專利名稱：檢測(cè)解脲支原體的熒光pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外核酸檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種在臨床樣本中檢測(cè)解脲支原體感染 的熒光PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))試劑盒。
背景技術(shù)：
解脲支原體(ureaplasma urealyticum, UU)又被稱為解脲脲原體，是一種原核微 生物，為脲原體屬中唯一的一種，因生長需要尿素而得名。解脲支原體可以引起泌尿生殖道 感染，與女性生殖健康密切相關(guān)。解脲支原體是人類泌尿生殖道常見的共生微生物，為致病性比較弱的條件致病支 原體。在成人主要通過性接觸傳播，新生兒則由母親生殖道分娩時(shí)感染。成人男性的感染 部位在尿道粘膜，女性感染部位在宮頸。婦女妊娠后，由于孕激素的增加，抑制了細(xì)胞免疫， 集體抵抗力下降，更易受到解脲支原體的感染。主要引起非淋菌性尿道炎、子宮內(nèi)膜炎、絨 毛膜羊膜炎、自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、前列腺炎、睪丸炎、不育癥、低體重新生兒、新生兒肺炎、腦膜 炎以及敗血癥等。熒光PCR技術(shù)在1995年由美國PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高靈敏性、DNA 雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果直觀，能直接監(jiān)測(cè)PCR過程中的變化。與普 通PCR相比，其結(jié)果可實(shí)時(shí)觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測(cè)，完全閉管操作，有效地降低了 PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)。熒光PCR技術(shù)的熒光探針以發(fā)展形成多種類型，如Taqman探針，F(xiàn)RET探針等，本方 法涉及的是iTaqman探針技術(shù)。其工作原理是它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’一 3’ 酶切活性所降解，探針的5’端有一熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端有一熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)兩個(gè)基團(tuán)相互 先靠近的時(shí)候，由于發(fā)生能量傳遞作用，報(bào)告基團(tuán)不能發(fā)出熒光，但隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行， 5’端的報(bào)告基團(tuán)隨著探針的水解而脫落下來，不再與淬滅發(fā)生能量傳遞作用，從而能發(fā)出 熒光，被信號(hào)探測(cè)器所捕獲。常同探針5’端相結(jié)合的基團(tuán)有FAM(6-羧基熒光素)，TET(四 氯-6-羧基熒光素)，JOE 0，7- 二甲基-4，5- 二氯-6-羧基熒光素)，HEX (六氯-6-甲基熒 光素)或VIC等，常與3’端相結(jié)合的熒光淬滅基團(tuán)常為TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)或 DABCYL(4-(4’ -惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸)等。

發(fā)明內(nèi)容
為克服傳統(tǒng)方法(如電泳法等)對(duì)UU(解脲支原體)檢測(cè)的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一 種特異性高、成本低并且能夠作定性檢測(cè)的檢測(cè)產(chǎn)品。本發(fā)明提供了 一種定量檢測(cè)UU (解脲支原體)感染的熒光PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 試劑盒，包括定性參考品、陰性參考品、陽性對(duì)照品、UNG酶、Taq聚合酶、熒光PCR反應(yīng)液，以 及DNA提取液；所述的熒光PCR反應(yīng)液包括PCR引物、特異性熒光探針。所述的定性參考品為含有插入U(xiǎn)U特異序列的PMD18-T載體質(zhì)粒，所述的插入序列 如下
tgaagttagacgacaagttagggaatgctgaagtaatggacttagttattacaaacgcattaattcttg actacacaggtatctacaaagctgatatcggtattaaaaacggaaaaattg 120bpo所述的陽性參考品為存放濃度為1. OX IO6-L OX IO7拷貝/微升的重組質(zhì)粒。所述的陰性參考品為PMD18-T空載體質(zhì)粒稀釋液。所述的PCR引物序列如下擴(kuò)增檢測(cè)UU 的正向引物 TGAAGTTAGACGACAAGTTAGGGAATG 27 ；擴(kuò)增檢測(cè)UU 的反向引物 CAATTTTTCCGTTTTTAATACCGATATC 28;所述的特異性熒光探針序列如下檢測(cè)UU 的探針TAATGGACTTAGTTATTACAAACG 24;所述的特異性熒光探針為Taqman探針，標(biāo)記探針5’端的為一種熒光報(bào)告基團(tuán)，可 以是FAM、ΤΕΤ、JOE、VIC、HEX、ROX, TAMRA, CY3、CY5 ；3，端的為一種熒光淬滅基團(tuán)，可以是 TAMRA、DABCYL、BHQO、BHQ1、BHQ2。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果①定量準(zhǔn)確，兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu) 點(diǎn)，結(jié)果直觀，能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR過程中的變化。與普通PCR相比，其結(jié)果可實(shí)時(shí)觀察，產(chǎn)物不 需要凝膠電泳檢測(cè)，完全閉管操作，有效地降低了 PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)；②靈敏度和特異性高。由于采取特異性和引物和探針的雙保險(xiǎn)設(shè)計(jì)，靈敏度和特 異性均有很大提高，能在臨床癥狀出現(xiàn)之前檢測(cè)到病毒的感染；③檢測(cè)速度快，加上樣本提取總共僅需2-3個(gè)小時(shí)；④步驟簡單；⑤可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣本檢測(cè)。總之熒光PCR技術(shù)靈敏度高，特異性好，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)時(shí)間可控制在 兩個(gè)半小時(shí)以內(nèi)，而且是閉管操作，無需后續(xù)處理，可最大限度避免反應(yīng)產(chǎn)物污染，可以取 代傳統(tǒng)細(xì)胞檢測(cè)或者普通PCR檢測(cè)進(jìn)行UU的早期診斷。


圖1為UU陽性參考品的熒光PCR擴(kuò)增曲線曲線為陽性參考品曲線，陰性參考品 曲線；圖2為UU臨床樣本的熒光PCR擴(kuò)增曲線所測(cè)得的陽性參考品Ct值在20 觀 之間，陰性參考品Ct值為Undet,陽性樣本Ct值在20 38之間。
具體實(shí)施例方式應(yīng)當(dāng)理解，下面實(shí)施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員 常規(guī)采用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，或按照制造廠 商所建議的步驟和條件。實(shí)施例1 試劑盒的制備1.引物和探針設(shè)計(jì)與合成使用I^rimer Express 3. 0，針對(duì)UU的URE基因區(qū)，處于保守區(qū)的引物，在選擇好的 引物基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)UU的探針。引物與探針均委托專業(yè)公司(生工)合成，其中引物為PAGE純化，探針為HPLC純化，探針5，端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3，端標(biāo)記TAMRA熒光基團(tuán)。擴(kuò)增序列如表1:表1.特異性探針與引物序列
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)解脲支原體的熒光PCR試劑盒，包括陰性參考品、陽性參考品、UNG酶、Taq 聚合酶、熒光PCR反應(yīng)液，以及DNA提取液；所述的熒光PCR反應(yīng)液包括PCR引物、特異性熒 光探針。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性參考品為含有插入解脲支原 體特異序列的PMD18-T載體質(zhì)粒，所述插入的特異序列如下tgaagttaga cgacaagtta gggaatgctg aagtaatgga cttagttatt acaaacgcattaattcttga ctacacaggt atctacaaag ctgatatcgg tattaaaaac ggaaaaattg 120。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述的陽性參考品為存放濃度為 1. OX IO6-L OX IO7拷貝/微升的重組質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的陰性參考品為PMD18-T空載體質(zhì) 粒稀釋液。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的PCR引物序列如下擴(kuò)增檢測(cè)解脲支原體的正向引物TGAAGTTAGACGACAAGTTAGGGAATG 27 ；擴(kuò)增檢測(cè)解脲支原體的反向引物CAATTTTTCCGTTTTTAATACCGATATC 28。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的特異性熒光探針序列如下檢測(cè)解脲支原體的探針TAATGGACTTAGTTATTACAAACG 24。
7.如權(quán)利要求1或6所述的試劑盒，其特征在于，所述的特異性熒光探針為Taqman探 針，標(biāo)記探針5，端的為一種熒光報(bào)告基團(tuán)，可以是FAM、TET、J0E、VIC、HEX、R0X、TAMRA、CY3、 CY5 ；3，端的為一種熒光淬滅基團(tuán)，可以是TAMRA、DABCYL、BHQ0、BHQ1、BHQ2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)解脲支原體的熒光PCR試劑盒，屬于體外核酸診斷試劑盒領(lǐng)域。該試劑盒包括陽性參考品、陰性參考品、熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液、PCR引物和特異性熒光探針、PEG沉淀液、裂解液。本發(fā)明包括以熒光PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的PCR體系，包含針對(duì)解脲支原體URE基因序列的正、反向引物和熒光探針，在適合的PCR條件下可以檢測(cè)解脲支原體(UU)URE基因的核酸序列；可以簡便快速地在臨床樣本中檢測(cè)UU感染，特異性高。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102102121SQ20091020128
公開日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日
發(fā)明者汪寧梅, 穆宇豪, 穆海東, 黎颯 申請(qǐng)人:上海裕隆臨床檢驗(yàn)中心有限公司