專利名稱：一種甘藍(lán)型油菜ap2/erf家族轉(zhuǎn)錄因子基因及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子 基因及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物一生面臨很多的生物和非生物脅迫，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，從而影響作 物的產(chǎn)量。植物在生長發(fā)育和對外界刺激的應(yīng)答反應(yīng)中，需要對各種逆境和發(fā)育信號作出 反應(yīng)，這就要求對各種功能基因的表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控。植物基因表達(dá)存在著精確的位置、時(shí) 間和空間上的次序性。研究表明導(dǎo)致這種基因表達(dá)差異的主要原因是轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水 平上的調(diào)節(jié)作用。植物通過一系列信號傳導(dǎo)激發(fā)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，從而啟動相應(yīng)功能基因 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最后通過基因產(chǎn)物對外界信號在生理生化等方面作出合適的響應(yīng)Yamaguchi 和Shinozaki，Annu Rev Plant Biol，2006，57 :781_803。很多基因被這些脅迫誘導(dǎo)表達(dá)， 以增強(qiáng)植物對逆境的抗性。轉(zhuǎn)錄因子是其中重要的一類調(diào)控基因，通過與順式元件相互作 用調(diào)節(jié)植物對各種環(huán)境脅迫的適應(yīng)。隨著分子生物學(xué)與生物技術(shù)的發(fā)展，人們從分子水平對植物抗逆境脅迫開展了 多方面的研究，其研究范圍主要集中在信號傳導(dǎo)及基因表達(dá)調(diào)控等方面Xiong等，Plant Cell,2002,14 :165_183。目前已經(jīng)從植物中分離克隆了數(shù)十類與提高逆境脅迫抗性相關(guān) 的功能基因Chinnusamy等，J Exp Bot，2004，55 :225_236。根據(jù)基因編碼產(chǎn)物的功能，可 將它們分成兩個(gè)大類(1)編碼直接保護(hù)細(xì)胞免受逆境脅迫傷害的功能蛋白的基因(如胚 胎發(fā)育晚期豐富LEA蛋白、抗凍蛋白、水通道蛋白、離子通道蛋白和伴侶蛋白等)，編碼滲透 調(diào)節(jié)因子合成酶的基因(如糖醇、脯氨酸、甜菜堿等)，編碼毒性物質(zhì)的降解酶的基因(如谷 胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及抗壞血酸過氧化物酶等)。抗逆相關(guān)功 能蛋白基因的克隆及功能研究，為通過基因工程改良植物的抗逆性開辟了新途徑。人們將 與提高逆境脅迫抗性相關(guān)的功能蛋白基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，使轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性有了不同 程度的提高。目前已經(jīng)通過LEA蛋白基因、脯氨酸合成酶基因及甜菜堿合成酶基因的轉(zhuǎn)化， 獲得了一些抗旱、耐鹽性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。(2)逆境脅迫下信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān) 的基因，包括感應(yīng)及轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號的蛋白激酶(如MAP激酶、CDP激酶、受體蛋白激酶、核 糖體蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白激酶等)，信號傳導(dǎo)中起重要作用的蛋白酶(如磷酸酯酶、磷 脂酶C等)，抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因有bZIP轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、MYC/MYB類、AREB 類及AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子等劉強(qiáng)等，科學(xué)通報(bào)，2000，45 :1465_1474。AP2/ERF家族是植 物中重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，包含一個(gè)高度保守的AP2-DNA結(jié)合域，其基因編碼的產(chǎn)物具有 廣泛的功能Okamuro 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997,94 :7076-7081 。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因，其堿基序列為SEQ ID No 1。所述轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQ ID No 2。所述甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因?yàn)?amp;iaERF-B3_8基因。所述&iaERF-B3_8基因編碼閱讀框由603bp組成，編碼成一個(gè)200個(gè)氨基酸的蛋 白質(zhì)。所述甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因在制備抗逆轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。所述甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因用于植物轉(zhuǎn)化。所述甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因的制備方法，包括以下步驟1)油菜cDNA文庫的構(gòu)建選取油菜幼苗提取總RNA，以總RNA為模板、Oligo (dT) 為引物，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。2)設(shè)計(jì)一對弓丨物正向引物 GGATCCATGGCAACTA TTGAGGAAATC,反向引物 GAGCTCTC AGAATTCGTTTGATGATGAATTGC ；以上述cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn) 錄因子基因&iaERF-B3-8基因片段。3)將上述擴(kuò)增片段回收后克隆入T載體，測序后即獲得油菜抗逆AP2/ERF家族轉(zhuǎn) 錄因子BnaERF-B3-8基因。上述制備方法的具體實(shí)驗(yàn)步驟如下1.油菜cDNA文庫的構(gòu)建本發(fā)明將油菜種子經(jīng)(VZV)NaOCl消毒后種植在黑土 珍珠巖蛭石 (1:1: 1)混合基質(zhì)中，22°C、1^1光照培養(yǎng)生長20d。選生長健壯的幼苗提取總RNA。以 總RNA為模板，Oligo (dT)為引物，參照東洋紡上海生物科技有限公司cDNA合成試劑盒說 明(http://www. bio-toyobo. cn/)，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。2.引物的設(shè)計(jì)與合成設(shè)計(jì)一對引物，引物兩端分別引入Bam HI和Me I的酶切位點(diǎn)。正向引物 GGATCCATGGCAACTA TTGAGGAAAT C ；反向引物 GAGCTCTCAGAATTCGTTTGATGATGAATTGC。引物 由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成(http://WWW. sangon. com/)。3. PCR方法獲得甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子&iaERF-B3_8基因片段PCR擴(kuò)增采用大連寶生物工程有限公司(http://takara. com. cn/)的PCR試劑，在 50 μ 1的體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸lOmin。經(jīng)過1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物為一條約 600bp的片段(參見圖1)。4.克隆鑒定與序列測定擴(kuò)增片段采用杭州維特潔生化技術(shù)有限公司(ymi axygen. com. cn/)DNA瓊脂糖 凝膠回收試劑盒，回收后克隆到大連寶生物工程有限公司(http://takara.com.cn/)的 pMD-18-Simple T載體上進(jìn)行克隆鑒定和序列測定。5.序列分析通過核苷酸序列測定分析，獲得甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子&iaERF-B3_8 基因片段，它具有如下的堿基和氨基酸序列信息。堿基序列1 ATGGCAACTATTGAGGAAATCTCTGATTTGGAGAAGCATCTCTTTGAAGACTTGATGATC
61CCTGATGGTTTCATGGAAGATTTTGTCTTTGATGACGCTGCTTTTTTCTCAGGACTCTGG
121TCTCTAGAACCCTTAAACCAAGTTCCTAAACAGGAGCCTAGTTCACCGGCTCTTGATCCA
181GATTTCTATGTCCAAGAGTTTCTGCAAATGGAAGCAGAATCATCATCATCAACAACAACA
241ACAACTACAACTACAACATCACCTGAGGTTGAAACTGTCTCAAACCGGAAAAGATCAAAG
301AGAGCTGAAGAGACAAGGCATTACAGAGGCGTGAGAAGGAGGCCATGGGGAAAATTCGCA
361GCAGAGATTCGAGATCCGGCGAAGAAAGGATCAAGGATTTGGCTAGGCACTTTTGAGAGT
421GATATTGATGCTGCAAGAGCTTATGACCATGAAGCTTTTAAGCTCGGGGGAAGAAAAGCT
481GTGCTCAACTTTCCTTTGGACGCAGGAAAGTATGATGCTCCGGTCAATTCTTGCCGGAAG
541AGGAGAAGAAACGATGTGCCGGAGCCTCAAGGAACAACTACGAGCAATTCATCATCAAAC
601TGA 氨基酸序列1MATIEEISDLEKHLFEDLMI
21PDGFMEDFVFDDAAFFSGLW
41SLEPLNQVPKQEPSSPALDP
61DFYVQEFLQMEAESSSSTTT
81TTTTTTSPEVETVSNRKRSK
101RAEETRHYRGVRRRPWGKFA
121AEIRDPAKKGSRIWLGTFES
141DIDAARAYDHEAFKLGGRKA
161VLNFPLDAGKYDAPVNSCRK
181RRRNDVPEPQGTTTSNSSSN本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的有益效果本發(fā)明克隆了甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因&iaERF-B3_8，為了進(jìn)一步 分析該基因在低溫逆境中的作用與功能，比較了轉(zhuǎn)&iaERF-B3-8基因的擬南芥植株和野 生型擬南芥植株對低溫脅迫的耐受性。結(jié)果表明野生型和轉(zhuǎn)&iaERF-B3-8基因擬南芥 植株在存活率上有明顯的差異，轉(zhuǎn)基因植株比野生型擬南芥有明顯的抗凍能力，這也表明 BnaERF-B3-8的轉(zhuǎn)入提高了擬南芥植株的抗低溫的能力。


圖1為瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2為轉(zhuǎn)&iaERF-B3_8基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株對低溫脅迫的耐受 性，其中A為轉(zhuǎn)&iaERF-B3-8基因的擬南芥植株，B為野生型擬南芥植株。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。下述實(shí)施例中，所用的試驗(yàn)材料及其來源分別如下雙低甘藍(lán)型油菜滬油15(Brassica napus L. Huyou 15)的種子經(jīng)過(ν/ν) NaOCl消毒后種植在黑土 珍珠巖蛭石(1 1 1)的基質(zhì)中，22°C，培養(yǎng)(16h光照，8h 黑暗，冷光源)生長20天。
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大腸桿菌(Escherichia coli)DH5 α和釀酒酵母菌株由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物 技術(shù)研究所植物基因工程研究室保存?？寺≥d體pMD-18-SimpleT、各類限制性內(nèi)切酶、 Taq聚合酶、連接酶、dNTP、10XPCR buffer和DNA marker購自寶生物工程大連有限公 司。所有的化學(xué)試劑都從美國西格瑪化學(xué)公司和上海國藥化學(xué)試劑公司購買。ABI PRIAM Big-DyeTerminator DNA測序試劑盒購自美國應(yīng)用系統(tǒng)公司。下述實(shí)施例中常規(guī)的基因操作參照分子克隆文獻(xiàn)進(jìn)行Sambrook J, Frets E F, Mannsdes T et al. In :Molecular Cloning. 2nd ed. Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989。實(shí)施例1雙低甘藍(lán)型油菜滬油15幼苗RNA的抽提和cDNA合成(一 )試驗(yàn)方法1、RNA 的抽提加入IOOmL提取緩沖液(油菜RNA提取緩沖液配方CTAB 3% (ff/V) ；PVP 3% (W/ V) (Mw 4000) ；EDTA 25mM ；NaCl 2.OM ；Tris-HClIOOmM, pH 8.0 ；Spermidine 0.5g/L ；DEPC 0. 1% (V/V) ；0. 1% DEPC 處理的 SDS 0. 5% (W/V) ；0. 1% DEPC 處理的 LiCl 10Μ)到 50mL 聚丙烯管，65°C預(yù)熱；稱取5g植物材料倒入液氮使材料始終保持凍結(jié)和易碎的狀態(tài)，研磨；研磨后細(xì)粉轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入65°C預(yù)熱的提取緩沖液的50mL離心管；將離心管放入65°C水浴45min，并偶爾搖動以混合各成分；加入等體積氯仿-異戊醇混合液，輕柔地上下顛倒混合約IOmin ；在18°C，于 12000g 離心 IOmin ；吸取上清液，重復(fù)5，6步驟操作；吸取上清液，加入1/4體積的10M LiCl溶液，徹底混勻，4°C放置12h ；在4"C，12000g 離心 30min ；RNA沉淀用500 μ L 0. 5% SDS輕柔溶解，用氯仿-異戊醇混合液抽提，4°C，12000g 離心30min ；上清液轉(zhuǎn)移至另一新的管子，加入2倍體積_20°C冰冷的無水乙醇，充分混合，放 置在_20°C條件下2h，沉淀總RNA ；12000g，4°C離心30min，用75%乙醇漂洗兩次，保留RNA，真空風(fēng)干；用200yL DEPC處理的去離子水重新溶解，取少量用于RNA質(zhì)量和濃度的檢測，其 余儲存于_70°C，備用。2、cDNA 合成加入01igo(dT)20(10pmol/y L) 1 μ 1 ；總 RNA :10 IOOng ；補(bǔ)足 RNase Free H20 至Ij 12 μ L。65°C，5min后，立即置于冰上。再加入5 X RT Buffer 4 μ L ；dNTP Mixture (各 IOmM) 2 μ L ；RNaseInhibitor (10U/ yL)lyL;反轉(zhuǎn)錄酶IyL0反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程為30°CIOmin ；42°C 20min ；85°C 5min ；4°C 5min。瞬間離心，保存。
( 二)試驗(yàn)結(jié)果采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA產(chǎn)物，結(jié)果可見明顯的RNA條帶。實(shí)施例2PCR方法獲得甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因&iaERF-B3_8基因片段(一 )試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)一對正向和反向引物，為了克隆鑒定等構(gòu)建的需要，引物兩端分別引入Bam HI和Me I的酶切位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)體系10 XPCR buffer 5. 0 μ L ;dNIPs (各 2. 5mM) 4 μ L ；雙低甘藍(lán)型油菜 滬油15的cDNA模板1 μ U20ng)；正向引物0. 5yL;反向引物0. 5yL ；Ex-Taq 0. 4 μ L(預(yù) 變性后加入)；加無菌水定容至50 μ L。PCR反應(yīng)程序94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延 伸lmin，共擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，再72°C延伸IOmin0( 二)試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物為一條約600bp的片段(參見圖1)。實(shí)施例3克隆鑒定、序列測定(一)試驗(yàn)方法擴(kuò)增片段采用杭州維特潔生化技術(shù)有限公司DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后 克隆到大連寶生物工程有限公司的pMD-18-Simple T載體上進(jìn)行克隆鑒定和序列測定。通過核苷酸序列測定分析，最終獲得甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因 &iaERF-B3-8基因，具有如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2的堿基和氨基酸序列信息(參見序 列表)。( 二)試驗(yàn)結(jié)果測序分析結(jié)果顯示甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因&iaERF-B3_8基因編碼 閱讀框由603bp組成，編碼成一個(gè)200個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。實(shí)施例4擬南芥轉(zhuǎn)化(一 )試驗(yàn)方法1.農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備1)挑取農(nóng)桿菌單菌接種于5mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)20h。2)取ImL菌液轉(zhuǎn)接入20_30mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50 μ g/mL,氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250 轉(zhuǎn) / 分鐘培養(yǎng)約 12h，測 OD 600 ^ 1. 5。3)8000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C，IOmin離心收集菌體，重懸于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化滲透液(5%蔗糖， 0. 05% Silwet L-77)并稀釋至 OD 600 ^ 0. 8。2.擬南芥蘸花法轉(zhuǎn)化1)將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約IOs后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后，托盤 中加入水，用保鮮膜罩住擬南芥，以保持濕潤環(huán)境，水平放置22°C避光培養(yǎng)，24h去掉保鮮
膜直立培養(yǎng)。2)初次轉(zhuǎn)化四天后，可再進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化，重復(fù)兩次，總共轉(zhuǎn)化三次，這樣可以對花序上發(fā)育的不同時(shí)期的花蕾進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率。3)生長約兩個(gè)月后，收集種子，4°C冰箱貯存待用。(二)試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過蘸花法轉(zhuǎn)化的擬南芥生長約兩個(gè)月后，正常開花結(jié)子。實(shí)施例5擬南芥種子的篩選(一)試驗(yàn)方法1)稱25-30mg種子放入1. 5mL離心管。2) ImL 75%乙醇消毒Imin (不停搖晃振蕩)，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5s，去上清。3)加入ImL過濾后的漂白粉(5% )消毒15min(不停搖晃振蕩，充分消毒)，8000 轉(zhuǎn)/分鐘離心&，去上清。4)無菌水洗滌3-4次。5)將種子均勻的播撒到V2MS平板(潮霉素50μ g/mL)上，Parafilm膜封口，4°C 冰箱放置兩天，220C，16h光照培養(yǎng)6天。6)將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進(jìn)行GUS活性檢測，選出陽性植株(Ttl) 培養(yǎng)至開花結(jié)實(shí)，收集Ttl植株上所結(jié)T1種子。實(shí)施例6轉(zhuǎn)錄因子基因&iaERF-B3-8轉(zhuǎn)化植物后的抗逆分析幼苗生長四周后將幼苗放置于_20°C冷凍處理50分鐘，然后于_4°C恢復(fù)M小時(shí) 后，在光照培養(yǎng)室恢復(fù)生長一周后拍照。結(jié)果表明野生型和轉(zhuǎn)甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因&iaERF-B3_8擬南 芥植株在幼苗期抗凍性能上有明顯的差異，轉(zhuǎn)基因植株比野生型擬南芥抗凍能力有明顯提 高(參見圖2)。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參 照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的 技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在 本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
0123]序列表0124]<110>上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院0125]<120> 一種甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因及其制備方法和應(yīng)用0126]<160>20127]<170>PatentIn version 3. 30128]<210>SEQ ID No 10129]<211>6030130]<212>DNA0131]<213> 甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)0132]<400>0133]1 ATGGCAACTATTGAGGAAATCTCTGATTTGGAGAAGCATCTCTTTGAAGACTTGATGATC0134]61 CCTGATGGTTTCATGGAAGATTTTGTCTTTGATGACGCTGCTTTTTTCTCAGGACTCTGG
121 TCTCTAGAACCCTTAAACCAAGTTCCTAAACAGGAGCCTAGTTCACCGGCTCTTGATCCA181 GATTTCTATGTCCAAGAGTTTCTGCAAATGGAAGCAGAATCATCATCATCAACAACAACA241 ACAACTACAACTACAACATCACCTGAGGTTGAAACTGTCTCAAACCGGAAAAGATCAAAG301 AGAGCTGAAGAGACAAGGCATTACAGAGGCGTGAGAAGGAGGCCATGGGGAAAATTCGCA361 GCAGAGATTCGAGATCCGGCGAAGAAAGGATCAAGGATTTGGCTAGGCACTTTTGAGAGT421 GATATTGATGCTGCAAGAGCTTATGACCATGAAGCTTTTAAGCTCGGGGGAAGAAAAGCT481 GTGCTCAACTTTCCTTTGGACGCAGGAAAGTATGATGCTCCGGTCAATTCTTGCCGGAAG541 AGGAGAAGAAACGATGTGCCGGAGCCTCAAGGAACAACTACGAGCAATTCATCATCAAAC601 TGA<210>SEQ ID No 2<211>200<212>PRT<213> 甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)<400>
0149]1MATIEEISDLEKHLFEDLMI0150]21PDGFMEDFVFDDAAFFSGLW0151]41SLEPLNQVPKQEPSSPALDP0152]61DFYVQEFLQMEAESSSSTTT0153]81TTTTTTSPEVETVSNRKRSK0154]101RAEETRHYRGVRRRPWGKFA0155]121AEIRDPAKKGSRIWLGTFES0156]141DIDAARAYDHEAFKLGGRKA0157]161VLNFPLDAGKYDAPVNSCRK0158]181RRRNDVPEPQGTTTSNSSSN
權(quán)利要求
1.一種甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄因子基因的堿 基序列為SEQ ID No 1，具體如下1 ATGGCAACTATTGAGGAAATCTCTGATTTGGAGAAGCATCTCTTTGAAGACTTGATGATC 61 CCTGATGGTTTCATGGAAGATTTTGTCTTTGATGACGCTGCTTTTTTCTCAGGACTCTGG 121 TCTCTAGAACCCTTAAACCAAGTTCCTAAACAGGAGCCTAGTTCACCGGCTCTTGATCCA 181 GATTTCTATGTCCAAGAGTTTCTGCAAATGGAAGCAGAATCATCATCATCAACAACAACA 241 ACAACTACAACTACAACATCACCTGAGGTTGAAACTGTCTCAAACCGGAAAAGATCAAAG 301 AGAGCTGAAGAGACAAGGCATTACAGAGGCGTGAGAAGGAGGCCATGGGGAAAATTCGCA 361 GCAGAGATTCGAGATCCGGCGAAGAAAGGATCAAGGATTTGGCTAGGCACTTTTGAGAGT 421 GATATTGATGCTGCAAGAGCTTATGACCATGAAGCTTTTAAGCTCGGGGGAAGAAAAGCT 481 GTGCTCAACTTTCCTTTGGACGCAGGAAAGTATGATGCTCCGGTCAATTCTTGCCGGAAG 541 AGGAGAAGAAACGATGTGCCGGAGCCTCAAGGAACAACTACGAGCAATTCATCATCAAAC 601 TGA。
2.如權(quán)利要求1所述的甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄基因編碼的蛋白質(zhì)，3ζ氨基酉I序列為SEQIDNo 2，具體如下1MATIEEISDLEKHLFEDLMI21PDGFMEDFVFDDAAFFSGLW41SLEPLNQVPKQEPSSPALDP61DFYVQEFLQMEAESSSSTTT81TTTTTTSPEVETVSNRKRSK101RAEETRHYRGVRRRPWGKFA121AEIRDPAKKGSRIWLGTFES141DIDAARAYDHEAFKLGGRKA161VLNFPLDAGKYDAPVNSCRK181RRRNDVPEPQGTTTSNSSSN。
3.如權(quán)利要求1所述的甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄 因子基因?yàn)锽naERF-B3-8基因。
4.如權(quán)利要求3所述的甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因，其特征在于，所述 BnaERF-B3-8基因編碼閱讀框由603bp組成，編碼成一個(gè)200個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因的方法，包括以下步驟1)油菜cDNA文庫的構(gòu)建選取油菜幼苗提取總RNA，以總RNA為模板、Oligo(dT)為引 物，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA ；2)設(shè)計(jì)一對弓丨物正向引物GGATCCATGGCAACTA TTGAGGAAATC,反向引物 GAGCTCTCAGAA TTCGTTTGATGATGAATTGC ；以上述cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因 子基因&iaERF-B3-8基因片段；3)將上述擴(kuò)增片段回收后克隆入T載體，測序后即獲得油菜抗逆AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因 子 BnaERF-B3-8 基因。
6.如要求1所述的甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因在制備抗逆轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
7.如要求1所述的甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因在植物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因及其制備方法和用途。所述甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因?yàn)锽naERF-B3-8，其堿基序列為SEQ ID No 1，其蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID No 2。本發(fā)明利用聚合酶擴(kuò)增技術(shù)從油菜幼苗中克隆甘藍(lán)型油菜AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子基因序列，所獲得的轉(zhuǎn)錄因子基因用于植物轉(zhuǎn)化，培育提高植物抗逆性。
文檔編號C12N15/10GK102094025SQ20091020101
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 熊愛生, 田永生, 趙偉, 金曉芬, 高峰 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院