專利名稱：：用傅立葉紅外光譜鑒別微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用傅立葉紅外光語鑒別微生物的方法。更具體地說，涉及一種用傅立葉紅外光鐠建立微生物鑒別模型并使用該模型鑒別藥品中的微生物、例如污染菌的方法。
背景技術(shù)：
：藥品中微生物的檢定是藥品質(zhì)量檢驗(yàn)的重要項(xiàng)目，該檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性直接決定其可信性。其中，微生物污染的檢驗(yàn)首先應(yīng)能確認(rèn)是否存在致病微生物。很多時(shí)候，還需進(jìn)一步確定所存在的致病微生物的種類。通常情況下，藥典，例如中國藥典，要求對(duì)藥品進(jìn)行微生物限度檢查(包括污染菌數(shù)測定和控制菌檢查)，規(guī)定的控制菌檢查包括大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和梭菌。藥典中對(duì)于以上六種控制菌的檢定方法主要為選擇性培養(yǎng)基結(jié)合顏色反應(yīng)和生化反應(yīng)來加以鑒別。該鑒定方法，也就是所謂的傳統(tǒng)方法存在著培養(yǎng)基復(fù)雜、鑒定程序繁瑣、鑒別周期長(需3-7天或更長)的缺陷，且鑒定結(jié)果帶有一定主觀性。另外，由于該類方法對(duì)于每一種細(xì)菌的鑒定并無通用的方法，難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化及計(jì)算機(jī)化。其他鑒定方法還有分子生物學(xué)方法，例如PCR、DNA(G+C)mol。/。值、DNA-DNA同源性分析、16SrRNA序列同源性分析等。這些方法的特異性好，靈敏度高，但需要專業(yè)人員完成，難以在普通實(shí)驗(yàn)室推廣。在此情況下，需要一種能夠?qū)λ幤分惺欠翊嬖谖廴疚⑸镞M(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒別并且操作簡便的鑒別方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種快速、準(zhǔn)確、操作簡便的微生物鑒別方法。本發(fā)明提供一種用傅立葉紅外光譜(FTIR)鑒別微生物的方法，該方法包括如下步驟a)培養(yǎng)對(duì)照微生物；b)采集對(duì)照微生物的紅外圖譜；c)在3000-2800cm1和1800至700cm1區(qū)間內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)譜段建立微生物鑒別模型；d)在與步驟a)中相同的條件下培養(yǎng)待測微生物；e)在與步驟b)中相同的條件下采集待測微生物的紅外圖鐠；i)將步驟e)中獲得的紅外圖鐠代入微生物鑒別模型中確定待測微生物的歸屬。本發(fā)明的方法不僅可以用于藥品中的污染微生物鑒定，也可以用于例如食品等其他領(lǐng)域的微生物鑒定?？杀昏b別的微生物包括但不限于上述藥典規(guī)定的六種菌以及與這些菌種在分類學(xué)上相近的菌種，例如以下的具體實(shí)施方式中提及的微生物。本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)快速鑒別，對(duì)待鑒別微生物的分類不需要用其他分類學(xué)方法進(jìn)行預(yù)選擇；方法特異性強(qiáng)，分類能按科、屬、種等單位進(jìn)行，甚至能夠區(qū)分到亞種、血清型水平；一旦建立了鑒別模型，鑒定微生物的成本極低。圖l表明腸桿菌科的DNA相關(guān)性，數(shù)字代表相關(guān)％;圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中采用的聚類分析鑒別方法及具體參數(shù)；圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的定性分析鑒別方法中的內(nèi)部圖鐠最大匹配值直方圖4是實(shí)施例2中同時(shí)采用本發(fā)明的聚類分析鑒別方法和定性分析鑒別方法的一種具體程序和結(jié)果判斷方法；圖5是實(shí)施例2中同時(shí)采用本發(fā)明的聚類分析鑒別方法和定性分析鑒別方法的另一種具體程序和結(jié)果判斷方法；圖6表明本發(fā)明方法對(duì)沙門氏菌在種以下進(jìn)行的區(qū)分。具體實(shí)施例方式本發(fā)明中提及的術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的含義。本發(fā)明中的"約"意味著在所述數(shù)值±5%范圍內(nèi)的數(shù)值也被包括在本發(fā)明中。本方法中使用的微生物來自CMCC:中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌管理保藏中心(NationalCenterformedicalculturecollections)、CSAR:國家細(xì)菌耐藥性監(jiān)領(lǐng)'J中心(NationalCenterforSurveillanceofAntimicrobialResistance)和CGMCC:中國普通微生物菌種保藏管理中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter)。1.對(duì)照微生物的選擇及對(duì)照微生物、待測微生物的培養(yǎng)和處理l.l對(duì)照微生物的選擇用于建立鑒別模型的對(duì)照微生物的種類包括待測微生物的種類，以及在紅外光i普法鑒別過程中易于與其混淆誤判的其他微生物種類，例如，在系統(tǒng)分類學(xué)中與待測微生物親緣關(guān)系較近的其他微生物，且其種類歸屬明確。在確定對(duì)照微生物種類后，選擇該微生物類別中盡可能多種類的微生物，采集其紅外光謙數(shù)據(jù)用于建立鑒別模型。本發(fā)明所稱微生物包括細(xì)菌和真菌?？梢罁?jù)藥典所規(guī)定的控制菌的種類選取對(duì)照微生物，如選擇腸桿菌科、葡萄球菌屬、假單胞菌屬和梭菌屬等。例如，當(dāng)待檢樣品為藥物時(shí)，如果控制菌(參見《中華人民共和國藥典》2005版，二部附錄XIJ微生物限度檢查法中的控制菌檢查一章)為分屬腸桿菌科(大腸埃希菌、大腸菌群、沙門氏菌)、假單胞菌科假單胞菌屬、微球菌科葡萄球菌屬和芽胞桿菌科梭菌屬的大腸埃希菌、大腸菌群、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和梭菌時(shí)，可以選擇以下菌種作為對(duì)照微生物(1)陰溝腸桿菌、費(fèi)氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌及大腸埃希菌(腸桿菌科)；(2)腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、曱型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌(沙門氏菌屬)；(3)銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌及惡臭假單胞菌(假單胞菌屬)；(4)金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌(葡萄球菌屬)；(5)破傷風(fēng)梭菌、生孢梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌及膿毒梭菌(梭菌屬)。1.2微生物的培養(yǎng)和紅外光鐠樣品的制備本發(fā)明對(duì)照微生物和待測微生物的培養(yǎng)需使用相同的培養(yǎng)基。其培養(yǎng)方法可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何培養(yǎng)方法進(jìn)行，例如參見《藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)》馬緒榮、蘇德模著，華齡出版社，2007年1月中記載的方法。優(yōu)選使用的培養(yǎng)基例如市售的TSA(胰酪大豆瓊脂)、普通營養(yǎng)瓊酯培養(yǎng)基、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨酵母粉瓊脂培養(yǎng)基等。優(yōu)選在實(shí)施本發(fā)明時(shí)使用同一種培養(yǎng)基；更優(yōu)選使用來自相同供應(yīng)商的相同批次的培養(yǎng)基；或在使用相同供應(yīng)商不同批次的培養(yǎng)基時(shí)，用不同批號(hào)的培養(yǎng)基來培養(yǎng)同一菌林，通過采集相應(yīng)的多組光譜數(shù)據(jù)取其平均值的方式消除因培養(yǎng)基不同可能帶來的紅外光譜差異。微生物可依據(jù)其生長狀況在25-55。C下培養(yǎng)，但對(duì)于同一種微生物，優(yōu)選在相同的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)，更優(yōu)選采用相同的培養(yǎng)時(shí)間，如18-30小時(shí)，優(yōu)選22-24小時(shí)。用于進(jìn)行紅外光譜數(shù)據(jù)采集的樣品按照現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法制備，例如參見MicrobiologicalcharacterizationsbyFT畫IRspectroscopy,D.Naumann，D.Helm&H.Labischinski，7V/"re，Vol.351，No.6321，pp.81-82中記栽的方法制備。本發(fā)明的對(duì)照微生物和待測微生物應(yīng)在相同的條件下培養(yǎng)，并使用與待測微生物相同的條件和方法制備其用于進(jìn)行紅外光鐠數(shù)據(jù)采集的樣品。2.紅外光i普數(shù)據(jù)的采集本發(fā)明中，進(jìn)行紅外光i普測定使用的儀器與材料可以是本領(lǐng)域中任何已知的儀器和材料。本發(fā)明的紅外光譜的采集條件是現(xiàn)有技術(shù)中已知的條件，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)有限次的實(shí)驗(yàn)獲得，例如使用BrukerHTS-XT的高通量的微生物專用模塊，并用OPUS/LAB軟件控制樣品的測量。圖語采集的波長范圍為4000至500cm—1的中紅外鐠段。就每種微生物而言，優(yōu)選對(duì)所得待測樣品進(jìn)行多次(即n次)，優(yōu)選2至10次，更優(yōu)選2至5次，最優(yōu)選三次平行數(shù)據(jù)采集，將所得多份數(shù)據(jù)的原始結(jié)果和平均結(jié)果作為用于建立鑒定模型或檢測的光語數(shù)據(jù)。3.微生物紅外光語鑒別模型的建立和完善3.1紅外光諳數(shù)據(jù)的參數(shù)化處理建立所述鑒別模型前首先需要對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行參數(shù)化處理。所述參數(shù)化處理方法可以是現(xiàn)有技術(shù)中用于建立模型的任意方法，例如對(duì)所測得的紅外圖諳進(jìn)行平滑處理及一階或二階導(dǎo)數(shù)處理。3.2譜段的選擇與模型的建立本發(fā)明的微生物紅外光譜鑒別模型的類型可以是本領(lǐng)域中任何已知類型的紅外光鐠鑒別模型，例如聚類分析鑒別模型(ClusterAnalysis)或定性分析(Identitytest)鑒別模型。聚類分析鑒別模型是指使用相同的樣本組，根據(jù)預(yù)先設(shè)定的步驟，依次改變聚類分析參數(shù)，通過一次或多次的聚類分析，確定樣本歸屬分類的方法，其本質(zhì)是基于無監(jiān)督的模式識(shí)別方法，通常適用于在樣品類別未知的情況下，將樣品按照其性質(zhì)的相近程度進(jìn)行分類。系統(tǒng)聚類分析的基本思想首先是定義樣本之間的距離和類與類之間的距離，選擇距離最近的兩類合并成一個(gè)新類，并計(jì)算新類與其它類間的距離，再將距離最近的兩類合并，重復(fù)此過程，這樣每次減少一類，直到所有的樣本都成一類，最后形成聚類圖或樹狀圖。可以使用例如Bruker公司的OPUS軟件建立該模型。定性分析鑒別模型是通過將待測微生物的紅外光譜數(shù)據(jù)與對(duì)照微生物的紅外光譜數(shù)據(jù)庫(下文中簡稱語庫)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，定測微生物的光鐠數(shù)據(jù)最匹配，以確定待測微生物的歸屬。其本質(zhì)是基于有監(jiān)督的模式識(shí)別方法。該方法使用一組已知?dú)w屬的紅外光譜，例如對(duì)照微生物的紅外光語，作為訓(xùn)練集，并由這個(gè)訓(xùn)練集通過訓(xùn)練或?qū)W習(xí)得到相應(yīng)的鑒別初步模型，該初步模型對(duì)于訓(xùn)練集微生物的識(shí)別率是100%;再用另一組已知其歸屬但未包括在上述訓(xùn)練集中的對(duì)照微生物的紅外光語作為驗(yàn)證集來對(duì)所得的鑒別模型進(jìn)行驗(yàn)證，從而得到模型的識(shí)別率(即，將所有驗(yàn)證集光鐠帶入鐠庫，所得到的匹配值小于臨界匹配值的所有光諉個(gè)數(shù)與全部帶入光譜個(gè)數(shù)的比值)。然后將識(shí)別率符合要求的鑒別模型作為合格的定性分析鑒別模型用于判別未知紅外光譜(如待測微生物紅外光譜)所應(yīng)歸屬的類別。應(yīng)理解，識(shí)別率越高，漏檢率越小?？梢允褂美鏐ruker公司的OPUS軟件建立該定性分析模型。定性分析模型的驗(yàn)證可按現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法進(jìn)行，例如參見OPUS-IDENT，UserManual,第6版，第77-103頁。當(dāng)采用聚類分析鑒別模型時(shí)，建立模型譜段的選擇以能夠?qū)⒉煌N細(xì)菌的紅外圖i普在樹狀圖(例如，見附圖6)上按已知種屬進(jìn)行所需分類為準(zhǔn)。優(yōu)選地，選擇3000-2800cnT1和1800至700cm"區(qū)間內(nèi)，優(yōu)選地選擇SOOOJSOOcm-1和1800至900cm"區(qū)間內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)譜段建立模型的一個(gè)層，并且根據(jù)需要，選擇一至多個(gè)層，直至用于建立模型的對(duì)照微生物能夠被確定歸類鑒定。例如，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，建立模型的第一層時(shí)同時(shí)采用以下三個(gè)諉段約1200cm人約卯0cm1、約3000cm"-約2800cm1，以及約1500cm"-約1200cnT1。建立模型的第二層時(shí)同時(shí)采用以下三個(gè)謙段約1200cm"-約900cm"、約1500cm"-約1230cm1,以及約3000cm"-約2800cm"。建立模型的第三層時(shí)可選取以下譜段約1500cm"-約1200cm1、約940cm"-約760cm1以及約3100cm"畫約2卯0cm1;或者約1480cm"-約1310cm"，以及約920cm"-約870cm";或者約1500cm"-約1300cm1，以及約950cm"-約800cm1，或者它們的結(jié)合。當(dāng)采用定性分析鑒別模型時(shí)，通過觀察對(duì)照微生物紅外光譜的差異選擇譜段區(qū)域，即選擇待鑒別的微生物類別內(nèi)圖譜差異小而類別間圖傳差異大的語段作為語段組合。優(yōu)選建立模型采用的譜段為約1200cm"-約900cm1、約3000cm"-約2800cm"以及約1500cm、約1400cm-1。本發(fā)明的微生物鑒別模型對(duì)待測微生物的正確鑒別率高于70%，在一個(gè)實(shí)施方案中，正確鑒別率高于80%;在另一個(gè)實(shí)施方案中，正確鑒別率高于卯％;在另一個(gè)實(shí)施方案中，正確鑒別率高于95%。當(dāng)發(fā)現(xiàn)不屬于建立鑒別模型的對(duì)照微生物的新的微生物，特別是有代表性的微生物(例如通過其他方法，如使用API鑒定條，或者其他分子生物學(xué)反應(yīng)鑒別為目標(biāo)微生物，但紅外鑒定為非目標(biāo)菌林的微生物)時(shí)，可將其作為新的對(duì)照微生物進(jìn)行光鐠數(shù)據(jù)采集和處理，并將其與此前建立模型所用對(duì)照微生物的光諉數(shù)據(jù)一起用于建立新的鑒別模型，也即將其原始光譜和平均光譜(例如，由OPUS軟件中自帶的光譜平均功能獲得)加入到本發(fā)明的微生物紅外光譜鑒別模型的譜庫中，重新建立微生物鑒別模型，以對(duì)微生物鑒別模型進(jìn)行優(yōu)化。4.待測微生物的鑒別按照與對(duì)照微生物相同的培養(yǎng)條件、樣品制備方法和光鐠采集條件處理待測微生物并進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)采集，再將與建立模型時(shí)的譜段相同語段上的待測樣品光i普數(shù)據(jù)代入到微生物鑒別模型中進(jìn)行鑒別。本發(fā)明中，可以分別使用一次或多次聚類分析鑒別模型或定性分析鑒別模型對(duì)待測微生物進(jìn)行鑒別，也可以同時(shí)使用二者進(jìn)行鑒別。當(dāng)同時(shí)采用聚類分析鑒別模型和定性分析鑒別模型進(jìn)行鑒別時(shí)，采用的i普段與上述單獨(dú)使用聚類分析鑒別模型和定性分析鑒別模型時(shí)采用的譜段相同。優(yōu)選同時(shí)采用上述兩種鑒別模型進(jìn)行鑒別。鑒別結(jié)果的判斷準(zhǔn)則如下(1)使用聚類分析鑒別模型時(shí)使用該模型進(jìn)行待測微生物鑒別時(shí)，首先使用各對(duì)照微生物的平均光鐠和未知微生物光譜一同進(jìn)行聚類分析，計(jì)算光譜距離D值，進(jìn)行聚類分析，并根據(jù)D值進(jìn)行歸屬判斷。當(dāng)Pearson相關(guān)系數(shù)r$0.95時(shí)，認(rèn)為兩變量存在顯著性相關(guān)；此時(shí)，相應(yīng)的D^50;故確定臨界值為50，即D^50時(shí)兩林菌被j人為具有高度相似性。其中，Pearson相關(guān)系數(shù)r的計(jì)算方式如下，-，，-，r=——,-其中X、Y代表響應(yīng)頻率范圍的原始光鐠強(qiáng)度；f，？是平均光譜強(qiáng)度；根據(jù)方程(2)，相關(guān)系數(shù)轉(zhuǎn)化為D值(光譜距離)。D=(1.0-r)*1000.0(2)在本發(fā)明中，通常選擇所測得的光譜的若干個(gè)譜段進(jìn)行距離計(jì)算，換言之，兩個(gè)光譜之間的相似性以每個(gè)語段相似性的權(quán)重(一般各權(quán)重系數(shù)選擇為1)進(jìn)行計(jì)算，并以此計(jì)算結(jié)果代表平均或總體的光鐠相似性?？梢允褂美鏐ruker公司OPUS程序中Scalingto1strange或Normaltoreprolevel運(yùn)算方法進(jìn)行該計(jì)算。如第一層聚類分析不能確定待測微生物的歸屬，再依次按第二層、第三層聚類分析，直至確定所有待測微生物的歸屬。(2)使用定性分析模型時(shí)計(jì)算待測微生物紅外光譜與對(duì)照微生物紅外光譜數(shù)據(jù)庫內(nèi)各光譜的距離DNR(匹配值)，將其與該模型相應(yīng)于某一鑒定識(shí)別率的臨界匹配值進(jìn)行比較，如果對(duì)每一種對(duì)照微生物的數(shù)據(jù)的采集平行進(jìn)行了n次，則將待測微生物與對(duì)照微生物的匹配值從小到大排列，至少前n個(gè)匹配值均小于臨界匹配值，并且對(duì)應(yīng)于這些匹配值的微生物屬于同一類別，則該待測微生物被歸入前n個(gè)匹配值所對(duì)應(yīng)的微生物類別中。若前n個(gè)匹配值所對(duì)應(yīng)的微生物類別不盡相同，則認(rèn)為不能正確鑒別，因而不能歸屬微生物的類別。該過程可通過使用例如OPUS軟件完成，具體而言，在OPUS軟件的分析報(bào)告中若至少前n行的匹配值均小于臨界匹配值并對(duì)應(yīng)于同一微生物類別，則可認(rèn)為正確鑒別待測微生物，并且待測微生物即被歸入分析報(bào)告中前n行所示的微生物類別中；若前n行對(duì)應(yīng)于不同的微生物類別，則認(rèn)為不能正確鑒別，因而不能歸屬微生物的類別。所述臨界匹配值通過以下方式確定均勻選取鐠庫中一定數(shù)量的對(duì)照微生物光傳帶入譜庫進(jìn)行定性分析，得到一系列從小到大排列的匹配值，選取相應(yīng)于所選定的每個(gè)待測微生物正確識(shí)別時(shí)的最小匹配值，匯總，繪制直方圖和累積百分率表。將能夠正確識(shí)別所選定的對(duì)照微生物圖譜的最大匹配值設(shè)定為臨界匹配值。該臨界匹配值可以是約0.1-2,優(yōu)選0.1至1.2，更優(yōu)選O.l至l.O,最優(yōu)選0.1-0.5。所述光i普距離DNR可以通過OPUS軟件提供的Normaltoreprolevel處理方法，即，重現(xiàn)性水平歸一化法計(jì)算如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(3)式中，Di為第i個(gè)鐠段的光謙距離，根據(jù)上文的公式(l)(2)計(jì)算得到；n為所選譜段的數(shù)目。Reprolevel為重現(xiàn)性水平值，式中，B和o值分別為多次測量中相同微生物的紅外光諳根據(jù)公式(l)(2)計(jì)算得到的距離平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。當(dāng)紅外光鐠數(shù)據(jù)庫按上文所述由每一條光譜作為一個(gè)獨(dú)立的組組成時(shí)，為了能夠體現(xiàn)該微生物本身的光譜差異，選擇該重現(xiàn)性水平歸一化法計(jì)算光鐠距離。(3)同時(shí)采用以上兩種模型時(shí)當(dāng)同時(shí)采用聚類分析鑒別模型和定性分析鑒別模型時(shí)，兩種鑒別模型的鑒別結(jié)果相同時(shí)，為正確鑒別結(jié)果。當(dāng)同時(shí)采用聚類分析鑒別模型和定性分析鑒別模型時(shí)，鑒別結(jié)果的另一個(gè)判斷準(zhǔn)則為將采用聚類分析鑒別模型為陽性的結(jié)果判斷為正確鑒別，將采用聚類分析鑒別模型為陰性但采用定性分析鑒別模型為陽性的結(jié)果也判斷為正確鑒別。但該結(jié)果的可信程度低于兩種鑒別模型的鑒別結(jié)論相同時(shí)的結(jié)果。下面通過具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)例。實(shí)施例1步驟l對(duì)照微生物的選擇及培養(yǎng)為鑒別中國藥典中規(guī)定的六種控制菌，共選擇了4個(gè)科中的9個(gè)屬23個(gè)種的191林細(xì)菌作為對(duì)照微生物構(gòu)建參照諉庫。具體菌種及數(shù)量見表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>步驟2對(duì)照微生物的光譜測定將上述對(duì)照微生物菌在TSA培養(yǎng)基(美國BD公司)平板上純化形成單菌落，然后挑選單菌落劃線接種于該平板上，于35'C培養(yǎng)24±2h。用經(jīng)過校正的直徑為lmm的振動(dòng)鉑金接種環(huán)(德國Braun公司產(chǎn)品)從TSA培養(yǎng)基上菌落匯集處取l-2環(huán)菌苔，置于100jil滅菌水中，啟動(dòng)振動(dòng)開關(guān)制得均勻的菌懸液，量取15pl置于96孔Si片的栽樣處，立即置于裝有硅膠的減壓干燥器中，減壓千燥使菌懸液成為透明的薄膜。取出Si片，立即置于HTS-XT(德國Braun公司產(chǎn)品)樣品腔中，用TENSOR27型FTIR分光光度計(jì)測定FTIR吸收光圖鐠。測量參數(shù)波數(shù)范圍4000-500cm"，掃描次數(shù)16次，分辨率4cm"。步驟3.1聚類分析鑒別模型的建立以表1中所選的菌種作為對(duì)照微生物菌建立鐠庫。由于其中許多菌種具有較近的親緣關(guān)系，通過一次聚類分析無法將所有菌種區(qū)分開，為此采用聚類分析分析方法。在該步驟中通過三次聚類分析區(qū)分各菌種。具體流程及參數(shù)設(shè)置見圖2。步驟3.2定性分析鑒別模型的建立重現(xiàn)性水平值的確定及鐠段選擇上述菌種圖語在1200-900cm"、3000-2800cm"、1500-1400cm"三個(gè)鐠段差異明顯，因此選取這三個(gè)i普段的組合建立模型。確定以下三林細(xì)菌n次采集的圖鐠在不同譜段的重現(xiàn)性水平值(參見"WorkingwiththeIFS28/BandB畫module"中的"SamplePreparation,MeasurementandEvaluationoftheFT-IRSpectraofMicroorganisms"部分,第3版，第54-56頁)。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>重現(xiàn)性水平值分別取IO，5，20(為便于計(jì)算此處取整)。臨界匹配值的確定從每組菌中抽取相同數(shù)量的不同對(duì)照微生物菌林樣品的原始紅外光諳共計(jì)140張作為為內(nèi)部圖譜，使用OPUS軟件進(jìn)行定性分析，分別得到一系列從小到大排列的匹配值，選取能正確識(shí)別光鐠的最大匹配值，匯總，繪制直方圖和累積百分率表。結(jié)果如圖3及下表所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>1.001.201.503277.30%18卯.07%14100.00%由上表可見，內(nèi)部圖鐠能正確識(shí)別的最大匹配值均小于或等于1.50(100%對(duì)照微生物菌被正確識(shí)別)，故選取臨界匹配值為1.5。步驟4鑒別模型的正確鑒別率共選取卯抹菌411張紅外光譜圖，包括銅綠假單胞菌13林61張紅外光譜；大腸埃希菌32林141張紅外光譜；金黃色葡萄球菌12林54張紅外光鐠；表皮葡萄球菌13林63張紅外光譜；沙門氏菌20林92張紅外光傳。聚類分析模型的正確鑒別率銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和沙門氏菌全部能正確鑒別，32林大腸埃希菌中有5林歸入其他類。正確鑒別率為95.5%(85/90)。定性分析模型的正確鑒別率將上述卯菌林的所有原始光譜及平均光鐠逐一帶入所建立的模型(謙段為3000-2800、1500-1400和1200-卯0，重現(xiàn)性水平分別為5，20，10)中計(jì)算，按所定判斷準(zhǔn)則進(jìn)行判斷，正確鑒別率為93.4%(384/411)。實(shí)施例2使用與實(shí)施例l相同的方法和步驟進(jìn)行試驗(yàn)，不同之處在于對(duì)待測微生物采用兩種鑒別模型聯(lián)合使用的方法，以提高鑒別正確率。具體程序和結(jié)果判斷方法如圖5所示。將第一步鑒別正確的菌種的原始圖譜及平均圖譜分別帶入第二步鑒別方法，正確鑒別率為92.2%(379/411)。驗(yàn)證錯(cuò)誤的菌林及結(jié)果見表4。由表4可知，鑒別錯(cuò)誤主要發(fā)生在將E.coli鑒別為其他腸桿菌科的微生物，即呈現(xiàn)假陰性的結(jié)果。針對(duì)原定性分析鑒別模型造成假陰性的結(jié)果，將以上未能正確鑒別的圖鐠添加至建模鐠庫中，使諳庫中圖譜的覆蓋面更廣，能夠代表選定菌種所表現(xiàn)的生物差異，基于新的鐠庫重新建立微生物鑒別模型。調(diào)整后的定性測試的正確鑒別率為100%，結(jié)果見表4。表4兩步鑒別方法優(yōu)化前后鑒別結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>此時(shí)，使用聚類分析分析模型進(jìn)行第一步鑒別，將第一步鑒別中歸為非控制菌的樣品圖語再使用定性分析模型進(jìn)行第二步鑒別，如仍被鑒別為非控制菌，認(rèn)定該鑒別結(jié)果為最終鑒別結(jié)果。使用現(xiàn)有技術(shù)方法復(fù)核檢驗(yàn)結(jié)果表明，采用以上兩步法的正確鑒別率為100%。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)上文所述的兩步鑒別法中被歸為控制菌結(jié)果的準(zhǔn)確性，將鑒別為控制菌的菌種的原始圖鐠及平均圖語同時(shí)再用聚類分析鑒別模型和定性分析鑒別模型進(jìn)行鑒別，具體程序和結(jié)果判斷方法如圖4所示。當(dāng)兩種鑒別模型得出相同的結(jié)論時(shí)，該菌林被肯定為控制菌；當(dāng)兩種鑒別模型得出不同的結(jié)論時(shí)，該菌林被認(rèn)為是可疑控制菌。實(shí)施例3在種以下進(jìn)行區(qū)分為將菌種區(qū)分到種以下，如血清型水平。在本實(shí)施例中，選取了一系列的沙門氏菌，并測定了它們的血清型和IR圖譜，進(jìn)行聚類分析。具體細(xì)節(jié)見圖6，其中血清類型包括09、04、07，所選諉段為1202-899、901-698,重現(xiàn)性值水平值均為1，圖諳處理方法為Firstderivative十Vectornormalization，算法為Ward，salgorithm,從圖中可以看出，IR圖語按血清型類型很好地分類。權(quán)利要求1.一種利用紅外光譜鑒別微生物的方法，包括a)培養(yǎng)對(duì)照微生物；b)采集對(duì)照微生物的紅外圖譜；c)在3000-2800cm-1和1800至700cm-1區(qū)間內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)譜段建立微生物鑒別模型；d)在與步驟a)中相同的條件下培養(yǎng)待測微生物；e)在與步驟b)中相同的條件下采集待測微生物的紅外圖譜；f)將步驟e)中獲得的紅外圖譜代入微生物鑒別模型中確定待測微生物的歸屬。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述對(duì)照微生物的種類包括待測微生物的種類以及在紅外光譜法鑒別過程中易于與其混淆誤判的其他微生物種類，且其種類歸屬明確；所述微生物包括細(xì)菌或真菌。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述對(duì)照微生物可選自腸桿菌科、葡萄球菌屬、假單胞菌屬或梭菌屬；或它們的任意組合。4.權(quán)利要求l的方法，其中所述對(duì)照微生物或待測微生物的培養(yǎng)使用胰酪大豆瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊酯培養(yǎng)基、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨酵母粉瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行。5.權(quán)利要求l的方法，其中所述對(duì)照微生物或待測微生物的培養(yǎng)在25-55"C下進(jìn)行，培養(yǎng)時(shí)間為18-30小時(shí)，優(yōu)選22-24小時(shí)。6.權(quán)利要求5的方法，對(duì)于同一種微生物，在相同的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)，更優(yōu)選采用相同的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。7.權(quán)利要求l的方法，其中對(duì)所述對(duì)照微生物或待測微生物的紅外圖譜采集方式在為4000至500cm"的中紅外謙段內(nèi)進(jìn)行n次平行數(shù)據(jù)采集，并將以上多次采集的圖謙的平均結(jié)果作為用于建立鑒定模型或檢測的光譜數(shù)據(jù)，所述n為選自2-10的整數(shù)，優(yōu)選2-5的整數(shù)，更優(yōu)選為3。8.權(quán)利要求l的方法，其中步驟c)中所述的鑒別模型為聚類分析鑒別模型或定性分析鑒別模型，或者同時(shí)使用兩種鑒別模型。9.權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于在所述聚類分析鑒別模型中，所述步驟c)中的譜段選自3000-2800cm"和1800-卯0cm"區(qū)間內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)譜段。10.權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述聚類分析鑒別模型的第一層采用的譜段為約1200cm人約卯0cm"、約3000cm"-約2800cm1以及約1500cm人約1200cm1。11.權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述聚類分析鑒別模型的第二層采用的鐠段為約1200cm"-約卯0cm1、約1500cm"-約1230cm"以及約3000cm人約2800cm1。12.權(quán)利要求ll的方法，其特征在于所述聚類分析鑒別模型的第三層采用的鐠段為約1500cm"-約1200cm1、約940cm"-約760cm"以及約3100cm丄約2900cm1;或約1480cm人約1310cm1以及約920cm1-約870cm4;或約1500cm、約1300cm1以及約950cm"國約800cm1,或者它們的任意組合。13.權(quán)利要求8所述的方法，在所述聚類分析鑒別模型中，待測微生物的歸屬如下進(jìn)行將光鐠距離最近的兩類合并成一個(gè)新類，并計(jì)算新類與其它類間的距離，再將距離最近的兩類合并，重復(fù)此過程，這樣每次減少一類，直到所有的樣本都被歸入對(duì)照微生物的類別中。14.權(quán)利要求8所述的方法，在所述定性分析鑒別模型中，所述步驟c)中的鐠段為1200-卯0cm1、3000-2800cm4和1500-1400cm1。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中在所述定性分析鑒別模型中，使用一組已知?dú)w屬的紅外光譜圖建立鑒別初步模型。16.權(quán)利要求15所述的方法，其中針對(duì)鑒別初步模型，使用一組已知其歸屬但不同于權(quán)利要求14所述紅外光譜圖的對(duì)照微生物的紅外光譜圖對(duì)所得的鑒別初步模型進(jìn)行驗(yàn)證，得到模型的識(shí)別率。17.權(quán)利要求16所述的方法，其中將模型的識(shí)別率大于95%、優(yōu)選大于96%、更優(yōu)選大于97%、更優(yōu)選大于98%,更優(yōu)選大于99%，最優(yōu)選為100%的鑒別初步模型作為定性分析鑒別模型。18.權(quán)利要求17的方法，在所述定性分析鑒別模型中，待測微生物的歸屬如下進(jìn)行根據(jù)模型的識(shí)別率確定微生物鑒別模型的臨界匹配值，對(duì)每一種對(duì)照微生物的數(shù)據(jù)的采集平行進(jìn)行n次，將待測微生物與對(duì)照微生物的匹配值從小到大排列，至少前n個(gè)匹配值均小于臨界匹配值，并且對(duì)應(yīng)于這些匹配值的微生物屬于同一類別，則該待測微生物被歸入前n個(gè)匹配值所對(duì)應(yīng)的微生物類別中，所述n為選自2-10的整數(shù)，優(yōu)選2-5的整數(shù)，更優(yōu)選為3。19.權(quán)利要求8的方法，在所述聚類分析鑒別模型和定性分析鑒別模型同時(shí)使用的情況下，兩種鑒別模型的鑒別結(jié)果相同時(shí)，為正確鑒別結(jié)果。20.權(quán)利要求8的方法，其中同時(shí)使用所述聚類分析鑒別模型和定性分析鑒別模型的情況下，將采用聚類分析鑒別模型為陽性的結(jié)果判斷為正確鑒別，將采用聚類分析鑒別模型為陰性但采用定性分析鑒別模型為陽性的結(jié)果也判斷為正確鑒別，但該結(jié)果的可信程度低于兩種鑒別模型的鑒別結(jié)論相同時(shí)的結(jié)果。21.權(quán)利要求l的方法，還包括以下步驟將通過本發(fā)明或其它方法鑒定的新菌林的原始光譜和平均光譜添加至譜庫中，基于新的譜庫優(yōu)化微生物鑒別模型。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用傅立葉紅外光譜鑒別微生物的方法，包括a)培養(yǎng)對(duì)照微生物；b)采集對(duì)照微生物的紅外圖譜；c)在3000-2800cm^-1和1800至700cm^-1區(qū)間內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)譜段建立微生物鑒別模型；d)在與步驟a)中相同的條件下培養(yǎng)待測微生物；e)在與步驟b)中相同的條件下采集待測微生物的紅外圖譜；f)將步驟e)中獲得的紅外圖譜代入微生物鑒別模型中確定待測微生物的歸屬。本發(fā)明的微生物鑒別模型能夠?qū)崿F(xiàn)快速鑒別，對(duì)待測微生物的分類不需要用其他分類學(xué)方法進(jìn)行預(yù)選擇；方法特異性強(qiáng)，分類能按科、屬、種等單位進(jìn)行，甚至能夠區(qū)分到亞種、血清型水平；一旦建立了鑒別模型，鑒定微生物的成本極低。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101556242SQ20091020296公開日2009年10月14日申請(qǐng)日期2009年5月22日優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日發(fā)明者翚戴,璜肖,胡昌勤,琳裴,馬仕洪申請(qǐng)人:中國藥品生物制品檢定所