專利名稱：：一種具有降解四溴雙酚a能力的蒼白桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于微生物
技術領域：
，特別涉及一種具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌及其在環(huán)境修復中的應用。
背景技術：
：溴代阻燃劑(BFRs)由于其具有較高的持久性、親脂性、環(huán)境穩(wěn)定性、難降解性和生物放大作用等特性，容易在人和動物體內累積，并能夠通過食物鏈傳遞，使處于高位營養(yǎng)級的生物受到毒害，最終導致對人體健康的危害。國外已經開始關注溴代阻燃劑在自然界中的降解，已有研究表明不同的溴代阻燃劑可以在一定的條件下光降解或生物降解，利用從環(huán)境中篩選的優(yōu)勢微生物能有效地去除環(huán)境中的溴代阻燃劑。四溴雙酚A是一種典型的溴代阻燃劑。四溴雙酚A的生物降解特性已經成為研究的焦點。而蒼白桿菌屬是由Holmes等在1988年建立的新屬。細菌染色為革蘭氏陰性，專性好氧，接觸酶陽性，不水解明膠，能利用各種氨基酸、有機酸和碳水化合物為碳源。至今尚未篩選出蒼白桿菌屬中具有降解四溴雙酚A的菌株。
發(fā)明內容為了克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌。本發(fā)明的另一目的在于提供所述具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)一種具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌，名稱為蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)T，于2009年10月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCM209246;所述具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌具有如下的形態(tài)和生理生化特性該蒼白桿菌菌體的形態(tài)特性a.采用常規(guī)的細菌生理生化鑒定方法和電子顯微鏡觀察，所篩選的蒼白桿菌的細胞染色為革蘭氏陰性，桿狀，菌體大小為0.40.8X1.62.2iim，周生鞭毛；b.菌落的形態(tài)特性在LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，菌落形態(tài)為圓形，無色，透明，菌落直徑為12mm;c.主要的生理生化特征專性好氧，嚴格呼吸代謝，接觸酶、氧化酶陽性，吲哚試驗陰性，不水解明膠，在半固體LB培養(yǎng)基上穿剌接種運動陰性。所述具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌的16SrDNA序列如SEQID:No.1所示。所述具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌應用于修復環(huán)境，所述的蒼白桿菌可降解環(huán)境中，如大氣、水體和土壤中的四溴雙酚A。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，具有如下的優(yōu)點及有益效果(1)本發(fā)明首次從廣東省貴嶼地區(qū)土壤中篩選到具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌。3(2)本發(fā)明的蒼白桿菌降解四溴雙酚A的能力強，底物濃度為2mg/L條件下降解84h，降解率可達96.2%。圖1是本發(fā)明的蒼白桿菌T在電子顯微鏡下的形態(tài)圖。具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1本發(fā)明所述的具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌從廣東省貴嶼鎮(zhèn)電子垃圾高風險區(qū)的污泥中進行分離、純化而得。其分離純化方法如下所用的馴化培養(yǎng)基為無機鹽培養(yǎng)基(g/U(K2HP044.35，KH2P041.70，NH4N032.10，MgS040.20，MnS040.05，F(xiàn)eS047H200.01，CaCl2*2H200.03)。首先將3g污泥加入含四溴雙酚A10mg/L的無機鹽培養(yǎng)基，37°C馴化7天后，以5%接種量移入含四溴雙酚A20mg/L的無機鹽培養(yǎng)基接著馴化一周，以此類推逐步提高四溴雙酚A的濃度進行馴化，四溴雙酚A的使用濃度分別為30mg/L、40mg/L、50mg/L。馴化結束后以5%的接種量接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏3.Og/L，蛋白胨10.Og/L，NaCl5.0g/L，pH7.4-7.6)培養(yǎng)12h，取0.1ml菌懸液(稀釋10—110—7)涂布在以四溴雙酚A為唯一碳源的固體瓊脂平板(K2HP044.35g/L，KH2P041.70g/L，NH4N032.10g/L，MgS040.20g/L，MnS040.05g/L，F(xiàn)eS047H200.01g/L，CaCl22H200.03g/L，瓊脂粉1.80g/L，四溴雙酚AlOmg/L)直到平板上出現(xiàn)單一的純菌落為純菌。挑選生長速度快、邊緣規(guī)則的菌落。將挑選得到的菌落進行鑒定，鑒定結果如下(1)菌體的形態(tài)特性a.采用常規(guī)的細菌生理生化鑒定方法和電子顯微鏡觀察，所篩選的蒼白桿菌的細胞染色為革蘭氏陰性；在電子顯微鏡下觀察，其形態(tài)為桿狀，菌體大小為0.40.8X1.62.2iim，周生鞭毛，如圖l所示；b.菌落的形態(tài)特性在LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，菌落形態(tài)為圓形，無色，透明，菌落直徑為12mm;c.主要的生理生化特征專性好氧，嚴格呼吸代謝，接觸酶、氧化酶陽性，吲哚試驗陰性，不水解明膠，在半固體LB培養(yǎng)基上穿剌接種運動陰性。上述結果表明本發(fā)明所篩選的細菌與蒼白桿菌屬的生理生化特性很相似。(2)采用DNA提取方法提取細菌總DNA。采用細菌的16SrDNA通用引物擴增其16SrDNA基因，測序結果如下(SEQID:No.1):tggagccgtgtcgacagcctaccatgcagtcgagcgcgtagcaatacgagcggcagacgg60gtgagt朋cgcgtggg朋tctecccatcacteggg朋t朋ctcaggg朋3cttgtgct朋120taccctatacgaccgagaggtgaaagatttatcggtgatggatgagcccgcgttggatta180gctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatccatagctggtctgagaggatga240tcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaata300ttggac朋tgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtg￡lgtg￡ltg￡l￡lggccctagggt360tgtaaagctctttcaccggt3Cggt朋CCgg3g朋g朋gCcccggctaac420ttcgtgccagcagccgcggtgggctagcgttgttcggatttactgggcgt■3朋gCgC3Cgtaggcgggctgggtg朋EltCccggggctcaaccccggaac540tgcctttgatactgttagtcttgagtetgg3卿ggtg3gtggaattccgElgtgt卿gg600tgaaattcgtagatettcgg3gg^C3CC3gtggcg朋ggcgggctcactggtgcattac660tgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagca3朋C3gg3ttagataccctgggtagtccac720gccgtaatcgatg朋tgttegccgttggggagtttactcttcggtggcgc3gCt朋CgC3780ttaaacattccgcctggggagtecggtcgcctc朋3gg朋ttg3Cggggg840cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcg朋gc朋cgcgcag朋ccttaccagcc900cttgacatcccgatcgcggttegtgg卿cactttccttcagttcggctggatcggagac960aggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgttgggttaagtcccgcaacga1020gcgcaaccctcgcccttagttgccagcattcagttgggcactct朋ggggactgccggtg1080ateagccgag3gg朋ggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggctgggcte1140cacacgtgct3C朋tggtggtgacagtgggC3gCg3gC3Cgcgagtgtgagctaatctcc12003朋3gCC3tCtcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatg朋gttgg朋tcgcte1260gteatcgcggatcagcatgccgcggtg^tacgttcccgggccttgtacacaccgcccgt1320cacaccatgggagttggttttecccg33ggcgctgtgcta3CCgC33gg3ggcacgcgac1380cacggtagggtcagcgatctggcgtg卿tCgg朋CC3朋gttttegggggc1432將長為1432bp的16SrRNA基因序列與Genbank中已登錄的基因序列進行比對分析發(fā)現(xiàn)菌株與Ochrobactrumsp.CGL-x有最高的同源性達98.1%，其中與最相似的模式菌株OchrobactrumintermodiumCCUG2469T的同源性為96.2%。綜合上述的生理生化特性、16SrRNA基因序列結果，本發(fā)明所篩選的細菌應歸屬蒼白桿菌屬，且為該屬的一個新種，命名為蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)T。所述菌株于2009年10月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCM209246。實施例2本發(fā)明篩選得到的蒼白桿菌T對四溴雙酚A具有降解能力在1L的去離子水中加入K2HP044.35g，KH2P041.70g，NH4N032.10g，MgS040.20g，MnS040.05g，F(xiàn)eS047H200.Olg，CaCl22H200.03g，100ml/瓶分裝在250ml的搖瓶中，12rC條件下滅菌30min后取出，在無菌條件下加入四溴雙酚A，四溴雙酚A的濃度依次為2mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L禾P25mg/L。將斜面保存的蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)T接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)中，在30°C，220r/min的搖床中活化菌體15h，以5%的接種量接入含四溴雙酚A的無機鹽培養(yǎng)基中，3(TC下降解，采用液相色譜測定降解率，液相色譜條件為80%甲醇，18%水，2%乙酸，流速為lml/min，四溴雙酚A的檢測波長為210nm。在四溴雙酚A不同初始濃度時降解84h后測定降解率，結果如表1所示表1不同初始濃度的四溴雙酚A的降解率5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從表l中可以看出，本發(fā)明篩選得到蒼白桿菌T對四溴雙酚A的降解能力強，最高可達96.2%。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING〈110〉中國科學院廣州地球化學研究所〈120>—種具有降解四溴雙酚A能力的蒼白桿菌及其應用〈130>1〈160>1〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>1432〈212>DNA〈213>蒼白桿菌(Ochrobact進sp.)〈400〉1tggagccgtgtcgacagcctaccatgcagtcgagcgcgtagc朋tecgagcggc卿cgg60gtgElgt朋CgcgtgggaatctecccatcacCtC3ggg朋3cttgtgctaa120taccctatacg3CCg卿ggtg朋3gatttatcggtgatggatgagcccgcgttggatte180gctagttggtggggte朋ggcctaccaaggcgacgatccatagctggtctg卿gg3tg3240tcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacggg￡lggC￡lgC￡lgtgggg朋te300ttggac朋tgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtg￡lgtg￡ltg￡l￡lggccctagggt360tgtaaagctctttcaccggtgaagateatgacggteaccgg3g朋g朋gCcccggctaac420ttcgtgccagcagccgcggt朋tecg朋gggggctegcgttgttcggatttactgggcgt4803朋gCgC3Cgteggcgggct朋t朋gtC3ggggtg朋EltCccggggctcaaccccggaac540tgccttt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