專利名稱：一種木質(zhì)纖維原料酶水解的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于木質(zhì)纖維原料生物降解與轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料乙醇、化工平臺(tái)化合物和其他
生物基化學(xué)品中的酶水解技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種以纖維素酶分段水解木質(zhì)纖維素及超濾 回收e-葡萄糖苷酶的方法。
二背景技術(shù)：
據(jù)預(yù)測(cè)，地球上可利用的石油資源將在今后幾十年內(nèi)耗竭，從長(zhǎng)遠(yuǎn)看，液體燃料短 缺將是困擾人類社會(huì)發(fā)展的重大問題。各國科學(xué)家一直在積極尋找能夠替代或部分替代石 油的新能源。生物乙醇以其可再生性、環(huán)保性和使用過程中不引起溫室效應(yīng)等突出優(yōu)點(diǎn)，被 公認(rèn)為是汽油的最佳替代品而得到廣泛的研究。生產(chǎn)乙醇的原料主要包括淀粉質(zhì)原料、糖 質(zhì)和木質(zhì)纖維原料。由于受到糧食和耕地短缺的制約，單純以糧食或糖質(zhì)為原料生產(chǎn)乙醇 的方法，不可能滿足迅猛發(fā)展的汽車工業(yè)對(duì)燃料乙醇的需求，因此，研究如何利用可再生的 木質(zhì)纖維原料大規(guī)模生產(chǎn)燃料乙醇，就成為了當(dāng)前的重要課題。 木質(zhì)纖維原料生物法制備燃料乙醇主要包括原料預(yù)處理、纖維素的酶水解和糖液 (包括戊糖和己糖)發(fā)酵三個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。纖維素的酶水解是木質(zhì)纖維原料生物法制備燃料 乙醇的關(guān)鍵技術(shù)之一。纖維素的酶水解過程具有反應(yīng)溫度低，可發(fā)酵糖得率高，產(chǎn)生的發(fā)酵 抑制物少，能耗較低，設(shè)備要求簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，因此，纖維素的酶水解被認(rèn)為是有 較大工業(yè)應(yīng)用前景的纖維素水解技術(shù)。 纖維素酶是水解纖維素成葡萄糖的一組酶的總稱，它是一個(gè)多組分的復(fù)合酶系， 主要有三種組分，即內(nèi)切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和P-葡萄糖苷酶。纖維素是在這三 種酶的協(xié)同作用下徹底水解成葡萄糖的。在纖維素酶水解過程中，內(nèi)切葡聚糖酶以隨機(jī)形 式切斷纖維素鏈中的P-l，4-糖苷鍵生成短鏈纖維素或纖維低聚糖；隨后外切葡聚糖酶主 要作用于短鏈纖維素和纖維低聚糖的非還原端以生成纖維二糖；最后纖維二糖在P-葡萄 糖苷酶的作用下徹底生成葡萄糖。在纖維素水解過程中，纖維素對(duì)纖維素酶系中的內(nèi)切葡 聚糖酶、外切葡聚糖酶親和力較大，而對(duì)P _葡萄糖苷酶的親和力較小，因此在纖維素酶水 解體系中，內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶主要吸附在不溶性纖維素上，而P-葡萄糖苷酶主 要存在于水相中。 如何提高纖維素的酶水解效率和得率，是利用可再生木質(zhì)纖維原料大規(guī)模生產(chǎn)燃 料乙醇的技術(shù)關(guān)鍵，也是當(dāng)前國內(nèi)外相關(guān)研究領(lǐng)域的主要研究方向。
已有技術(shù)可參考 CN 200810021531. 3 —種將農(nóng)林廢棄物轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的方法 CN 200810023479. 5蒸汽爆破木質(zhì)纖維原料可溶性低聚糖同步酶解制取單糖的方
法，等。
三
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是根據(jù)纖維素的酶水解機(jī)理，尋找一種在燃料乙醇生產(chǎn)過程中，可
3以提高纖維素的酶水解效率和得率的新方法。 纖維素酶是一種受產(chǎn)物反饋抑制的水解酶類。隨著纖維素酶水解過程的進(jìn)行，反 應(yīng)體系中不斷累積的纖維二糖，將會(huì)抑制纖維素酶系中內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活 力；葡萄糖在反應(yīng)體系中的不斷累積，則會(huì)抑制P-葡萄糖苷酶的活力，且更加敏感。
針對(duì)上述存在的問題，在酶解反應(yīng)體系中，一般可以通過添加外源e-葡萄糖苷
酶的方法來降低纖維二糖對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制作用；而葡萄糖對(duì)P-葡 萄糖苷酶的抑制作用，則可通過及時(shí)移走生成的單糖或同步糖化發(fā)酵(SSF)技術(shù)來解除， 但SSF法由于酶解與發(fā)酵工藝對(duì)溫度的需求存在較大差異，從而限制了它的工業(yè)應(yīng)用。
本發(fā)明通過纖維素酶分段水解木質(zhì)纖維原料并及時(shí)移走酶反應(yīng)生成的產(chǎn)物來減 輕產(chǎn)物對(duì)纖維素酶的抑制作用，通過添加P _葡萄糖苷酶的方法水解移走反應(yīng)液中的纖維 二糖成葡萄糖，并采用超濾的方法回收利用反應(yīng)液中的纖維素酶和P-葡萄糖苷酶。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案為一種木質(zhì)纖維原料酶水解的方法，其特征是采用分段 酶解木質(zhì)纖維原料和超濾回用纖維素酶和P-葡萄糖苷酶的工藝，具體工藝流程如下
a.將經(jīng)過適當(dāng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維原料在底物固液重量比為1 : 3 20，纖維素酶 用量5 25FPIU/g纖維素，pH值4 6，45 50。C條件下水解，分別在水解6h、12h和24h 時(shí)進(jìn)行固液分離，用蒸餾水洗滌酶解渣； b.分別將上述6、12h階段的固液分離液、洗滌液合并，用截留分子量為 10kDa(Da——截留分子量單位，道爾頓)的超濾膜回收液體中的纖維素酶，并用于下一階段 的酶水解； c.分別在a步驟獲得的洗滌酶解渣中添加一定pH值的水溶液、b中回收的纖維素 酶后于pH值4 6，45 5(TC條件下繼續(xù)進(jìn)行下一段酶解直至24h ; d.將超濾回收過纖維素酶后的液體減壓濃縮至纖維二糖濃度為30g/L，添加1 2IU/ml以上的外源P-葡萄糖苷酶，在pH值4 6，45 5(TC條件下水解2 4h，獲得酶 解液； e.用截留分子量為30kDa的超濾膜回收利用d中所得酶解液中的P _葡萄糖苷 酶。 回收的P-葡萄糖苷酶作為外源P-葡萄糖苷酶用于下一批次酶水解，超濾后的 酶解液用于下一步的糖液乙醇發(fā)酵。 如上述過程a中所述，也可以采用在水解12h時(shí)進(jìn)行固液分離的兩段酶解方法簡(jiǎn)
化工藝過程，但纖維素水解得率略有降低。 分段酶解的流程示意簡(jiǎn)圖參見附圖5和附圖6。 有益效果采用上述分段酶解木質(zhì)纖維原料和超濾分別回用纖維素酶和13 _葡萄 糖苷酶的工藝，由于反應(yīng)過程中纖維二糖和葡萄糖的及時(shí)移除，大大減輕了反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)纖 維素酶的抑制作用，提高了纖維素的水解得率和纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的效率，且可明顯 縮短酶解反應(yīng)的時(shí)間。
四

圖1為纖維素酶三段法水解蒸汽爆破預(yù)處理玉米秸桿，纖維素水解得率隨時(shí)間的 變化規(guī)律；
4
圖2為|3 _葡萄糖苷酶均相水解纖維二糖的歷程； 圖3為|3 _葡萄糖苷酶的回收及回收13 -葡萄糖苷酶對(duì)纖維二糖的水解作用；
圖4為纖維素酶一段法水解蒸汽爆破預(yù)處理玉米秸桿，纖維素水解得率隨時(shí)間的 變化規(guī)律； 圖5為三段酶解流程的示意簡(jiǎn)圖；
圖6為兩段酶解流程的示意簡(jiǎn)圖。
五具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :纖維素酶三段法水解蒸汽爆破預(yù)處理玉米秸稈 1.以蒸汽爆破、水洗預(yù)處理的玉米秸稈為木質(zhì)纖維原料，在固液重量比為1 : 3 20，纖維素酶用量5 25FPIU/g纖維素，pH值4 6、溫度為45 5(TC的條件下，低速攪 動(dòng)水解6h后進(jìn)行固液分離。 2.水解物于4000轉(zhuǎn)/分條件下離心10min，收集上清液，測(cè)定糖液中纖維二糖和 葡萄糖的含量，計(jì)算纖維素酶水解得率。離心獲得的酶解渣用蒸餾水洗滌兩次，于10000轉(zhuǎn) /分下離心5min，分別收集上清液和酶解渣。 糖濃度測(cè)定采用高效液相色譜(HPLC)法。色譜儀Agilent 1100 ;色譜柱 Bio-rad HPX-87H ;柱溫50 。C ;流動(dòng)相0. 005mol/L H2S04 ;流速0. 6mL/min ;上樣量
10ilL;檢測(cè)器RID檢測(cè)器。 纖維素水解得率Y用下式計(jì)算
Y = [(CXLXO. 9)/(GXW)] X100
式中 Y-纖維素水解得率，％ ;
L-水解糖液體積，L; C-水解液中葡萄糖和纖維二糖濃度，g/L ;
0. 9-纖維素和葡萄糖、纖維二糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)；
G-原料重，g ;
W-原料中纖維素含量，％。 3.合并上述三次離心分離獲得的糖液，用截留分子量10kDa的超濾膜回收其中的 纖維素酶組分，分別收集纖維素酶和糖液。 4.在步驟2獲得的洗滌酶解渣中添加用硫酸調(diào)節(jié)的pH值為4 6的水、步驟3回 收的纖維素酶，使反應(yīng)體系總體積與初始反應(yīng)體積一致，于pH值4 6、溫度為45 50°C 的條件下，低速攪動(dòng)水解6h后進(jìn)行固液分離。
5.重復(fù)步驟2和3。 6.在步驟5獲得的洗滌酶解渣中添加用硫酸調(diào)節(jié)的pH值為4 6的水、步驟5回 收的纖維素酶，使反應(yīng)體系總體積與初始反應(yīng)體積一致，于pH值4 6、溫度為45 50°C 的條件下，低速攪動(dòng)水解12h后進(jìn)行固液分離。 7.水解物于4000轉(zhuǎn)/分條件下離心10min，收集上清液，測(cè)定糖液中纖維二糖和 葡萄糖的含量，計(jì)算纖維素酶水解得率。離心獲得的酶解渣用蒸餾水洗滌兩次，于10000轉(zhuǎn) /分下離心5min，收集合并上述離心上清糖液，棄用洗滌酶解渣。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明木質(zhì)纖維原料經(jīng)分段酶水解后，纖維素水解得率 顯著提高，酶水解時(shí)間大大縮短。與未分段的木質(zhì)纖維原料酶水解工藝相比，采用三段酶水 解法可使纖維素水解得率從52. 06%提高到70. 16%，酶水解時(shí)間從48h減少到24h。
實(shí)施例2 : 13 -葡萄糖苷酶均相水解纖維二糖糖液及超濾回收復(fù)用13 -葡萄糖苷酶
1.合并實(shí)施例1中分段水解所得糖液，減壓蒸發(fā)濃縮至纖維二糖濃度為30g/L。
2.將上述濃縮糖液添加P-葡萄糖苷酶、緩沖液和蒸餾水，P-葡萄糖苷酶的添 加量分別為1和2IU/ml，控制水解體系pH值4 6， 45 50°C的溫度下低速攪動(dòng)水解1 6h。 3.水解結(jié)束后，測(cè)定水解液中纖維二糖和葡萄糖的含量，計(jì)算P-葡萄糖苷酶水 解纖維二糖的水解得率。用截留分子量為30kDa的超濾膜回收水解液中的P-葡萄糖苷酶， 測(cè)定P-葡萄糖苷酶的酶活，并計(jì)算P-葡萄糖苷酶的回收率。 4.回收的P-葡萄糖苷酶用于下一批次分段水解所得糖液的濃縮液中纖維二糖 的水解，重復(fù)使用8批次。 結(jié)果表明在(6+6+12)h三段水解糖液的濃縮液中分別加入1IU/ml和2IU/ml的 P -葡萄糖苷酶，水解3h時(shí)，水解液中纖維二糖濃度分別為4. 19g/L和1. 63g/L，如附圖2所 示，并據(jù)此確定合適的外源P-葡萄糖苷酶的添加量為^ 1 2IU/ml，酶解時(shí)間為2 4h。
用30kDa的超濾膜回收纖維二糖水解液中的P _葡萄糖苷酶并用于下一批次的酶 解，回用第一輪酶回收率為98. 87% ，纖維二糖水解為葡萄糖的得率為92. 71 %;回用至第八 輪酶回收率為95. 25%，纖維二糖水解為葡萄糖的得率為90. 87%，結(jié)果如附圖3。
實(shí)施例3 :纖維素酶兩段法水解蒸汽爆破預(yù)處理玉米秸稈 參照實(shí)施例1和2的方法，采用(12+12) h兩段水解的方法簡(jiǎn)化工藝過程，24h纖維 素水解得率約為59. 12%。兩段或三段法酶解工藝分階段得率情況見下表
蒸汽爆破玉米秸桿分段酶解結(jié)果
方案纖維素水解得率(％)
第一段第二段第三段合計(jì)
(12+12) h39.7019.50/59.20
(6+6+12) h31.7621.2117.1970.16 不管采用兩段法或三段法酶解工藝，固液分離的具體分段時(shí)間，完全可以考慮生 產(chǎn)調(diào)度的方便而允許在一定的范圍內(nèi)進(jìn)行變動(dòng)。 采用更多分段的固液分離處理工藝，雖然可以在一定程度上繼續(xù)提高酶解的效率 和得率，但會(huì)增加處理的成本，故不予考慮。
比較例1 :纖維素酶一段法水解蒸汽爆破預(yù)處理玉米秸稈 1.固液比、纖維素酶用量、pH值、溫度條件同實(shí)施例l，低速攪動(dòng)水解48h后進(jìn)行 固液分離。 2.于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)定上清液中纖維二糖和葡萄糖的含量，并計(jì)算纖維素酶 水解得率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。 結(jié)果表明，采用傳統(tǒng)的一段法酶水解蒸汽爆破玉米秸桿，24h纖維素水解得率為 52. 06% ;48h纖維素水解得率為59. 14%。
權(quán)利要求
一種木質(zhì)纖維原料酶水解的方法，用經(jīng)過預(yù)處理的木質(zhì)纖維作原料，其特征是采用分段酶解和超濾回用纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的工藝，具體流程如下a.原料固液重量比為1∶3～20，纖維素酶用量5～25FPIU/g纖維素，在pH值4～6，45～50℃條件下水解，分別在水解6h、12h和24h時(shí)進(jìn)行固液分離，用蒸餾水洗滌酶解渣，分別合并上述各階段的固液分離液、洗滌液，用截留分子量為10kDa的超濾膜回收6、12h分離、洗滌合并液中的纖維素酶，并用回收的纖維素酶繼續(xù)下一段水解洗滌后的固體渣直至水解24h；b.將超濾回收過纖維素酶后的液體減壓濃縮至纖維二糖濃度為30g/L，添加1～2IU/ml以上的β-葡萄糖苷酶，在pH值4～6，45～50℃條件下水解2～4h；c.用截留分子量為30kDa的超濾膜回收利用b中所得酶解液中的β-葡萄糖苷酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的木質(zhì)纖維原料酶水解的方法，其特征是在la中，在水解12h時(shí) 進(jìn)行固液分離并進(jìn)行相同的b， c處理。
全文摘要
一種木質(zhì)纖維原料酶水解的方法，用經(jīng)過預(yù)處理的木質(zhì)纖維作原料，其特征是采用分段進(jìn)行酶解和超濾回用纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的工藝。由于反應(yīng)過程中纖維二糖和葡萄糖的及時(shí)移除，大大減輕了反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)纖維素酶的抑制作用，提高了纖維素的水解得率和纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的效率，且可明顯縮短酶解反應(yīng)的時(shí)間。
文檔編號(hào)C12P7/10GK101705254SQ20091021269
公開日2010年5月12日 申請(qǐng)日期2009年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日
發(fā)明者余世袁, 勇強(qiáng), 楊靜 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)