高的DNA回收，從而從微生物群落中獲得最具代表性的DNA，并進(jìn)行進(jìn)一步的分子操作(如PCR、SSCP、DGGE、TGGE、AFLP等)。但是來(lái)自環(huán)境中的樣品含有非常復(fù)雜的成分，尤其是土壤中的腐質(zhì)酸類(lèi)物質(zhì)在提取過(guò)程中不能去除掉，腐殖質(zhì)有類(lèi)似于核酸的物理化學(xué)性質(zhì)。因此，腐殖質(zhì)連同被吸附的有機(jī)分子一起與DNA共同被萃取。腐殖酸直接影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增、雜交、內(nèi)切酶消化和細(xì)菌轉(zhuǎn)化等。在大多數(shù)宏基因組研究中，分離出不含腐殖質(zhì)的宏基因組DNA，仍然是一個(gè)難題。此外，細(xì)胞裂解后粗提DNA的每一個(gè)純化步驟，例如在DNA分子研究之前進(jìn)行的重復(fù)性純化步驟，不可避免的引起了 DNA的損失。大部分基因組DNA間接提取方法全都存在缺陷，例如細(xì)胞裂解不完全，DNA吸附于土壤表層，土壤提取物中含有酶抑制劑以及DNA的丟失、降解和剪切。
因此，需要研究適用于植物根際土壤微生物DNA提取的方便、快捷、實(shí)用的方法，以解決使用常規(guī)方法所獲得的DNA樣品存在腐殖酸等PCR抑制物以及細(xì)胞裂解率低、DNA損失嚴(yán)重等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種用于評(píng)價(jià)植物根系微生物群落多樣性的土壤DNA間接提取方法，利用細(xì)菌的平均密度(1. liig/cm3)遠(yuǎn)小于土壤礦物質(zhì)的平均密度(2.6i!g/cn^)，在細(xì)胞裂解以前對(duì)樣品進(jìn)行前處理，將微生物細(xì)胞從它們土壤樣品中分離出來(lái)，以解決在于土壤微生物細(xì)胞裂解后，由于腐殖質(zhì)有類(lèi)似于核酸的物理化學(xué)性質(zhì)，純化步驟存在腐殖質(zhì)去除困難和DNA回收率低等問(wèn)題。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn) —種用于評(píng)價(jià)植物根系微生物群落多樣性的土壤DNA間接提取方法，包括以下步驟 (1)向0. l-5g 土壤樣品中加入0. l-5mL預(yù)冷的無(wú)菌水混勻后，漩渦震蕩5-20分鐘分鐘，然后加入0. l-5mL勻漿緩沖液A，漩渦震蕩5-20分鐘，低速(50-400g)室溫離心10min，收集上清液轉(zhuǎn)移至另一離心瓶中。 (2)向由上述步驟(1)得到的沉淀物中加入O. 2-10mL預(yù)冷的勻槳緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩5-20分鐘，低速(50-400g)室溫離心10min，取上清液，與步驟(1)所得上清液合并。 (3)將由上述步驟(2)得到的上清液，室溫下6000-15000rmp離心10-60分鐘以回收菌體細(xì)胞。 (4)向由上述步驟(3)得到的菌體細(xì)胞中加入l-150ml的洗滌液C，洗滌2_10分鐘，室溫下6000-15000rmp離心10-60分鐘以沉淀菌體細(xì)胞，其中洗滌液C為lg/L焦磷酸鈉。 (5)向由上述步驟(4)得到的菌體細(xì)胞加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K(20mg/ml)，37。C水浴10-40min，然后加入100-500 yl細(xì)胞裂解液D到樣品中，輕輕顛倒混勻1-10分鐘，6000-15000rmp離心5-10min，沉淀碎片。 (6)將由上述步驟(5)得到上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，加入250-1500 iU蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5-10分鐘，8000-15000rmp離心3-10min以沉淀蛋白質(zhì)。 (7)將由上述步驟(6)得到上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (8)將由上述步驟(7)得到混合液加入2ml收集管中結(jié)合柱中，室溫放置l-5min，3000-10000rmp離心l_3min，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。 (9)將由上述步驟(8)收集管中結(jié)合柱放置在一個(gè)新的離心管中，加入500 iU洗滌液G到結(jié)合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (10)將由上述步驟(9)收集管中結(jié)合柱重新放回收集管中，并加入650iU洗滌液H到結(jié)合柱中，8000-15000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復(fù)上述步驟一次。
(11)將由上述步驟(10)收集管中結(jié)合柱重新放回收集管，8000-15000rmp離心l一5min。 (12)將由上述步驟(11)收集管中結(jié)合柱裝入新的1.5ml離心管中，室溫放置，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30-50 iU洗脫液I，不要戳破膜，室溫放置2min，8000-15000rmp離心l-3min，離心管中即為分離的DNA，貯存于_20°C 。其中洗脫液I為0.lmM Tris-HCl， pH = 9. 0。 其中，上述提取方法中，所述勻槳緩沖液A由20-400mM Tris、 15_200mMEDTA、50-250mM NaC1、0. 5-3 % pvpp組成，pH = 6. 0-9. 0 ;優(yōu)選由200mM Tris、200mM EDTA、300mMNaCl、2% pvpp組成，pH = 7. 5。 所述勻槳緩沖液B為10-200mM Tris、5-100mM EDTA、25-150mM NaC1、0. 2-1. 5%pv卯組成，pH = 6. 0-9. 0 ;優(yōu)選由100mM Tris、100mM EDTA、 150mMNaCl、 1 % pvpp組成，pH=7. 5。所述細(xì)胞裂解液D由lwt% SDS、20-60mM Tris、 100_200慮NaCl、40-100mM EDTA組成，pH = 8. 0 ;優(yōu)選由1% SDS、40mM Tris、150mM NaCl、60mM EDTA組成，pH = 8. 0。
所述蛋白去除液E由2-5M KAc、2-8wt^冰醋酸組成；優(yōu)選由3M KAc、4wt^冰醋酸組成。所述DNA聯(lián)接液F由6-10M異硫氰酸胍、200-600mM醋酸鉀組成，pH為4. 5-6. 0 ;優(yōu)選由8M異硫氰酸胍、500mM醋酸鉀組成，pH = 5. 5。
所述洗滌液G由5. 5M異硫氰酸胍、23mM檸檬酸鈉組成。
所述洗滌液H由70wt%乙醇、200mM醋酸鉀組成，pH = 5. 0。
本發(fā)明的間接提取方法，具有以下優(yōu)點(diǎn) 1.本發(fā)明所述的DNA間接提取方法操作簡(jiǎn)單，不需要較為復(fù)雜的設(shè)備，常規(guī)生物化學(xué)或微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室就可完成；并且涉及的試劑均為常規(guī)分析、分子生物學(xué)使用的試劑，相對(duì)于市場(chǎng)上的試劑盒成本低。 2.本發(fā)明所述的DNA間接提取方法是在細(xì)胞裂解以前對(duì)樣品進(jìn)行前處理，將微生物細(xì)胞從它們土壤樣品中分離出來(lái)，避免了純化步驟存在腐殖質(zhì)去除困難和DNA回收率低的問(wèn)題。 3.本發(fā)明所述的DNA間接提取方法適用性強(qiáng)，提取的土壤微生物DNA的OD26。/OD23。及OD26。/OD28。接近標(biāo)準(zhǔn)值，可直接應(yīng)用于分子操作，來(lái)評(píng)價(jià)植物根系微生物群落多樣性。
4.提取過(guò)程不使用酚、氯仿，減少對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的身體健康傷害、所獲DNA完整，分子片段大于10kb，產(chǎn)量高。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。 三羧基甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) 、 NaCl、乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、pvpp(交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮，百分含量單位g/L)、焦磷酸鈉、醋酸鉀(KAc)、冰醋酸、異硫氰酸胍、檸檬酸鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純藥品。
溶菌酶和蛋白酶K為上海生工進(jìn)口分裝。
實(shí)施例1 (1)向0. 5g西甜瓜根系土壤樣品中加入0. 5ml預(yù)冷的無(wú)菌水混勻后，漩渦震蕩10分鐘分鐘，然后加入0. 5ml勻漿緩沖液A，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，收集上清液轉(zhuǎn)移至另一離心瓶中。 (2)加入lml預(yù)冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，取上清液，合并所得上清液，室溫下10000rmp離心30分鐘以回收菌體細(xì)胞，棄上清。 (3)加入1. 5ml的洗滌液C，洗滌5分鐘，室溫下10000rmp離心30分鐘以沉淀菌體細(xì)胞。向菌體細(xì)胞加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K(20mg/ml) ， 37。C水浴30-40min，然后加入122 yl細(xì)胞裂解液D到樣品中，漩渦震蕩5_20分鐘。13000rmp離心10min，沉淀碎片。 (4)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，加入250ia蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rmp離心5min。 (5)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (6)將混合液加入2ml收集管中結(jié)合柱中，室溫放置2min。 6000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。
(7)將結(jié)合柱放置在一個(gè)新的離心管中，加入500ii1洗滌液G到結(jié)合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (8)將結(jié)合柱重新放回收集管中，并加入650ii1洗滌液H到結(jié)合柱中，13000rpm
離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復(fù)上述步驟一次。 (9)將結(jié)合柱重新放回收集管，13000rmp離心2min。 (10)將結(jié)合柱裝入新的1. 5ml離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30 ii 1洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2min。 13000rmp離心lmin，離心管中即為分離的DNA，貯存于-2(TC。 以上溶液的加入量均可根據(jù)提取樣品的量的增加，而成比例增加。用分光光度計(jì)測(cè)定OD23。、OD26。和0D28。，結(jié)果表明OD26。/OD23。 = 2. 00， OD26。/OD28。=
1. 81，接近于標(biāo)準(zhǔn)值(注OD，/OD，標(biāo)準(zhǔn)值為2. O，OD，A)D，標(biāo)準(zhǔn)值為1. 6)，可直接應(yīng)用于
分子操作，來(lái)評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)植物根系微生物群落多樣性。
實(shí)施例2 (1)向0. 5g草莓根系土壤樣品土壤樣品中加入0. 5ml預(yù)冷的無(wú)菌水混勻后，漩渦震蕩10分鐘分鐘，然后加入0. 5ml勻漿緩沖液A，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，收集上清液轉(zhuǎn)移至另一離心瓶中。 (2)加入lml預(yù)冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，取上清液，合并所得上清液，室溫下10000rmp離心30分鐘以回收菌體細(xì)胞，棄上清。 (3)加入1. 5ml的洗滌液C，洗滌5分鐘，室溫下10000rmp離心30分鐘以沉淀菌體細(xì)胞。向菌體細(xì)胞加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K(20mg/ml) ， 37。C水浴30-40min，然后加入122 yl細(xì)胞裂解液D到樣品中，漩渦震蕩5_20分鐘。13000rmp離心10min，沉淀碎片。 (4)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，加入250ia蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rmp離心5min。 (5)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (6)將混合液加入2ml收集管中結(jié)合柱中，室溫放置2min。 6000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。 (7)將結(jié)合柱放置在一個(gè)新的離心管中，加入500ia洗滌液G到結(jié)合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (8)將結(jié)合柱重新放回收集管中，并加入650ii1洗滌液H到結(jié)合柱中，13000rpm
離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復(fù)上述步驟一次。 (9)將結(jié)合柱重新放回收集管，13000rmp離心2min。 (10)將結(jié)合柱裝入新的1. 5ml離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30 ii 1洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2min。 13000rmp離心lmin，離心管中即為分離的DNA，貯存于-2(TC。 以上溶液的加入量均可根據(jù)提取樣品的量的增加，而成比例增加。
7[OOSO] 用分光光度計(jì)測(cè)定0D23。、 0D26。和0D28。，結(jié)果表明OD26。/OD23。 = 2. 01， OD26。/OD280 =1. 81，接近于標(biāo)準(zhǔn)值(注0D，/0D，標(biāo)準(zhǔn)值為2. O，OD，A)D，標(biāo)準(zhǔn)值為1. 6)，可直接應(yīng)用于
分子操作，來(lái)評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)植物根系微生物群落多樣性。
實(shí)施例3 (1)向0. 5g水稻根系上壤樣品中加入0. 5ml預(yù)冷的無(wú)菌水混勻后，漩渦震蕩10分鐘分鐘，然后加入O. 5ml勻漿緩沖液A，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，收集上清液轉(zhuǎn)移至另一離心瓶中。 (2)加入lml預(yù)冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，取上清液，合并所得上清液，室溫下10000rmp離心30分鐘以回收菌體細(xì)胞，棄上清。 (3)加入1. 5ml的洗滌液C，洗滌5分鐘，室溫下10000rmp離心30分鐘以沉淀菌體細(xì)胞。向菌體細(xì)胞加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K(20mg/ml) ， 37。C水浴30-40min，然后加入122 yl細(xì)胞裂解液D到樣品中，漩渦震蕩5_20分鐘。13000rmp離心10min，沉淀碎片。 (4)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，加入250ia蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rmp離心5min。 (5)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (6)將混合液加入2ml收集管中結(jié)合柱中，室溫放置2min。 6000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。 (7)將結(jié)合柱放置在一個(gè)新的離心管中，加入500ii1洗滌液G到結(jié)合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (8)將結(jié)合柱重新放回收集管中，并加入650ii1洗滌液H到結(jié)合柱中，13000rpm
離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復(fù)上述步驟一次。 (9)將結(jié)合柱重新放回收集管，13000rmp離心2min。 (10)將結(jié)合柱裝入新的1. 5ml離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30 ii 1洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2min。 13000rmp離心lmin，離心管中即為分離的DNA，貯存于-2(TC。 以上溶液的加入量均可根據(jù)提取樣品的量的增加，而成比例增加。用分光光度計(jì)測(cè)定0D23。、 0D26。和0D28。，結(jié)果表明OD26。/OD23。 = 2. 01， OD26。/OD280 =
1. 81，接近于標(biāo)準(zhǔn)值(注OD，/OD，標(biāo)準(zhǔn)值為2. O，OD，A)D，標(biāo)準(zhǔn)值為1. 6)，可直接應(yīng)用于
分子操作，來(lái)評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)植物根系微生物群落多樣性。
實(shí)施例4 (1)向0. 5g糯玉米根系土壤樣品中加入0. 5ml預(yù)冷的無(wú)菌水混勻后，漩渦震蕩10分鐘分鐘，然后加入0. 5ml勻漿緩沖液A，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，收集上清液轉(zhuǎn)移至另一離心瓶中。 (2)加入lml預(yù)冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩10分鐘，低速(250g)室溫離心10min，取上清液，合并所得上清液，室溫下10000rmp離心30分鐘以回收菌體細(xì)胞，棄
8上清。 (3)加入1. 5ml的洗滌液C，洗滌5分鐘，室溫下10000rmp離心30分鐘以沉淀菌體細(xì)胞。向菌體細(xì)胞加入160ul溶菌酶(50mg/ml)和20ul蛋白酶K(20mg/ml) ， 37。C水浴30-40min，然后加入122 細(xì)胞裂解液D到樣品中，漩渦震蕩5_20分鐘。13000rmp離心lOmin，沉淀碎片。 (4)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，加入250ia蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘，13000rmp離心5min。 (5)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻l-5min。 (6)將混合液加入2ml收集管中結(jié)合柱中，室溫放置2min。 6000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢。 (7)將結(jié)合柱放置在一個(gè)新的離心管中，加入500ii1洗滌液G到結(jié)合柱中，13000rmp離心lmin，倒掉收集管中的廢液。 (8)將結(jié)合柱重新放回收集管中，并加入650ii1洗滌液H到結(jié)合柱中，13000rpm
離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復(fù)上述步驟一次。 (9)將結(jié)合柱重新放回收集管，13000rmp離心2min。 (10)將結(jié)合柱裝入新的1. 5ml離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30 ii 1洗脫液I。不要戳破膜，室溫放置2min。 13000rmp離心lmin，離心管中即為分離的DNA，貯存于-2(TC。 以上溶液的加入量均可根據(jù)提取樣品的量的增加，而成比例增加。
用分光光度計(jì)測(cè)定0D23。、 0D26。和0D28。，結(jié)果表明OD26。/OD23。 = 2. 02， OD26。/OD280 =1. 81，接近于標(biāo)準(zhǔn)值(注OD，/OD，標(biāo)準(zhǔn)值為2. O，OD，A)D，標(biāo)準(zhǔn)值為1. 6)，可直接應(yīng)用于分子操作，來(lái)評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)植物根系微生物群落多樣性。 最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
權(quán)利要求
一種用于評(píng)價(jià)植物根系微生物群落多樣性的土壤DNA間接提取方法，其特征在于，包括以下步驟(1)向0.1-5g土壤樣品中加入0.1-5ml預(yù)冷的無(wú)菌水混勻后，漩渦震蕩5-20分鐘分鐘，然后加入0.1-5ml勻漿緩沖液A，漩渦震蕩5-20分鐘，低速50-400g室溫離心10min，收集上清液轉(zhuǎn)移至另一離心瓶中；(2)向由上述步驟(1)得到的沉淀物中加入0.2-10mL預(yù)冷的勻漿緩沖液B洗滌重懸，漩渦震蕩5-20分鐘，低速50-400g室溫離心10min，取上清液，與步驟(1)所得上清液合并；(3)將由上述步驟(2)得到的上清液，室溫下6000-15000rmp離心10-60分鐘以回收菌體細(xì)胞；(4)向由上述步驟(3)得到的菌體細(xì)胞中1-150ml的洗滌液C，洗滌2-10分鐘，室溫下6000-15000rmp離心10-60分鐘以沉淀菌體細(xì)胞，其中洗滌液C為1g/L焦磷酸鈉；(5)向由上述步驟(4)得到的菌體細(xì)胞加入160ul溶菌酶和20ul蛋白酶K，37℃水浴10-40min，然后加入100-500μl細(xì)胞裂解液D到樣品中，輕輕顛倒混勻1-10分鐘，6000-15000rmp離心5-10min，沉淀碎片；(6)將由上述步驟(5)得到上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，加入250-1500μl蛋白去除液E到管中，用手輕輕顛倒混勻10次，室溫放置5-10分鐘，8000-15000rmp離心3-10min以沉淀蛋白質(zhì)；(7)將由上述步驟(6)得到上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，加入3倍體積DNA聯(lián)接液F到離心管中，用手顛倒混勻1-5min；(8)將由上述步驟(7)得到混合液加入2ml收集管中結(jié)合柱中，室溫放置1-5min，3000-10000rmp離心1-3min，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入2ml離心管中，再次加入上清液離心，直至所有上清液離心完畢；(9)將由上述步驟(8)收集管中結(jié)合柱放置在一個(gè)新的離心管中，加入500μl洗滌液G到結(jié)合柱中，13000rmp離心1min，倒掉收集管中的廢液。(10)將由上述步驟(9)收集管中結(jié)合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗滌液H到結(jié)合柱中，8000-15000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，重復(fù)上述步驟一次；(11)將由上述步驟(10)收集管中結(jié)合柱重新放回收集管，8000-15000rmp離心1-5min；(12)將由上述步驟(11)收集管中結(jié)合柱裝入新的1.5ml離心管中，室溫放置，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30-50μl洗脫液I，不要戳破膜，室溫放置2min，8000-15000rmp離心1-3min，離心管中即為分離的DNA，貯存于-20℃。其中洗脫液I為0.1mM Tris-HCl，pH＝9.0。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液A由20-400mM Tris、15-200mM EDTA、50-250mM NaC1、0. 5-3% pvpp組成，pH = 6. 0-9. 0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液A優(yōu)選由200rnMTris、200mM EDTA、300mMNaCl、2% pvpp組成，pH = 7. 5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的提取方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液B由10-200mM Tris、5-100mM EDTA、25-150mM NaC1、0. 2-1. 5% pvpp組成，pH = 6. 0-9. 0。。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液B優(yōu)選由100mMTris、100mM EDTA、 150mMNaCl、 1 % pvpp組成，pH = 7. 5。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述細(xì)胞裂解液D由lwt% SDS、 20-60mM Tri s、100-200mM NaCl、40-100mM EDTA組成，pH = 8. 0。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述胞裂解液D優(yōu)選由1% SDS、40mM Tris、150mM NaCl、60mM EDTA組成，pH = 8. 0。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述蛋白去除液E由2-5M KAc、 2-8wt^冰醋酸組成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述蛋白去除液E優(yōu)選由3M KAc、 4wt^冰醋酸組成。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述DNA聯(lián)接液F由6-10M異硫氰 酸胍、200-600mM醋酸鉀組成，pH為4. 5_6. 0。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的提取方法，其特征在于，所述DNA聯(lián)接液F優(yōu)選由8M異硫 氰酸胍、500mM醋酸鉀組成，pH = 5. 5。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述洗滌液G由5. 5M異硫氰酸胍、 23mM檸檬酸鈉組成。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述洗滌液H由70wt^乙醇、200mM 醋酸鉀組成，pH二 5.0。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述溶菌酶濃度為50mg/mL，所述蛋 白酶K的濃度為20mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于評(píng)價(jià)植物根系微生物群落多樣性的土壤DNA間接提取方法。利用細(xì)菌的平均密度遠(yuǎn)小于土壤礦物質(zhì)的平均密度，在細(xì)胞裂解以前對(duì)樣品進(jìn)行前處理，將微生物細(xì)胞從它們土壤樣品中分離出來(lái)，避免了純化步驟存在腐殖質(zhì)去除困難和DNA回收率低的問(wèn)題。本發(fā)明提取過(guò)程不使用酚、氯仿，減少了對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的身體健康傷害、所獲DNA完整，分子片段大于10kb，產(chǎn)量高。所提取的土壤微生物DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近標(biāo)準(zhǔn)值，可直接應(yīng)用于分子操作，以評(píng)價(jià)植物根系微生物群落多樣件。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101717771SQ20091020068
公開(kāi)日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者劉華, 吳瀟, 唐雪明, 朱宏, 王利剛, 王金斌, 蔣玲曦, 譚芙蓉, 趙凱, 陶世如 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院