專利名稱：熱穩(wěn)定脂肪酶,其編碼基因的表達(dá)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種突變的枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)來(lái)源的脂肪酶，其編碼基因，及含有該編碼基因的重組質(zhì)粒和用于表 達(dá)目標(biāo)脂肪酶蛋白的重組菌株；本發(fā)明還涉及所表達(dá)的熱穩(wěn)定脂肪酶的用途。
背景技術(shù)：
脂肪酶(lipase，EC3. 1. 1. 3，甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶，在動(dòng)植物組織及多 種微生物中普遍存在，其天然底物是生物產(chǎn)生的天然油脂，是最早被研究的酶類之一。自 1834年兔胰脂肪酶的活性報(bào)道至今，有關(guān)脂肪酶的研究已有上百年的歷史。20世紀(jì)初國(guó)外 科研人員首次發(fā)現(xiàn)了微生物脂肪酶。微生物脂肪酶種類多，比動(dòng)植物酶的作用PH、作用溫度 以及對(duì)底物的專一性類型更廣，便于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)和獲得高純度酶制劑，這些因素促進(jìn) 了微生物脂肪酶的研究，也極大地帶動(dòng)了脂肪酶在各領(lǐng)域中的基礎(chǔ)和實(shí)際應(yīng)用等方面的研 究。目前脂肪酶已經(jīng)成為重要的工業(yè)用酶之一。脂肪酶的應(yīng)用雖不如淀粉酶、蛋白酶廣泛，但在許多方面已顯示出不可估量的開(kāi) 發(fā)潛力。據(jù)報(bào)道，脂肪酶占總用酶頻度的25%左右。利用其天然底物長(zhǎng)鏈脂肪酸酷(各種 油脂等)，脂肪酶可在異相系統(tǒng)油-水界面或有機(jī)相中起作用，并且具有一定的位置專一 性。脂肪酶在國(guó)內(nèi)洗滌劑、制革、水產(chǎn)、飼料、生物化工、造紙、油脂化工、醫(yī)藥、環(huán)保等行業(yè)已 表現(xiàn)出十分重要的應(yīng)用潛力，目前許多工業(yè)生產(chǎn)中已大量使用了脂肪酶。另外脂肪酶以其 來(lái)源廣泛、催化功能多樣以及催化底物類型廣泛(酯、酸、醇、酸酐、酰胺等都可以成為它的 底物)等優(yōu)點(diǎn)也已經(jīng)使其成為生物技術(shù)及有機(jī)合成方面應(yīng)用最廣泛的一類酶。脂肪酶是一類作用于甘油酰基的酶，這類酶的活性包括兩個(gè)方面，專一性水解甘 油酯鍵，釋放更少酯鍵的甘油酯或甘油以及脂肪酸；在無(wú)水或少量水體系中催化水解的逆 反應(yīng)，即酯化反應(yīng)。脂肪酶溫和的操作條件，優(yōu)良的立體選擇性，以及保護(hù)環(huán)境等特點(diǎn)使它 在有機(jī)合成，脂肪性質(zhì)改良中有特殊的吸引力。但它應(yīng)用的主要障礙有兩點(diǎn)，一是成本高， 這一點(diǎn)已由固定化技術(shù)得到大大改進(jìn)；二是穩(wěn)定性與活性，這正是當(dāng)今生化研究集中解決 的問(wèn)題。脂肪酶應(yīng)用研究日益增加，采用它進(jìn)行的新型食品開(kāi)發(fā)也正成為眾多科學(xué)家的研 究的課題。脂肪酶應(yīng)用的現(xiàn)狀及前景可以歸結(jié)為(1)廣泛用來(lái)開(kāi)發(fā)新型生化轉(zhuǎn)移反應(yīng)，已 有上百種采用脂肪酶的生化反應(yīng)器報(bào)道，主要以固定化酶反應(yīng)器為多大大提高了反應(yīng)的得 率。( 它使用及建議使用的工業(yè)用途將大大超過(guò)蛋白酶和糖化酶的應(yīng)用。因此，脂肪酶的 重要之處是它們的潛在用途而不僅是目前的應(yīng)用水平。我國(guó)脂肪酶的研究?jī)H有40多年歷史，20世紀(jì)60年代末才有報(bào)道。1967年，中國(guó) 科學(xué)院微生物研究所篩選到一株解枝假絲酵母(Caudida lipolytica) AS2. 1203，并于1969 年制成酶制劑投放市場(chǎng)。20世紀(jì)70年代末我國(guó)開(kāi)始?jí)A性脂肪酶的研究，施巧琴于1981年 發(fā)表了我國(guó)第一篇關(guān)于堿性脂肪酶生產(chǎn)菌(Penicillium exansum)選育的研究論文，并且 于1984年首次在江蘇南通投人生產(chǎn)。進(jìn)人90年代，我國(guó)科技工作者緊跟國(guó)際研究熱點(diǎn)，脂 肪酶的研究進(jìn)人快速發(fā)展時(shí)期，這些都促進(jìn)和加快了我國(guó)脂肪酶領(lǐng)域的研究工作。
我國(guó)脂肪酶的研究在1995 2001年的7年間，基礎(chǔ)研究發(fā)展較快，其中以性質(zhì)研 究工作最多，醋合成及產(chǎn)酶條件的研究次之，而有關(guān)酶結(jié)構(gòu)功能、酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、分子生物 學(xué)等方面的研究相對(duì)較少，特別是結(jié)構(gòu)和性質(zhì)作為不可分割的兩個(gè)方面，現(xiàn)在卻產(chǎn)生了較 大的差距。我們知道結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，只有將性質(zhì)研究與結(jié)構(gòu)研究結(jié)合起來(lái)，才能整體上推動(dòng) 脂肪酶的基礎(chǔ)研究。產(chǎn)生這種不平衡現(xiàn)象的主要原因是這部分工作屬純基礎(chǔ)性的研究，與 過(guò)去我國(guó)的科研水平和宏觀導(dǎo)向有一定的關(guān)系。另外，脂肪酶的應(yīng)用研究在此期間呈現(xiàn)一 定的增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中以油脂化工、洗滌劑、生物化工方面居多，環(huán)保研究最少。我國(guó)脂肪酶的基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究有了較深入的開(kāi)展。我們還應(yīng)看到就微生物脂 肪酶而言，雖在產(chǎn)酶條件、性質(zhì)、酶促水解、合成、交換及工業(yè)應(yīng)用上研究了幾十年，但由于 脂肪酶結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的多樣性、酶的不穩(wěn)定性、底物的水不溶性和純化困難以及應(yīng)用范圍不 廣泛等問(wèn)題，使得其研究進(jìn)展與蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多也窄得多。我們?nèi)杂性S多工作 要做，結(jié)構(gòu)研究、動(dòng)力學(xué)研究、分子生物學(xué)研究仍是我們應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)的基礎(chǔ)理論研究，同時(shí) 還要重視成果的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化，加強(qiáng)應(yīng)用研究，加強(qiáng)環(huán)保方面的研究，使我國(guó)的脂肪酶研究在國(guó) 際上能逐漸占有重要位置。近年來(lái)，基因技術(shù)簡(jiǎn)化了下游加工，使微生物脂肪酶的產(chǎn)量增加了許多倍。而且引 入變性劑和誘導(dǎo)劑使我們有可能取得具有優(yōu)勢(shì)三維結(jié)構(gòu)的脂肪酶，因?yàn)槭褂谜T導(dǎo)劑和脂肪 酶生產(chǎn)出的產(chǎn)品具有專一性定向性和特殊的應(yīng)用。隨著研究的深入，脂肪酶的工業(yè)應(yīng)用將 不斷增加。因此，目前對(duì)于采用新方法獲得新型有工業(yè)價(jià)值的脂肪酶有潛在的需要。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種新的脂肪酶，以使其滿足工業(yè)上的需要。本發(fā)明的第一個(gè)方面公開(kāi)了一種分離的脂肪酶，其含有如SEQ ID NO 2所示的氨 基酸序列。在該方面的一個(gè)優(yōu)選例中，所述脂肪酶的氨基酸序列與SEQ IDNO :2具有至少有 至少50 %，優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少70 %，再優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至 少95%的相同性。在該方面的另一個(gè)優(yōu)選例中，該脂肪酶還包括其功能性片段。在該方面 的一個(gè)最優(yōu)選例中，該脂肪酶的氨基酸序列是SEQ ID NO :2。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種編碼上述脂肪酶的核酸分子。在一個(gè)優(yōu)選例 中，它具有如SEQ ID NO :1所示的核酸序列。在該方面的一個(gè)優(yōu)選例中，所述核酸分子與 SEQ ID NO: 2具有至少有至少50%，優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，再優(yōu)選至少80%，更 優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的相同性。在該方面的一個(gè)最優(yōu)選例中，該核酸分子的核 苷酸序列是SEQ ID NO :2ο在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了 一種載體，其包含上述多核苷酸。在本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供了一種細(xì)胞，其包含上述載體，或其基因組中整合有 上述多核苷酸。在本發(fā)明的第五個(gè)方面，提供了上述脂肪酶的用途，用于催化酯合成、手性拆分或 將植物油轉(zhuǎn)化為生物柴油。在本發(fā)明的第六個(gè)方面，提供了一種組合物，該組合物中含有上述脂肪酶和載體。 在該方面的一個(gè)優(yōu)選例中，載體選自食品上、工業(yè)上、藥用上的載體。在本發(fā)明的第七個(gè)方面，提供了一種生產(chǎn)上述脂肪酶的方法，包括培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)物中分離出表達(dá)產(chǎn)物。在本發(fā)明的第八個(gè)方面，提供了一種將植物油轉(zhuǎn)化為生物柴油的方法，包括用上 述脂肪酶處理植物油。在本發(fā)明的第九個(gè)方面，提供了一種催化酯合成的方法，包括在無(wú)水或少量水體 系中用上述脂肪酶催化酯化反應(yīng)。在本發(fā)明的第十個(gè)方面，提供了一種手性拆分的方法，包括用上述脂肪酶催化手 性拆分。


圖1 來(lái)自枯草芽孢桿菌的編碼脂肪酶的核酸序列Lip CelKSEQ ID NO 1)及其 編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。圖2 枯草芽孢桿菌來(lái)源的脂肪酶在質(zhì)粒pTrCHis2上的重組子結(jié)構(gòu)圖。圖3 大腸桿菌表達(dá)枯草芽孢桿菌來(lái)源的脂肪酶的最適反應(yīng)pH，以pH對(duì)相對(duì)酶活 力(％ )作圖。圖4 大腸桿菌表達(dá)枯草芽孢桿菌來(lái)源的脂肪酶的最適反應(yīng)溫度，以溫度對(duì)相對(duì) 酶活力(％ )作圖。圖5 大腸桿菌表達(dá)枯草芽孢桿菌來(lái)源的脂肪酶的pH穩(wěn)定性，以pH對(duì)殘余酶活力 (%)作圖。圖6 大腸桿菌表達(dá)枯草芽孢桿菌來(lái)源的脂肪酶的熱穩(wěn)定性，以溫度對(duì)殘余酶活 力(％)作圖。圖7 大腸桿菌表達(dá)枯草芽孢桿菌來(lái)源的脂肪酶發(fā)酵過(guò)程中樣品的SDS-PAGE電泳 圖。圖8 純化后大腸桿菌表達(dá)枯草芽孢桿菌來(lái)源的脂肪酶的SDS-PAGE電泳圖。圖9 純化后大腸桿菌表達(dá)枯草芽孢桿菌來(lái)源的脂肪酶的PAGE電泳圖。圖10 大腸桿菌表達(dá)枯草芽孢桿菌來(lái)源的脂肪酶對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性 隨時(shí)間變化的圖。圖11 脂肪酶催化酯合成的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。圖12 脂肪酶催化手性拆分的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。圖13 脂肪酶催化產(chǎn)生生物柴油的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。
具體實(shí)施例方式通過(guò)對(duì)枯草桿菌的篩選，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種新型脂肪酶，其熱穩(wěn)定性好，具有高度 的應(yīng)用性能。在此基礎(chǔ)上完成本發(fā)明。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原 始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和蛋白是沒(méi)有分離純化 的，但同樣的多聚核苷酸或蛋白如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化 的。如本文所用，“分離的脂肪酶”是指該脂肪酶基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋 白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化脂肪酶?；旧霞兊牡鞍自诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。脂肪酶的純度能用氨基酸序 列分析。本發(fā)明的脂肪酶可以是重組蛋白(多肽)、天然蛋白、合成蛋白，優(yōu)選重組蛋白。本 發(fā)明的脂肪酶可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真 核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所 用的宿主，本發(fā)明的脂肪酶可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的脂肪酶還可包 括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括脂肪酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生 物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然脂肪酶相同的生物學(xué)功能或活性的蛋白。本 發(fā)明的脂肪酶片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基 (優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的蛋白，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是 由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的蛋白，或(iii)成 熟蛋白與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋 白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前導(dǎo)序列或分泌序列或 用來(lái)純化此蛋白的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的 教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“脂肪酶”指具有脂肪酶活性的SEQ ID NO 2的氨基酸序列的蛋 白。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與脂肪酶相同功能的、SEQ ID NO :2序列的變異形式。這些變異形 式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-30個(gè)，較佳地1-20個(gè)，更佳地1-10個(gè)，最 佳地1-5個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè) (通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中， 用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和 /或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括脂肪酶的 活性片段和活性衍生物。該脂肪酶的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘 導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與脂肪酶的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用 抗脂肪酶的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他蛋白，如包含脂肪酶或其片段 的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的蛋白外，本發(fā)明還包括了脂肪酶的可溶性片段。通常，該片段 具有脂肪酶序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50 個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供脂肪酶的類似物。這些類似物與天然脂肪酶的差別可以是氨基酸序列 上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白包括天然或 誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn) 生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同 于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基 酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的脂肪酶并不限于上述例舉的代表性的 蛋白。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的蛋白的化學(xué)衍生形式如乙 酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的蛋白。這種修飾可以通過(guò)將蛋白暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng) 物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪 氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu) 化了溶解性能的蛋白。在本發(fā)明中，“脂肪酶保守性變異蛋白(多肽)”指與SEQ ID NO 2的氨基酸序列 相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似 或相近的氨基酸所替換而形成蛋白。這些保守性變異蛋白最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而 產(chǎn)生。表 權(quán)利要求
1.一種分離的脂肪酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.—種核酸分子，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的脂肪酶。
3.如權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于，其核酸序列如SEQID N0:1所示。
4.一種載體，其特征在于，所述的載體包含權(quán)利要求2所述的多核苷酸。
5.一種細(xì)胞，其特征在于，其包含權(quán)利要求3所述的載體，或其基因組中整合有權(quán)利要 求2所述的多核苷酸。
6.如權(quán)利要求1所述的脂肪酶的用途，其特征在于，用于催化酯合成、手性拆分或?qū)⒅?物油轉(zhuǎn)化為生物柴油。
7.一種組合物，其特征在于，所述組合物中含有權(quán)利要求1所述的脂肪酶和載體。
8.—種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的脂肪酶的方法，其特征在于，包括培養(yǎng)權(quán)利要求5所述 的細(xì)胞，從培養(yǎng)物中分離出表達(dá)產(chǎn)物。
9.一種將植物油轉(zhuǎn)化為生物柴油的方法，其特征在于，包括用權(quán)利要求1所述的脂肪 酶處理植物油。
10.一種催化酯合成的方法，其特征在于，在無(wú)水或少量水體系中用權(quán)利要求1所述的 脂肪酶催化酯化反應(yīng)。
11.一種手性拆分的方法，其特征在于，用權(quán)利要求1所述的脂肪酶催化手性拆分。
全文摘要
公開(kāi)了一種具有氨基酸序列SEQ ID NO2的分離的脂肪酶，其編碼序列，含有其的載體、細(xì)胞、和組合物，其制備方法，以及其用于催化酯合成、手性拆分或?qū)⒅参镉娃D(zhuǎn)化為生物柴油的用途。發(fā)明名稱為熱穩(wěn)定脂肪酶,其編碼基因的表達(dá)及其用途。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102102094SQ200910201210
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2009年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者葉秀云, 張洋, 羅鋆琳, 陳萍, 靳偉剛 申請(qǐng)人:福建福大百特科技發(fā)展有限公司