專利名稱：一種靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)化生產(chǎn)光學(xué)活性醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體涉及采用酵母靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行光學(xué)活
性醇生物轉(zhuǎn)化的方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明專利為中國專利申請200910008152. 5《一種紅酵母細(xì)胞以及不對稱轉(zhuǎn)化生 產(chǎn)光學(xué)活性醇的方法》的發(fā)展。 在中國專利申請200910008152. 5中，本發(fā)明人公開了一種以紅酵母靜息或固定 化細(xì)胞作為生物催化劑，在水_有機(jī)溶液兩相體系中對多種潛手性酮進(jìn)行不對稱還原獲得 相應(yīng)的光學(xué)活性醇的方法，轉(zhuǎn)化條件溫和，底物轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物光學(xué)活性高。
但是在該兩相系統(tǒng)中，由于底物及產(chǎn)物抑制作用明顯，使得轉(zhuǎn)化只能在較低的濃 度下進(jìn)行，限制了該方法的進(jìn)一步推廣。 生物轉(zhuǎn)化體系是迄今為止人類所知的最高效和最具有選擇性的溫和催化體系。酶 不僅在生物體內(nèi)，也能在生物體外促進(jìn)天然的和人工合成的化學(xué)分子的諸多轉(zhuǎn)化反應(yīng)，并 且顯示出優(yōu)良的化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性，同時還具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物 少、不造成環(huán)境污染和后處理簡單等優(yōu)點(diǎn)。近年來已在小分子化合物的轉(zhuǎn)化、天然化合物的 生物合成、藥物前體化合物的轉(zhuǎn)化、生物轉(zhuǎn)化的有機(jī)化合物不對稱合成、活性成分篩選及新 藥開發(fā)、藥物代謝研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但疏水性化合物的生物轉(zhuǎn)化經(jīng)常遭遇兩個障 礙低水溶性導(dǎo)致的底物與催化劑接觸受限，以及底物(及/或產(chǎn)物)對催化劑造成的毒 性。近些年來為提高生物轉(zhuǎn)化的效率，介質(zhì)工程成為研究的熱點(diǎn)內(nèi)容，多種轉(zhuǎn)化體系依次涌 現(xiàn)，如水_有機(jī)溶劑兩相體系、雙水相體系、離子液體轉(zhuǎn)化體系、反膠束轉(zhuǎn)化體系等。但這些 體系均存在一些問題，使得不溶性有機(jī)化合物的生物轉(zhuǎn)化只能在較低的濃度下進(jìn)行，成為 這些不溶性化合物走向工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的限制因素。 濁點(diǎn)系統(tǒng)(cloud point system,CPS)是近年開發(fā)的一種新型轉(zhuǎn)化體系，即利用一 種或一種以上非離子表面活性劑組成濁點(diǎn)系統(tǒng)，作為生物轉(zhuǎn)化的介質(zhì)。它以表面活性劑的 濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ)，所有操作在兩水相之間進(jìn)行，避免了對人體有害的有機(jī)溶劑的使用，也避 免了揮發(fā)性有機(jī)溶劑對環(huán)境的影響，而且表面活性劑用量小，轉(zhuǎn)化分離速度快，產(chǎn)物富集率 最高可達(dá)100%，具有經(jīng)濟(jì)、安全、高效、操作簡便且應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，是高靈敏度、高選擇 性的"綠色方法"。 濁點(diǎn)是非離子表面活性劑的一種特殊現(xiàn)象，是指非離子表面活性劑超過膠束濃度 (CMC)時，變成交替聚集在一起而相互關(guān)聯(lián)的締合體，形成膠束溶液。當(dāng)溫度超過濁點(diǎn)時，膠 束溶液明顯分為兩相，一相是表面活性劑脫離水相開始下沉，最后沉積為很小的體積(一 般為100-200 ill)，另一相是以表面活性劑濃度(CMC)為主的水相。溶液中的疏水性物質(zhì)與 表面活性劑的疏水基團(tuán)結(jié)合，被萃取進(jìn)入表面活性劑相，而親水性物質(zhì)仍留在水相中，再經(jīng) 兩相分離，就可將樣品中的物質(zhì)分離出來。 手型芳香醇作為合成手性藥物的重要中間體，在多種領(lǐng)域具有廣泛用途。在眾多生產(chǎn)方法中，以芳香族羰基化合物為潛手性底物，利用酶或細(xì)胞的催化作用，將其進(jìn)行不對 稱還原一獲得相應(yīng)的手性芳香醇的研究最為方便。本發(fā)明以3，5-雙三氟甲基苯乙酮不對 稱還原生成(S)-3，5-雙三氟甲基苯乙醇為例，介紹濁點(diǎn)系統(tǒng)在疏水性芳香酮的生物轉(zhuǎn)化 中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以酵母靜息細(xì)胞為催化劑，在濁點(diǎn)系統(tǒng)中對較高濃度 的潛手性酮進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，生成高濃度、高純度的光學(xué)活性醇的方法，屬于生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種采用酵母靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行 生物轉(zhuǎn)化的方法，使得不溶性底物的轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化濃度得以提高。 為達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是采用紅酵母靜息細(xì)胞為生物 催化劑，采用一種或一種以上表面活性劑形成濁點(diǎn)系統(tǒng)，并添加至水溶液中作為生物轉(zhuǎn)化 的介質(zhì)，然后加入底物后進(jìn)行不對稱轉(zhuǎn)化還原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化從而得 到相應(yīng)的光學(xué)活性醇。
本發(fā)明生產(chǎn)光學(xué)活性醇的方法，包括 (1)將酵母進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵，獲得濕菌體； (2)以前手性酮3，5-雙三氟甲基苯乙酮作為轉(zhuǎn)化底物； (3)將(1)獲得的濕菌體靜息細(xì)胞直接作為生物催化劑，于濁點(diǎn)系統(tǒng)中，加入轉(zhuǎn)化 底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，生成相應(yīng)的光學(xué)活性醇(S)-3，5-雙三氟甲基苯乙醇； (4)將(3)的轉(zhuǎn)化液，離心除去細(xì)胞后，上清置于一定溫度的水浴促進(jìn)系統(tǒng)分層， 下層為凝聚層，下層直接取樣用于轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)率分析。 本發(fā)明所述的表面活性劑為Triton X-114或Triton X-114與Triton X-100或 Triton X-45按照一定比例混合而成的。 所述酵母靜息細(xì)胞是將在發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)至一定時間后的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離 心洗滌后的微生物細(xì)胞，可直接用于濁點(diǎn)轉(zhuǎn)化。 在本發(fā)明所述靜息細(xì)胞培養(yǎng)過程中也可以加入一定濃度的以表面活性劑溶解的
底物進(jìn)行馴化，以加強(qiáng)細(xì)胞對底物和產(chǎn)物的耐受性及轉(zhuǎn)化活性，所加入的底物濃度一般為
0. 02-1% (w/v)之間。 轉(zhuǎn)化用菌株的培養(yǎng)和發(fā)酵 斜面培養(yǎng) YPD培養(yǎng)基酵母提取物1 % ，蛋白胨2% ，葡萄糖2% ，瓊脂2% ，自然pH，各組分的 含量均為重量體積百分比，即g/ml，下同。ll(TC滅菌15分鐘，冷卻后制成斜面，接種，3(TC
培養(yǎng)2-3天。 種子培養(yǎng)和發(fā)酵 YPD培養(yǎng)基酵母提取物1 % ，蛋白胨2 % ，葡萄糖2 % (含或不含以表面活性劑溶 解的底物)，自然pH，裝液量100ml/500ml三角瓶，11(TC滅菌15分鐘，冷卻后接種，接種量 5 10X，3(TC，搖瓶轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)24 36小時，分別作為種子及發(fā)酵培養(yǎng)液。其中發(fā) 酵培養(yǎng)液經(jīng)4000rpm離心收集細(xì)胞，無菌水洗滌兩遍后離心收集細(xì)胞，以收集到的細(xì)胞作 為生物催化劑。
微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)以收集的細(xì)胞為催化劑，于濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以潛手性酮為 底物，底物濃度2-12/ml，濕菌體用量為0. lg/ml，轉(zhuǎn)化溫度3(TC，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，轉(zhuǎn)化時 間24小時。 樣品分離轉(zhuǎn)化結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液12000rpm離心15min，上清置于水浴中，不斷升高 水浴溫度，至轉(zhuǎn)化液分成界限清晰的兩層，上層為稀相，下層凝聚層直接取樣20 ii 1進(jìn)行 HPLC檢測，計(jì)算出底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量。 底物潛手性酮和產(chǎn)物光學(xué)活性醇的HPLC測定C18反相色譜柱，流動相甲醇水 =70 : 30 ;進(jìn)樣量20ul ;流速lml/min ;柱溫25°C ;紫外檢測波長264nm。底物轉(zhuǎn)化率定 義為X = [C。/ (C。+C) ] X 100% ，式中C。和C分別代表高效液相圖譜中產(chǎn)物和底物峰的峰面 積。 本發(fā)明利用紅酵母細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中不對稱催化還原前手性酮，條件溫和，環(huán)境 友好，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量較單水相或水_有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)均有較大提高，具有較高的實(shí)際應(yīng) 用價值和開發(fā)前景。


圖1為本發(fā)明原理圖 圖2培養(yǎng)基中加入不同濃度底物后得到的濕菌體重量 培養(yǎng)條件100ml培養(yǎng)基，接種量10X，濁點(diǎn)系統(tǒng)中另外加入10ml Triton X-114,
各瓶中分別加入濃度為0.02 1% (v/v)的底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮。30。C，180rpm，
培養(yǎng)30hr，發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)4000rpm離心并用無菌水洗滌兩遍后離心收集細(xì)胞并稱量。 圖3Triton X-114與Triton X-45不同配比對紅酵母細(xì)胞生長量的影響 培養(yǎng)條件30ml培養(yǎng)基，另加入不同配比的Triton X-114與Triton X-45混合物，
TritonX-114與Triton X-45總體積3ml，接種3ml種子液。30°C ， 180rpm，培養(yǎng)30hr，發(fā)酵
培養(yǎng)液經(jīng)4000rpm離心并用無菌水洗滌兩遍后離心收集細(xì)胞并稱量。 圖4Triton X-114與Triton X-100不同配比對紅酵母細(xì)胞生長量的影響 培養(yǎng)條件30ml培養(yǎng)基，另加入不同配比的Triton X-114與Triton X-100混合
物，TritonX-114與Triton X-100總體積3ml，接種3ml種子液。30°C ， 180rpm，培養(yǎng)30hr，
發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)4000rpm離心并用無菌水洗滌兩遍后離心收集細(xì)胞并稱量。 圖5轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中表面活性劑濃度對轉(zhuǎn)化的影響 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)條件lg細(xì)胞，10ml純水，60 ii 1底物。 圖6轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中表面活性劑Triton X-114與Triton X-100不同配比對轉(zhuǎn)化的影 響 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)條件lg細(xì)胞，10ml純水，60 y 1底物，表面活性劑共1ml 。 圖7轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中表面活性劑Triton X-114與Triton X-45不同配比對轉(zhuǎn)化的影
響 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)條件lg細(xì)胞，10ml純水，60iU底物，表面活性劑共1ml。
圖8轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中底物濃度對轉(zhuǎn)化的影響轉(zhuǎn)化系統(tǒng)條件:lg細(xì)胞，10ml純水，Triton X_l 14500 ii 1， Triton X-100 ii 1。
圖9細(xì)胞循環(huán)利用次數(shù)對轉(zhuǎn)化的影響
轉(zhuǎn)化系統(tǒng)條件:lg細(xì)胞，10ml純水，Triton X-114500ii 1， Triton X-100 ii l，60ii 1底物。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行進(jìn)一步闡明。以下實(shí)施例均以本發(fā)明技術(shù)方 案為前提，給出詳細(xì)的實(shí)施方法和具體的操作步驟，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述實(shí)施 例。 如圖l所示，下述實(shí)施例生物轉(zhuǎn)化生成手性芳香醇(S)-3，5-雙三氟甲基苯乙醇的 原理為利用本實(shí)驗(yàn)室篩選并誘變的紅酵母細(xì)胞(CGMCC No. 2882)體內(nèi)的羰基還原酶，對 底物潛手性酮3， 5-雙三氟甲基苯乙酮進(jìn)行不對稱還原，實(shí)現(xiàn)酮基還原反應(yīng)，得到手性芳香 醇(S)-3，5-雙三氟甲基苯乙醇。
下例實(shí)施例的具體條件包括 微生物培養(yǎng)和收獲紅酵母細(xì)胞接種于YPD發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為酵母提取 物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2% (含或不含以表面活性劑溶解的底物)，自然pH， ll(TC滅菌 15分鐘，冷卻后接種，接種量10% ， 30°C ，搖瓶轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)24 36小時，分別作為種 子及發(fā)酵培養(yǎng)液。其中發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)4000rpm離心收集細(xì)胞，無菌水洗滌兩遍后離心收集 細(xì)胞，以收集到的細(xì)胞作為生物催化劑。微生物轉(zhuǎn)化將表面活性劑Triton X-114(以下以TX-114表示)和Triton X-45(以下以TX-45表示)或Triton X-100 (以下以TX-100表示)以一定比例混合，然后 將此混合物按照一定比例加入至純水中，組成濁點(diǎn)系統(tǒng)。在此系統(tǒng)中加入一定量的細(xì)胞作 為生物催化劑后，再按照一定比例加入底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮，構(gòu)成轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。將此 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)按照10ml/50ml比例裝入磨口帶塞三角瓶，于30°C ， 180rpm搖床上進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
產(chǎn)物分離及分析轉(zhuǎn)化24小時后，取出三角瓶，將轉(zhuǎn)化系統(tǒng)于12000rpm離心15分 鐘，下層細(xì)胞棄去或進(jìn)行循環(huán)轉(zhuǎn)化使用，上清溶液轉(zhuǎn)移至帶塞玻璃試管，于水浴中緩慢升高 溫度，試管中溶液由澄清透明逐漸渾濁，進(jìn)而分為界限清晰的兩層，上層為稀相，下層為富 集相。用微量移液器小心吸取上層稀相棄去，下層富集相直接進(jìn)行HPLC檢測。
以下實(shí)施例中凡為注明具體實(shí)施條件的，均按照以上具體條件實(shí)施。
實(shí)施例1 YPD發(fā)酵培養(yǎng)基100ml中加入底物20 iU，混勻后接種已培養(yǎng)24小時的種子液，放 入搖床培養(yǎng)36小時后，收獲細(xì)胞2. lg。
實(shí)施例2YPD發(fā)酵培養(yǎng)基100ml中加入底物20 yl及TX-11410ml，混勻后接種已培養(yǎng)24小 時的種子液，放入搖床培養(yǎng)36小時后，收獲細(xì)胞4. 6g。
實(shí)施例3 YPD發(fā)酵培養(yǎng)基100ml中加入底物600 y 1，混勻后接種已培養(yǎng)24小時的種子液， 放入搖床培養(yǎng)36小時后，收獲細(xì)胞1. 8g。
實(shí)施例4 YPD發(fā)酵培養(yǎng)基100ml中加入底物800 yl及TX-114 10ml，混勻后接種已培養(yǎng)24 小時的種子液，放入搖床培養(yǎng)36小時后，收獲細(xì)胞3. 3g。
實(shí)施例5YPD發(fā)酵培養(yǎng)基30ml中加入及TX-114和TX-45共3ml(TX-114 : TX-45 = 9 : 1)， 混勻后接種已培養(yǎng)24小時的種子液，放入搖床培養(yǎng)36小時后，收獲細(xì)胞0. 858g。
實(shí)施例6YPD發(fā)酵培養(yǎng)基30ml中加入及TX-114和TX-100共3ml (TX-114 : TX-100 = 9 : 1)，混勻后接種已培養(yǎng)24小時的種子液，放入搖床培養(yǎng)36小時后，收獲細(xì)胞1. 265g。
實(shí)施例7 細(xì)胞濃度為lg/10ml轉(zhuǎn)化體系，底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮濃度為40iil/10ml， 表面活性劑TX-114和TX-100的混合物(TX-114 : TX-100 = 9 : 1)，濃度為10% (v/v)， 轉(zhuǎn)化24小時，底物轉(zhuǎn)化率94. 5%，產(chǎn)物濃度3. 46mg/ml。
實(shí)施例8 細(xì)胞濃度為lg/10ml轉(zhuǎn)化體系，底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮濃度為60iil/10ml， 表面活性劑TX-114和TX-100的混合物(TX-114 : TX-100 = 5 : 5)，濃度為10% (v/v)， 轉(zhuǎn)化24小時，底物轉(zhuǎn)化率80%，產(chǎn)物濃度3. 54mg/ml。
實(shí)施例9 細(xì)胞濃度為lg/10ml轉(zhuǎn)化體系，底物3，5-雙三氟甲基苯乙酮濃度為60iil/10ml， 表面活性劑TX-114和TX-100的混合物(TX-114 : TX-100 = 5 : 5)，濃度為10% (v/v)， 轉(zhuǎn)化24小時，底物轉(zhuǎn)化率80%，產(chǎn)物濃度3. 54mg/ml。
權(quán)利要求
一種以酵母靜息細(xì)胞在濁點(diǎn)系統(tǒng)中對潛手性酮進(jìn)行不對稱還原生產(chǎn)光學(xué)活性醇的方法，該方法是采用一種或一種以上非離子表面活性劑溶液形成濁點(diǎn)系統(tǒng)，作為生物轉(zhuǎn)化的介質(zhì)。具體步驟包括(1)將酵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、發(fā)酵，獲得濕菌體直接作為生物催化劑；(2)以潛手性酮作為轉(zhuǎn)化底物；(3)將(1)獲得的濕菌體加入濁點(diǎn)系統(tǒng)溶液，再加入底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，生成相應(yīng)的光學(xué)活性醇；(4)轉(zhuǎn)化結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液離心除去細(xì)胞，上清置于水浴中，緩慢升高水浴溫度直至溶液由均相逐漸渾濁、繼而分層并形成穩(wěn)定共存的兩相上層稀相及下層凝聚相。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，其特征在于步驟(l)中酵母發(fā)酵的培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基， 其中可加入濃度為0. 02-1%的底物以及1_10%的表面活性劑進(jìn)行馴化以增強(qiáng)細(xì)胞對底物 和產(chǎn)物的耐受性及轉(zhuǎn)化活性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，其特征在于步驟(3)中轉(zhuǎn)化方法采用一種或一種以上表 面活性劑形成濁點(diǎn)系統(tǒng)，并添加至轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，作為生物轉(zhuǎn)化的介質(zhì)。表面活性劑濃度為 1-10%，其中表面活性劑為Triton X-114或Triton X-114 : Triton X-100 = 9 : 1-1 : 9， 或Triton X-114 : Triton X-45 = 9 : 1_1 : 9。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟(3)中轉(zhuǎn)化方法中底物濃度為2-12 iU/ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，其特征在于步驟(4)凝聚相可直接取樣進(jìn)行HPLC檢測。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于所述的靜息細(xì)胞在多種底物的轉(zhuǎn)化過程中可 進(jìn)行多次循環(huán)使用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以酵母靜息細(xì)胞作為生物催化劑，在一種或一種以上表面活性劑組成的濁點(diǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的方法。該方法能夠在溫和的反應(yīng)條件下對較高濃度的潛手性酮底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到相應(yīng)的光學(xué)活性醇。該方法在很大程度上解除了不溶性底物及產(chǎn)物對反應(yīng)的抑制作用，可在較高的濃度下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，底物的轉(zhuǎn)化效率高，并可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的多次循環(huán)使用，條件溫和，環(huán)境友好，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價值和開發(fā)前景。
文檔編號C12P7/02GK101693906SQ200910207560
公開日2010年4月14日 申請日期2009年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日
發(fā)明者張芳, 李莉, 王旻 申請人:中國藥科大學(xué);