專利名稱：一種l-鳥氨酸-l-天門冬氨酸鹽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸鹽的制備方法，尤其是涉及一種L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸 鹽的制備方法。
背景技術(shù)：
L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽是重要的醫(yī)藥，是肝硬化病營養(yǎng)補劑，促進尿素生成， 降低血氨，加速三羧酸循環(huán)，啟動細胞內(nèi)呼吸，改善肝功能，它是降低血氨的有效藥物用于 治療血氨過多癥。目前，對于L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的制備方法主要是L-鳥氨酸與L-天門冬 氨酸直接反應(yīng)后結(jié)晶，制備L-鳥氨酸是制備L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的關(guān)鍵。目前，國內(nèi)外對制備L-鳥氨酸的文獻報道不一，L-鳥氨酸的制備方法主要有三 種化學(xué)法、發(fā)酵法、酶解法。化學(xué)法目前工業(yè)上最常用的生產(chǎn)方法是采用化學(xué)水解L-精氨酸制備L-鳥 氨酸，1966年shell int. Rearsch采用丙稀酸和氰化鈉作為主要原料合成L-鳥氨酸。 (GB1020492,1966)。發(fā)酵法用腸桿菌中的某些菌類如 Escherichia coli，Aerobacter aerogenes, Proteusrettgeri和Proteus mirabili的突變菌株，進行發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸，發(fā)酵液 中 L-鳥氨酸最高為 15mg/ml, (GB1098348,1968 ；US39668072,1972)，Shibuya 等利用 Arthrobacter citreus23_2A的突變株發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸，發(fā)酵72h，產(chǎn)率為35. 2g/L。酶解法沈淑英等用糞鏈球菌ATCC8043，糞產(chǎn)堿桿菌ATCC21400，糞鏈球菌S-43游 離細胞轉(zhuǎn)化底物L-精氨酸制備L-鳥氨酸，轉(zhuǎn)化率95-100 %，提取收率為85-90 % (天津微 生物，1981，3 :28-38)。1995年，M Kyriakos等利用從動物肝臟中提取的精氨酸酶水解L-精 氨酸用于L-鳥氨酸鹽的制備(US5405761，1995)。因為上述L-鳥氨酸酶法生產(chǎn)過程都是利用游離細胞轉(zhuǎn)化底物L-精氨酸，所以轉(zhuǎn) 化液中會含有少量菌體蛋白和其他雜質(zhì)，不利于產(chǎn)物的分離純化；且轉(zhuǎn)化要去除菌體，降低 產(chǎn)物得率，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種操作簡單、精氨 酸轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)量高的固定化酶生產(chǎn)L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步 驟(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂，用碳酸鉀溶液浸泡6_18h后過濾，再將濾出的三 乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂與碳酸鉀、溴化氫按重量比為1 (0.1-0.6) (0.2-0. 5)配制成溶液，于冰浴中反應(yīng)5-60min，調(diào)節(jié)pH值至7_10，再加入精氨酸酶，使其與三乙醇胺陰離 子苯乙烯樹脂的重量比為(0.002-0.01) 1，于1-10°C反應(yīng)12-48h，洗滌后用飽和食鹽水 浸泡0. 5-3h，再利用去離子水洗凈至溶液中檢測不出氯離子，即得固定化酶，保存于水中；(2)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化將步驟(1)中制得的固定化酶與精氨酸、乙酸錳按重量比 1 (1-3) (0.004-0.02)混合，加入去離子水中，攪拌，采用L-天門冬氨酸調(diào)節(jié)PH值至 8. 8-9. 6，在30-50°C下，反應(yīng)15_18h得固定化酶混懸液；(3)產(chǎn)物提取及精制將步驟(2)中的固定化酶混懸液過濾后，向濾液中加L-天門冬氨酸、活性炭，于 30-70°C下攪拌反應(yīng)5-30min后，過濾，將濾液減壓濃縮，濃縮結(jié)束，加入醇類，攪拌0. 5_lh， 析出L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸，保溫3-5h，再經(jīng)降溫至20-25°C、離心、干燥即得產(chǎn)品。所述步驟(1)中的溶液中含三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂的重量百分濃度為 40-60g/mlo所述步驟⑴中的碳酸鉀為摩爾濃度1-5M的溶液，所述的溴化氫為重量百分濃度 l-4g/ml的溶液，所述的精氨酸酶為重量百分濃度l_4g/L的溶液。所述步驟(1)中調(diào)節(jié)pH采用摩爾濃度為0. 05-2M的碳酸氫鈉溶液。所述步驟(1)中洗滌過程是依次利用體積為100_400ml，濃度為0. 05-0. 3M的碳酸 氫鈉溶液、0. 5-4M的氯化鈉溶液及去離子水洗滌2-5次。所述步驟(2)中攪拌反應(yīng)的攪拌速度為60-200rpm，反應(yīng)終點利用高效液相 (HPLC)控制。所述步驟(3)中加入天門冬氨酸量為[(精氨酸量xO. 96) X 133/174]-(調(diào)pH所 用的L-天門冬氨酸量)，活性炭的加入量為2-5g/100ml濾液。所述步驟(3)中的濃縮后溶液中L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的重量百分數(shù)為 33-37%。所述步驟(3)中的醇類包括甲醇、乙醇或正丙醇。所述步驟(3)中加入醇類后的攪拌反應(yīng)的溫度為50-60°C。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)條件溫和、轉(zhuǎn)化體系中雜質(zhì)較少、 工藝步驟簡單、生產(chǎn)操作安全等優(yōu)點，采用本發(fā)明生產(chǎn)L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽純度高、 產(chǎn)量高，每升反應(yīng)溶液中含有300_320g的L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽，精氨酸的轉(zhuǎn)化率 95%以上。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1一種酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的方法，其特征在于，該方法包括如 下步驟(1)固定化酶的制備原料用量如下所示三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂50g、精氨酸酶400mg、飽和食鹽 水以能浸沒固定酶為準，取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂50g，用2M碳酸鉀溶液浸泡12h，過
4濾，濾干后，加入100ml 2M碳酸鉀溶液，于冰浴下加入IOml溴化氫(2g/ml)于冰浴下反應(yīng) 15min，其中三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂濃度為40g/ml。用冷0. IM碳酸氫鈉洗至pH值至 8. 5，加入精氨酸酶溶液IOOml (重量百分濃度為4g/l)，4°C反應(yīng)24h。依次用0. IM碳酸氫 鈉、IM氯化鈉，去離子水洗滌3次，每次200ml，再用飽和食鹽水浸泡固定化酶lh，最后利用 去離子水將其洗凈至檢測不出氯離子，保存于水中，備用；(2)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化將精氨酸60g、L_天門冬氨酸17g與乙酸錳0. 2g混合，溶于240g去離子水中得到 混合液，將步驟(1)中制得的濕固定化酶50. 4g加入混合液中，控制pH值為9. 6，攪拌速度 為80-120rpm，在38-40°C攪拌17h ；精氨酸轉(zhuǎn)化率達到95-98%，反應(yīng)15h，以高效液相控制 終點。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，濾餅(固相酶)保存于水中，下次備用；(3)產(chǎn)物提取及精制在步驟(2)過濾后的濾液中加入26. 5g L-天門冬氨酸，5g活性炭，40°C保溫攪拌 IOmin后，過濾，濾液濃縮至240g，停止?jié)饪s，滴入800g 95%乙醇，溫度控制在50-60°C攪拌 40min,料析出，繼續(xù)保溫3h，降溫至常溫離心，干燥得SOgL-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽。實施例2(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂40g，用IM碳酸鉀溶液浸泡8h，過濾并濾干后，加入 IOml IM碳酸鉀溶液，于冰浴下加入5ml溴化氫(lg/ml)于冰浴下反應(yīng)5min，用冷0. 05M碳 酸氫鈉洗至PH值至7，加入精氨酸酶溶液400ml (重量百分濃度為lg/Ι)于1°C反應(yīng)12h。 依次用0. 05M碳酸氫鈉溶液100ml、0. 5M氯化鈉溶液100ml，去離子水IOOml洗滌2次，最后 用飽和食鹽水浸泡固定化酶0. 5h，洗凈至溶液中檢測不出氯離子即制得固定化酶，保存于 水中，備用；(2)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化將精氨酸60g，L-天門冬氨酸18.5g與乙酸錳0.2g混合，溶于240g去離子水中 得到混合液，將步驟(1)中制得的濕固定化酶40. 5g加入混合液中，控制pH值為9. 4，在 42-45°C攪拌18h，以高效液相控制終點。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，濾餅(固相酶)保存于水中，下 次備用；(3)產(chǎn)物提取及精制在步驟(2)過濾后的濾液中加入25. Og L-天門冬氨酸，6g活性炭，50°C保溫攪拌 5min后，過濾，濾液濃縮至230g，停止?jié)饪s，滴入750g 95%乙醇，溫度控制在50-60°C攪拌 30min，將料析出，繼續(xù)保溫4h，降溫至常溫離心，干燥得82g L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽。 精氨酸轉(zhuǎn)化率達96%。實施例3(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂50g，用2M碳酸鉀溶液浸泡12h，過濾并濾干后，加 入100ml 2M碳酸鉀溶液，IOml溴化氫(2g/ml)于冰浴下反應(yīng)15min，用冷0. IM的冷碳酸氫 鈉洗至PH值至8. 5，加入精氨酸酶溶液IOOml (重量百分濃度為4g/l)于4°C反應(yīng)24h.。依 次用0. IM碳酸氫鈉溶液200ml、IM氯化鈉溶液200ml，去離子水200ml洗滌3次，最后用飽 和食鹽水浸泡固定化酶lh，洗凈至溶液中檢測不出氯離子即制得固定化酶，保存于水中，備用；(2)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化將精氨酸60g，L_天門冬氨酸20g與乙酸錳0. 2g混合，溶于240g去離子水中，將步 驟(1)中制得的固定化酶(濕)50. 4g加入混合液中，pH值9. 1，在45-47°C攪拌速度IOOrpm 的條件下反應(yīng)15h ；反應(yīng)結(jié)束后，過濾，濾餅(固相酶)保存于水中，下次備用；(3)產(chǎn)物提取及精制在步驟⑵過濾后的濾液中加入24. Og L-天門冬氨酸，8g活性炭，60°C保溫攪拌 IOmin后，過濾，濾液濃縮至230g，停止?jié)饪s，滴入700g95 %乙醇，溫度控制在50_6(TC攪拌 30min，料析出，繼續(xù)保溫5h，然后降溫至常溫離心，干燥得79g L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸 鹽，精氨酸轉(zhuǎn)化率達96%。實施例4(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂60g，用5M碳酸鉀溶液浸泡18h，過濾，濾干后，加入 150ml 4M碳酸鉀溶液，20ml溴化氫(4g/ml)于冰浴下反應(yīng)60min，用冷2M的冷碳酸氫鈉洗 至PH值至10，加入精氨酸酶溶液200ml (重量百分濃度為2g/l)于10°C反應(yīng)48h.。依次用 0. 3M碳酸氫鈉溶液400ml、4M氯化鈉溶液400ml，去離子水400ml洗滌5次，最后用飽和食 鹽水浸泡固定化酶3h，洗凈至溶液中檢測不出氯離子即制得固定化酶，保存于水中，備用；(2)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化將精氨酸60g，L_天門冬氨酸22g與乙酸錳0. 2g混合，溶于240g去離子水中，將步 驟(1)中制得的固定化酶(濕)60. 4g加入混合液中，PH值8.8，在47-50°C攪拌速度200rpm 的條件下反應(yīng)15h ；反應(yīng)結(jié)束后，過濾，濾餅(固相酶)保存于水中，下次備用。(3)產(chǎn)物提取及精制在步驟(2)過濾后的濾液中加入22. 5g，L-天門冬氨酸，IOg活性炭，65°C保溫攪 拌30min后，過濾，濾液濃縮至225g，L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽濃度為33%，停止?jié)饪s， 滴入800g95%乙醇，溫度控制在50-60°C攪拌45min，料析出，繼續(xù)保溫3h，降溫至25°C，離 心，干燥得82g L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽，精氨酸轉(zhuǎn)化率達97%。實施例5(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂50g，用5M碳酸鉀溶液浸泡6h，過濾并濾干后，加入 50ml 5M碳酸鉀溶液，IOml溴化氫(2g/ml)于冰浴下反應(yīng)35min，用冷0. 05M的冷碳酸氫鈉 洗至PH值至7，三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂濃度為60g/ml。加入精氨酸酶溶液IOOml (重 量百分濃度為4g/l)于4°C反應(yīng)24h。依次用0.05M碳酸氫鈉溶液400ml、4M氯化鈉溶液 IOOml，去離子水200ml洗滌3次，最后用飽和食鹽水浸泡固定化酶lh，洗凈至溶液中檢測不 出氯離子即制得固定化酶，保存于水中，備用；(2)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化將精氨酸50g，L-天門冬氨酸30g與乙酸錳0. 12g混合，溶于240g去離子水中， 將步驟(1)中制得的固定化酶(濕)30g加入混合液中，pH值為9. 1，在30-35°C攪拌速度 IOOrpm的條件下反應(yīng)15h;反應(yīng)結(jié)束后，過濾，濾餅(固相酶)保存于水中，下次備用；(3)產(chǎn)物提取及精制
在步驟⑵過濾后的濾液中加入20g L-天門冬氨酸，8g活性炭，L-天門冬氨酸 的加入量根據(jù)[(精氨酸量xO. 96)X133/174]_(調(diào)pH所用的L-天門冬氨酸量)公式計算 得到，60°C保溫攪拌IOmin后，過濾，濾液濃縮至230g，L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽濃度為 37%，停止?jié)饪s，滴入700g 95%的正丙醇，溫度控制在50-60°C攪拌30min，料析出，繼續(xù)保 溫5h，然后降溫至20°C，離心，干燥得75g L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽，精氨酸轉(zhuǎn)化率達 95%。
權(quán)利要求
1.一種L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)固定化酶的制備取三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂，用碳酸鉀溶液浸泡6_18h后過濾，再將濾出的三乙醇 胺陰離子苯乙烯樹脂與碳酸鉀、溴化氫按重量比為1 (0.1-0.6) (0. 2-0. 5)配制成溶 液，于冰浴中反應(yīng)5-60min，調(diào)節(jié)pH值至7_10，再加入精氨酸酶，使其與三乙醇胺陰離子苯 乙烯樹脂的重量比為(0.002-0.01) 1，于1-10°C反應(yīng)12-48h，洗滌后用飽和食鹽水浸泡 0. 5-3h，再利用去離子水洗凈至溶液中檢測不出氯離子，即得固定化酶，保存于水中；(2)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化將步驟(1)中制得的固定化酶與精氨酸、乙酸錳按重量比1 (1-3) (0. 004-0. 02) 混合，加入去離子水中，攪拌，采用L-天門冬氨酸調(diào)節(jié)pH值至8. 8-9.6，在30-501下，反應(yīng) 15-18h得固定化酶混懸液；(3)產(chǎn)物提取及精制將步驟(2)中的固定化酶混懸液過濾后，向濾液中加L-天門冬氨酸、活性炭，于 30-70°C下攪拌反應(yīng)5-30min后，過濾，將濾液減壓濃縮，濃縮結(jié)束，加入醇類，攪拌0. 5_lh， 析出L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸，保溫3-5h，再經(jīng)降溫至20-25°C、離心、干燥即得產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的制備方法，其特征在于， 所述步驟(1)中的溶液中含三乙醇胺陰離子苯乙烯樹脂的重量百分濃度為40-60g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的制備方法，其特征在于， 所述步驟(1)中的碳酸鉀為摩爾濃度1-5M的溶液，所述的溴化氫為重量百分濃度l-4g/ml 的溶液，所述的精氨酸酶為重量百分濃度l_4g/L的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的制備方法，其特征在于， 所述步驟(1)中調(diào)節(jié)PH采用摩爾濃度為0.05-2M的碳酸氫鈉溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的制備方法，其特征在于， 所述步驟(1)中洗滌過程是依次利用體積為100-400ml，濃度為0. 05-0. 3M的碳酸氫鈉溶 液、0. 5-4M的氯化鈉溶液及去離子水洗滌2-5次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的制備方法，其特征在于， 所述步驟(2)中攪拌反應(yīng)的攪拌速度為60-200rpm，反應(yīng)終點利用高效液相(HPLC)控制。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的制備方法，其特征在于， 所述步驟(3)中加入天門冬氨酸量為[(精氨酸量xO. 96) X 133/174]-(調(diào)pH所用的L-天 門冬氨酸量)，活性炭的加入量為2-5g/ml濾液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的制備方法，其特征在于， 所述步驟(3)中的濃縮后溶液中L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的重量百分數(shù)為33-37%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的制備方法，其特征在于， 所述步驟(3)中的醇類包括甲醇、乙醇或正丙醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的制備方法，其特征在于， 所述步驟(3)中加入醇類后的攪拌反應(yīng)的溫度為50-60°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽的制備方法，通過精氨酸酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽，包括以下步驟(1)固定化酶的制備，(2)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，(3)產(chǎn)物提取和精制工藝步驟。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)條件溫和、轉(zhuǎn)化體系中雜質(zhì)較少、工藝步驟簡單、生產(chǎn)操作安全、純度高，每升反應(yīng)溶液中含有300-320g的L-鳥氨酸-L-天門冬氨酸鹽，產(chǎn)量高、精氨酸的轉(zhuǎn)化率達95％以上等優(yōu)點。
文檔編號C12N11/08GK102102118SQ20091020144
公開日2011年6月22日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日
發(fā)明者周會友, 蘇建勇, 鄭南華 申請人:上海漢飛生化科技有限公司